Abstract
Capillaroscopie est une méthode non-invasive, efficace, relativement peu coûteux et facile à apprendre pour visualiser directement la microcirculation. La technique de capillaroscopie peut donner un aperçu de microvasculaire la santé d'un patient, conduisant à une variété de dermatologique potentiellement précieux, ophtalmologique, les applications cliniques rhumatologiques et cardiovasculaires. En outre, la croissance tumorale peut être dépendante de l'angiogenèse, qui peut être quantifiée par la mesure de la densité des microvaisseaux dans la tumeur. Cependant, il est actuellement peu ou pas de standardisation des techniques, et une seule publication à ce jour signale la fiabilité d'un algorithmes actuellement disponibles, complexes basés ordinateur pour quantifier des données de capillaroscopie. 1 Ce document décrit un nouveau, plus simple, fiable, capillaire standardisé comptage algorithme pour quantifier les données de capillaroscopie périunguéale. Un algorithme simple, reproductible informatisée capillaroscopie comme cela faciliterait plusutilisation généralisée de la technique entre les chercheurs et les cliniciens. De nombreux chercheurs analysent actuellement les images capillaroscopie à la main, la promotion de la fatigue de l'utilisateur et de la subjectivité des résultats. Ce document décrit un roman, facile à utiliser automatisé algorithme de traitement d'image en plus, un algorithme de comptage semi-automatisé reproductible. Cet algorithme permet l'analyse d'images en quelques minutes tout en réduisant la subjectivité; seulement une quantité minimale de temps de formation (dans notre expérience, moins de 1 h) est nécessaire pour apprendre la technique.
Introduction
Imagerie microvasculaire est un domaine en pleine expansion avec de nombreuses applications cliniques potentielles. 2 Par exemple, les oncologues utilisent l'imagerie des microvaisseaux pour déterminer l'étendue de l'angiogenèse tumorale, ce qui donne de précieuses informations concernant l'état de la tumeur et la perspicacité dans les options de traitement possibles. 3 4 Cependant, périunguéale capillaroscopie est peut-être le coût forme la plus efficace et largement applicable de l'imagerie microvasculaire. Les chercheurs utilisent la vidéo périunguéale capillaroscopie pour étudier les débits sanguins et d'enquêter sur la morphologie capillaire. 5 6 fois la vidéo et les images fixes, capillaroscopie périunguéale sont adjoints aux soins pour le diagnostic et le traitement des maladies du tissu conjonctif phénomène et divers de Raynaud comme la sclérose systémique. 2
Capillaroscopie périunguéale a diverses applications cardiovasculaires potentiels ainsi. La recherche actuelle en utilisant périunguéale capillaroscopie suggèreque diabète sucré de type 1 et de type 2 patients présentent une prévalence élevée de la morphologie capillaire anormale, mais ont des densités capillaires inchangé par rapport aux personnes non-diabétiques. 7-8 capillaroscopie a également été étudié expérimentalement dans l'hypertension. Structurelle raréfaction capillaire conduisant à une densité capillaire réduite a été démontrée chez les personnes hypertendues par rapport aux individus non-hypertendus. 9-10 Contrairement à ces patients hypertendus âgés (âge moyen 40 ans et plus) qui présentent la raréfaction structurelle, des recherches plus récentes ont démontré que patients hypertendus plus jeunes (moyenne âge de moins de 40 ans) ont raréfaction fonctionnel sans raréfaction structurelle. 11 Ceci suggère que la raréfaction fonctionnelle se produit avant et peut évoluer au fil du temps à la raréfaction structurelle.
Fait intéressant, les patients hypertendus traités avec des médicaments antihypertenseurs spécifiques tels que perindopril / indapamide affiché normedensité al capillaire et la fonction endothéliale après le traitement, tandis que ceux traités avec ACE (angiotensin l'enzyme de conversion) des inhibiteurs ou des diurétiques maintenu une densité capillaire faible malgré le contrôle de la pression artérielle comparable. 12 Ceci suggère que certains médicaments anti-hypertenseurs peuvent normaliser la densité capillaire en inversant le tube capillaire raréfaction provoquée par l'hypertension. En outre, d'autres chercheurs ont montré que la réduction de la consommation de sel conduit à l'inversion de deux raréfaction capillaire fonctionnelle et structurale chez les personnes hypertendues 13.
Malgré les diverses applications cliniques potentielles de cette technologie, il ya peu de standardisation de la technique pour quantifier images de densité capillaire. 2 A ce jour, les chercheurs ont constaté que les résultats de la densité capillaire sont reproductibles à la fois intra-observateur et inter-observateur perspective que si l'exacte même zone est compté à chaque fois. 15 1,14 9 16 17 18 qui est un processus lent et subjective.
, Sur la base des algorithmes informatiques standardisés pour la quantification des images capillaires offrent théoriquement analyse de données plus efficace et reproductible avec moins de subjectivité, de faciliter les applications cliniques de capillaroscopie. Certains chercheurs ont en effet utilisé des programmes informatiques pour quantifier les données de périunguéale photos capillaroscopiques. 1,6 19 20 Toutefois, une seule publication à ce jour décrit la fiabilité d'un logiciel complexe disponibles pour quantifier les données de capillaroscopie, 1 et ce programme est compliqué comme précédemment noté ci-dessus par l'obligation de compter le même champ visuel exacte. Ici, nous présentons, un protocole simple fiables pour quantifier capillaires en utilisant un algorithme standardisé qui permet del'utilisation de plusieurs champs visuels. L'utilisation de plusieurs champs visuels non seulement simplifie la procédure, mais permet également à l'évaluation de la variation biologique normale du nombre de capillaires.
Le but de cette étude est de décrire un algorithme basé sur ordinateur reproductible et efficace qui normalise le processus de quantification capillaire. Bien que ces méthodes ne sont pas entièrement automatisés, ils nécessitent très peu d'entrée de l'utilisateur, et fournissent une quantification fiable et rapide des photos.
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Protocol
Remarque: Le processus d'acquisition pour obtenir des images capillaires a déjà été publié et est réalisée en utilisant un appareil photo numérique avec un programme informatique d'acquisition et d'analyse d'image correspondante 11 21 Ce laboratoire utilise des images fixes pour l'analyse, pas les vidéos, ce qui simplifie l'acquisition d'image pour l'analyse.. Ce qui suit décrit la nouvelle technique pour quantifier les capillaires à partir des images.
1. Amélioration de l'image processus
- Obtenir des images numériques avec un appareil photo numérique monochrome. Calibrer les images à un objet de taille connue en prenant une photo d'un objet de longueur connue comme une règle avec l'appareil photo. Ce processus permet au programme d'ordinateur pour mesurer et compter capillaires précision après traitement. Idéalement pour la plus haute précision, un réticule (pièce scientifiquement fabriqué en verre avec une règle gravée en elle) devrait être utilisé. Mesurer le nombre de pixels dans un carré de 1 mmboîte à l'aide d'un programme informatique.
Remarque: La clé de la reproductibilité et de la normalisation de ce protocole dépend largement de placement correct de la boîte de 1 mm 2 qui est compté. - Utilisez des outils d'amélioration de contraste pour assombrir les capillaires et éclaircir le fond, ce qui permettra de maximiser la visualisation des capillaires. Différenciation initiale de capillaires de fond est important pour le bon recadrage de l'image dans les étapes ultérieures. Pour ce faire, réglage de l'image en utilisant un Pour ce faire, cliquez sur "meilleure histogramme ajustement.": La capture, de l'intensité, histogramme de l'image, meilleur ajustement.
- Cadrer une région d'intérêt (ROI) pour capillaire comptage comme une nouvelle image (sélectionner, régions d'intérêt). Utilisez une boîte de 1 mm 2, qui a été déterminé par l'étalonnage des images à 530 pixels équivalant à 1 mm. vérifier que l'image recadrée place au sommet des boucles capillaires tout en haut de l'image.
- Aplatir l'image de sorte que tous les futurs ajustements d'image seront appliqués uniformémentl'image. Pour ce faire, cliquez sur: onglet processus, filtres 2D, aplatir, l'intensité de BG "brillant", la largeur de l'objet à "75," applique.
- Augmenter le contraste de l'image afin capillaires sont visualisés au maximum. Pour ce faire, cliquez sur: ajuster onglet, affichage, augmenter le contraste à 75.
- Dépoussiérer l'image pour lisser les bords des capillaires en cliquant sur l'onglet processus, filtres 2D, déparasitage, la taille du noyau 7 x 7, appliquer.
- Finaliser le contraste de l'image afin capillaires sont le noir et le fond est blanc. Effectuez cette étape en ajustant l'histogramme pour le modèle "meilleur ajustement".
Note: S'il vous plaît se référer à la figure 2 en résultats représentatifs pour un exemple de ce que l'image traitée devrait ressembler suivant ces étapes.
2. Exécution comtes capillaires / quantification capillaire Densité
- Sur chaque image, sélectionner manuellement une partie d'un capillaire bien définie en utilisant la featur "objet cible"e d'être reconnu comme objets à compter par le programme. Ensuite, sélectionnez une petite partie du fond, en utilisant la fonction «de fond», comme une référence à des zones qui doivent être ignorés par l'algorithme de comptage.
Remarque: La combinaison de ces faits saillants provoque tous les capillaires à être mis en évidence en faisant abstraction du bruit de fond. La quantification (comptage) protocole utilise les fonctions informatiques de différencier parties de l'image basée sur la couleur et la morphologie. - Utilisez la fonction de comptage pour compter instantanément tous les capillaires dans l'image avec l'équipement d'imagerie. Réglez le diamètre minimum d'objets comptés à 5 pixels afin d'éviter de compter le bruit de fond que les capillaires.
- Pour chaque individu, compter le moyenne de 3 - 4 images afin d'obtenir une évaluation plus fiable.
Note: S'il vous plaît se référer à la figure 3 dans Les résultats représentatifs pour un exemple de ce que l'image devrait ressembler au cours de la procédure de comptage. 3. Création et utilisation de macros pour automatiser le traitement de l'image - Afin de créer une macro, sélectionnez "Enregistrer une macro" et sur une image effectuent les étapes et les processus désirés, comme décrit dans les étapes 1 et 2 ci-dessus. Nom de la macro sur la base duquel le traitement d'image étapes ont été réalisées pour référence future. Lorsque using la macro sur les images futures, cliquez simplement sur "macro run" et le programme va appliquer automatiquement les améliorations enregistrées à l'image (s) souhaitée.
Note: Ce laboratoire utilise une macro pour effectuer tous, mais l'une des étapes de la Section 1 des méthodes en quelques secondes. La seule étape qui nécessite une entrée de l'utilisateur est de choisir où pour recadrer l'image, l'étape 1.2.
Remarque: Pour gagner du temps, les macros peuvent être créées afin d'effectuer automatiquement une séquence spécifique des processus sur une ou plusieurs images. Ces séquences peuvent être personnalisés afin de rendre les modifications de l'image rapide. En substance, ces macros se rappeler comment les images sont traitées, et d'effectuer toutes les étapes rapidement et sans intervention de l'utilisateur. Performing compte sur 12 images capillaires prend ce laboratoire entre 20 à 30 min avec les macros (2 à 3 min par image), par opposition à environ 8 min par image sans les macros. Par conséquent en utilisant les macros est de 3 à 5 fois plus efficace que le traitement manuellement chaque image individuelle.
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Representative Results
L'objectif de cette procédure de traitement d'image est de différencier les capillaires de l'image d'arrière-plan de sorte qu'ils peuvent être quantifiés avec précision. Tant de traitement d'image incomplète et traitement d'image excessive nuisent à la capacité du programme à quantifier les capillaires. Comme on le voit sur la figure 3, le traitement d'image effectue les capillaires incomplet difficile à distinguer de l'arrière-plan. Il est essentiel que l'utilisateur soit capable de distinguer facilement la frontière d'un capillaire depuis la méthode de comptage décrit ci-dessus dépend de la capacité de l'utilisateur à mettre en évidence quelques capillaires avec précision. D'autre part, comme on le voit sur la figure 3, l'application des mesures inutiles de traitement d'image peut conduire à brouiller des capillaires et par conséquent peuvent également être préjudiciables au processus de quantification.
Une image optimale traité peut être compté dans les 30 secondes et distingue capillaires de fond aussi clairementainsi que les capillaires individuels les uns des autres. Un exemple d'une image traitée est vu sur la figure 2, partie D, avec l'image compté montre la figure 3.
La densité capillaire varie en fonction de l'emplacement de la nailbed étant compté. Le tableau 1 montre que la densité capillaire augmente avec la distance à partir de la rangée supérieure des capillaires au nailbed. Normalisation du placement de ROI est essentiel de compter reproductibilité. Figure 1 montre comment les images peuvent être modifiées avec différents stages de ROI.
| ID | T1 | T2 | T3 | T4 | Moyenne Top | M1 | M2 | M3 | M4 | Moyenne Moyen | L1 | L2 | L3 | L4 | Le plus bas |
| Un patient | |||||||||||||||
| Baseline | 46 | 45 | 44 | 46 | 45.25 | 64 | 62 | 62 | 62 | 62,5 | 66 | 67 | 66 | 66 | 66.25 |
| Occlusion veineuse | 51 | 53 | 49 | 59 | 53 | 59 | 61 | 64 | 69 | 63.25 | 70 | 70 | 75 | 72 | 71.75 |
| Patient B | |||||||||||||||
| Baseline | 47 | 51 | 48 | 51 | 49.25 | 73 | 74 | 75 | 81 | 75.75 | 76 | 85 | 81 | 80 | 80,5 |
| Occlusion veineuse | 68 | 57 | 65 | 64 | 63,5 | 75 | 78 | 76 | 72 | 75.25 | 91 | 89 | 93 | 83 | 89 |
| Patient C | |||||||||||||||
| Baseline | 51 | 54 | 51 | 56 | 53 | 66 | 59 | 58 | 60 | 60.75 | 60 | 61 | 62 | 69 | 63 |
| Occlusion veineuse | 62 | 66 | 57 | 59 | 61 | 63 | 63 | 73 | 65 | 66 | 83 | 74 | 81 | 77 | 78.75 |
. Tableau 1: Variation capillaire compte avec différentiel de positionnement dans le lit Ongle Ce tableau présente les chiffres obtenus pour trois patients différents (A, B, C) lorsque la boîte de ROI est variable positionné au sommet (compte T1 - T4), milieu (M1 - M4), et les régions inférieures (L1 - L4) du lit de l'ongle. Les chiffres moyens augmentent à partir du haut pour abaisser les régions, démontrant la nécessité d'une normalisation du placement de boîte de ROI de comparer les chiffres obtenus à partir de différents laboratoires.
Exécution chiffres dans la zone décrite à l'étape 1.2, les chiffres de référence devraient varier de 30 à 60 capillaires / mm 2, tandis que les chiffres d'occlusion veineuse peut varier de 50 à 100. Comme on le voit dans le tableau 1, ci densities diffèrent des autres littératures. Chiffres de la densité capillaire obtenus dans le laboratoire des auteurs sont probablement plus faible parce que ce laboratoire commence chiffres à la première rangée de capillaires, où la densité est la plus faible. Comme on le voit dans le tableau 1, les chiffres de la scène dans les régions inférieures de la nailbed augmentent les chiffres vers des valeurs obtenues précédemment par Antonios et al 9 et Debbabi et al. 16 Cet écart illustre la nécessité de la normalisation dans la quantification des nailbed capillaroscopie en comptant le premier (le plus proximale) rangée de capillaires. Compter à la première rangée de capillaires est également optimale parce que les capillaires sont les plus clairement et complètement visualisées dans la première rangée et progressivement deviennent moins visibles avec les lignes suivantes.
Études de reproductibilité aveugle à l'aide n = 10 sujets et deux observateurs indépendants ont été menées. Résultats de fiabilité se réfèrent aux comptes moyens A, B, et C, obtenu par AV eraging résultats à travers 4 images pour chaque. Les chiffres A, B et C représentent différents états physiologiques au sein de la même personne qui sont utilisés pour évaluer la santé microvasculaire, brièvement résumées ici. Les détails ont déjà été publiés 21. Densité capillaire est défini comme le nombre de capillaires par millimètre carré (2 mm) de la peau doigt périunguéale. Stade A est une étape de repos de base où les capillaires sont continuellement perfusées 16. Stade B se produit pendant hyperémie réactive postocclusive. Ces chiffres représentent la somme des perfusée en continu et par intermittence perfusés (réserve fonctionnelle) capillaires. Cette étape est utilisée en tant que mesure de la fonction de 16 capillaire.
Stade C se produit pendant occlusion veineuse, montrant ainsi la densité capillaire maximale incluant à la fois perfusé (avec des globules rouges actifs (RBC) mouvement) et non perfusée (remplis de stagnation, les globules rouges non-mobiles) capillaires. 22
ontenu "> Pour une fiabilité intra-évaluateur, les corrélations intraclasse (ICC) étaient de 0,93 pour signifier un compte, 0,93 pour la moyenne des comptages B, et 0,94 pour la moyenne C compte. Pour une fiabilité inter-évaluateur, les CCI étaient de 0,94 pour signifier un chefs d'accusation, 0,98 pour la moyenne des comptages B, et 0,94 pour la moyenne C compte. Par conséquent, la technique décrite ici démontre une excellente fiabilité avec de bons résultats à la fois pour l'intérieur et de reproductibilité inter-observateur.
Figure 1. La normalisation du Lieu de la culture. Cette figure illustre comment le placement variable de la boîte de ROI modifie visiblement l'image recadrée. Sur la gauche, la boîte est placée trop bas, coupant la première rangée de capillaires. La boîte du milieu est placé trop haut, provoquant un espace vide au-dessus de la première rangée de capillaires. La case de droite est placé de manière optimale. Son image recadrée montre la première rangée de capillaries tout en haut de l'image. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Les étapes de traitement d'image (A) Stade A montre l'image initiale tirée du lit unguéal du sujet avec un appareil photo monochrome;. (B) Stade B montre l'image d'origine après la première augmentation du contraste. La boîte verte indique une boîte de 530 x 530 pixels, ce qui est équivalent à 1 x 1 boîte de mm pour la caméra; (C) Stade C représente la boîte de 1 mm détourée de l'image B; (D) Stade D montre l'image améliorée après l'application les améliorations décrites ci-dessus. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 
Figure 3. Finale Image compté. Le, d'image améliorée compté. Le nombre total déterminé pour cette image était de 54 capillaires / mm 2. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Traitement d'image incorrecte. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La photo de gauche montre une photo qui ne sont pas traitées assez. Les capillaires sont difficiles à distinguer de l'arrière-plan et le processus de quantification seront affec négativementTed. La photo de droite montre la même image après le traitement d'image incorrecte. Capillaires individuels sont difficiles à distinguer de leurs voisins et ainsi le processus de quantification sera affectée négativement.
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Discussion
Capillaroscopie périunguéale montre promesse comme un outil clinique utile à l'avenir pour diverses oncologie, cardiovasculaire, et les applications de maladies rhumatologiques. Le processus d'acquisition d'image est assez uniforme entre les chercheurs, mais il ya actuellement plusieurs méthodes pour le traitement et l'analyse d'images. Méthodes comprennent actuellement comptages manuels et informatisés capillaires. Des comptages manuels sont problématiques car ils prennent du temps, et sous réserve de la subjectivité de l'utilisateur et de la fatigue. Les méthodes basées sur l'ordinateur actuel exigent un niveau élevé de l'entrée de l'utilisateur, à la fois dans le processus d'amélioration de l'image et le processus de quantification. La nouvelle méthode décrite ici nécessite relativement peu de formation de l'utilisateur ou de la participation, que les mesures d'amélioration d'image sont entièrement automatisés. Entrée de l'utilisateur est requise uniquement pour le processus de comptage d'abord de distinguer capillaire de fond dans les images traitées. Utilisation des macros automatiques comme décrit ici est trois à cinq fois plus efficace que manutraitement allié chaque image.
Algorithmes basés informatiques standardisées fiables pour quantifier des données de capillaroscopie font défaut.
Méthodes basées informatiques fiables normalisées sont nécessaires pour capillaire quantification afin de réduire la subjectivité et de promouvoir l'efficacité. La technique décrite ici démontre une excellente fiabilité avec de bons résultats à la fois pour l'intérieur et de reproductibilité inter-observateur avec des corrélations intraclasse de 0,93 à 0,98. Nous avons précédemment rapporté la corrélation des résultats obtenus par l'intermédiaire informatisée évaluation de la densité capillaire, par rapport à la norme de comptage manuel d'or. 21 corrélations de Pearson entre la ligne de base, post-ischémique, et le nombre de congestion veineuse réalisés avec le logiciel et comptages manuels correspondants dans 10 sujets ont été 0,78, 0,78, et 0,71 respectivement (p <0,05), indiquant une concordance raisonnable entre les deux méthodes.
L'image de ce laboratoireétapes de manipulation utilisent un certain nombre d'outils de traitement de l'ordinateur. Etape 1.3, l'image «aplatissement», supprime les différentes «couches» qui sont présents dans chaque image. Cela doit être fait en premier pour toutes les futures procédures de traitement d'image sera appliquée uniformément à toutes les parties de l'image. Le réglage du contraste à la fois assombrit les capillaires et pâlit à l'arrière-plan, rendant ainsi les capillaires plus visible. Le processus de «Dépoussiérer" lisser les bords des capillaires tout en conservant leur taille et la forme. Bien qu'il semble y avoir aucune différence dans une image despeckled à l'œil nu, cela est un processus important pour aider à assurer de multiples capillaires ne se mélangent pas ensemble pendant le processus de comptage. Finalisation de l'image en utilisant un «meilleur histogramme ajustement" exclut tous les pixels aux deux extrêmes de l'histogramme. Cela permet de définir les frontières des capillaires, tout en améliorant encore davantage le contraste entre les capillaires et l'arrière-plan. Globalement, il yatrois étapes d'amélioration de contraste, et tous les trois sont nécessaires pour maximiser la clarté de l'image finale pour capillaire comptage.
Parfois, le programme comptera trop ou trop peu de capillaires. La première étape pour résoudre ce problème est d'annuler la mise en évidence et simplement essayer le processus de mise en valeur à nouveau. Si les capillaires sont mis en évidence de façon incorrecte, régler le diamètre capillaire minimum peut être nécessaire. Les auteurs recommandent un diamètre minimum de défaut de 5 pixels. Si le programme est trop de compte en comptant les capillaires ou une capillaire sous forme de plusieurs capillaires, l'utilisateur doit augmenter le diamètre minimum d'un ou deux pixels. D'un autre côté, si le programme est sans compter groupes de pixels sombres qui sont des capillaires, l'utilisateur peut réduire le diamètre minimum d'un pixel.
Il est également nécessaire de normaliser la position de ces chiffres dans le lit unguéal. Comme on le voit dans le tableau, qui compte dans le même individu sont trèsdépendante position varier considérablement en fonction de quelle partie du lit de l'ongle est compté.
Les étapes critiques du protocole incluent la visualisation correcte et optimale des capillaires. Les étapes permettant une visualisation optimale des capillaires dans ce protocole sont entièrement automatisées, permettant la manipulation d'image rapide et précise. Bien que ces méthodes représentent une avancée majeure dans la fiabilité et la facilité de traitement et de comptage d'image capillaroscopique, la principale limite de cette technique est le processus de semi-automatisé de comptage. Idéalement, un processus entièrement automatisé sera créé dans un proche avenir. Les chercheurs devraient se sentir encouragés à construire sur la méthodologie décrite dans le présent document dans le but de développer une technologie cliniquement utiles entièrement automatisé qui permet la quantification rapide de la densité capillaire périunguéale d'un patient.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Image-Pro Premier | Media Cybernetics, Inc | 9.1 | Image processing software |
References
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