Abstract
Capilaroscopia es una metodología no invasiva, eficiente, relativamente barato y fácil de aprender para visualizar directamente la microcirculación. La técnica capilaroscopia puede proporcionar información sobre la salud de un paciente microvascular, lo que lleva a una variedad de dermatológica potencialmente valiosa, oftalmológica, aplicaciones clínicas reumatológicas y cardiovasculares. Además, el crecimiento del tumor puede ser dependiente de la angiogénesis, que puede ser cuantificó midiendo la densidad de microvasos dentro del tumor. Sin embargo, en la actualidad existe poca o ninguna estandarización de las técnicas, y sólo una publicación a la fecha reporta la fiabilidad de unas actualmente disponibles algoritmos basados ordenador y complejas para cuantificar los datos capilaroscopia. 1 En este trabajo se describe un nuevo, más simple,, algoritmo fiable recuento capilar estandarizado para cuantificar los datos capilaroscopia nailfold. Un algoritmo capilaroscopia computarizada simple, reproducible como esto facilitaría másuso generalizado de la técnica entre los investigadores y los clínicos. Muchos investigadores analizan actualmente imágenes capilaroscopia a mano, la promoción de la fatiga del usuario y de la subjetividad de los resultados. Este documento describe un nuevo, fácil de uso automatizado algoritmo de procesamiento de imágenes, además de un algoritmo de conteo semi-automatizado reproducible. Este algoritmo permite el análisis de las imágenes en cuestión de minutos, mientras que la reducción de la subjetividad; sólo una cantidad mínima de tiempo de entrenamiento (en nuestra experiencia, a menos de 1 hora) es necesario para aprender la técnica.
Introduction
Formación de imágenes microvascular es un campo en rápido crecimiento con muchas aplicaciones clínicas potenciales. 2 Por ejemplo, los oncólogos están utilizando formación de imágenes de los microvasos para determinar la extensión de la angiogénesis tumoral, produciendo una valiosa información sobre el estado del tumor y una visión de posibles opciones de tratamiento. 3 4 Sin embargo, capilaroscopia lecho ungueal es quizás la forma eficiente y ampliamente aplicable costo mayor parte de las imágenes microvascular. Los investigadores están utilizando el vídeo lecho ungueal capilaroscopia para estudiar las tasas de flujo de sangre e investigar la morfología capilar. 5 6 Tanto vídeo y de imágenes fijas lecho ungueal capilaroscopia están adjuntos a la atención para diagnosticar y tratar fenómeno y varias enfermedades del tejido conectivo de Raynaud, como la esclerosis sistémica. 2
Capilaroscopia periungueal tiene diversas aplicaciones cardiovasculares potenciales. La investigación actual sugiere usar lecho ungueal capilaroscopiaEse tipo diabetes mellitus 1 y Tipo 2 pacientes presentan una alta prevalencia de la morfología capilar anormal, sin embargo, tienen densidades capilares sin cambios en comparación con los individuos no diabéticos. 8.7 capilaroscopia también se ha estudiado experimentalmente en la hipertensión. Estructural rarefacción capilar que conduce a una reducción de la densidad capilar se ha demostrado en individuos hipertensos en comparación con los individuos no hipertensos. 9-10 En contraste con estos pacientes hipertensos de edad avanzada que presentan rarefacción estructurales, la investigación más reciente ha demostrado que (edad 40 y por encima de la media) pacientes hipertensos más jóvenes (media de edad menores de 40 años) tienen rarefacción funcional sin rarefacción estructural. 11 Esto sugiere que la rarefacción funcional se produce antes y puede progresar con el tiempo para rarefacción estructural.
Curiosamente, los pacientes hipertensos tratados con fármacos antihipertensivos específicos como perindopril / indapamida representada normaAl densidad capilar y la función endotelial después del tratamiento, mientras que los tratados con ACE (Inhibidores de la enzima convertidora de) inhibidores o diuréticos mantiene una baja densidad capilar a pesar del control de la presión arterial comparable. 12 Esto sugiere que algunos medicamentos antihipertensivos pueden normalizar la densidad capilar invirtiendo el capilar rarefacción causado por la hipertensión. Además, otros investigadores han demostrado que una reducción en la ingesta de sal conduce a la reversión de tanto rarefacción capilar funcional y estructural en individuos hipertensos. 13
A pesar de las diversas aplicaciones clínicas potenciales de esta tecnología, hay poca estandarización de la técnica para la cuantificación de las imágenes de densidad capilar. 2 Hasta la fecha, los investigadores han encontrado que los resultados de densidad capilar son reproducibles, tanto desde el intra-observador y la perspectiva inter-observador sólo si la exacta misma área está siendo contado cada vez. 1,14 15 9 16 17 18, que es un proceso lento y subjetiva.
Algoritmos estandarizados, basados informáticos para la cuantificación de las imágenes capilares teóricamente proporcionan un análisis de datos más eficiente y reproducible con menos subjetividad, lo que facilita las aplicaciones clínicas de capilaroscopia. Algunos investigadores han utilizado efectivamente los programas basados en computadoras para cuantificar los datos de nailfold imágenes capilaroscópicos. 1,6 19 20 Sin embargo, sólo una publicación a la fecha describe fiabilidad de un programa de software complejo disponibles para cuantificar los datos capilaroscopia, 1 y este programa es complicado como anteriormente se ha indicado anteriormente por el requisito de contar el mismo campo visual exacto. A continuación, presentamos un protocolo sencillo y fiable para cuantificar los capilares utilizando un algoritmo estandarizado que permiteel uso de múltiples campos visuales. El uso de múltiples campos visuales no sólo simplifica el procedimiento, sino que también permite la evaluación de la variación biológica normal en el recuento capilar.
El objetivo de este estudio es describir un algoritmo computarizado reproducible y eficiente, que estandariza el proceso de cuantificación capilar. Si bien estos métodos no están completamente automatizados que requieren muy poca intervención del usuario, y proporcionan la cuantificación rápida y fiable de las imágenes.
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Protocol
Nota: El proceso de adquisición para la obtención de imágenes capilares ya ha sido publicado y se logra utilizando una cámara fotográfica digital con un programa informático de adquisición y análisis de imágenes correspondiente 11 21 Esta práctica de laboratorio utiliza imágenes fijas para el análisis, no vídeos, lo que simplifica la adquisición de imágenes para el análisis.. A continuación se describe la nueva técnica para cuantificar los capilares a partir de las imágenes.
1. Mejora de la imagen de proceso
- Obtener imágenes digitales con una cámara digital monocromo. Calibrar las imágenes a un objeto de tamaño conocido por tomar una foto de un objeto de longitud conocida como una regla con la cámara. Este proceso permite que el programa informático para medir y contar capilares con precisión después del procesamiento. Lo ideal para la más alta precisión, se debe utilizar una retícula (pieza científicamente fabricado de vidrio con una regla grabada en ella). Medir el número de píxeles en un cuadrado de 1 mmcaja usando un programa informático.
Nota: La clave para la reproducibilidad y la normalización de este protocolo depende en gran medida de la correcta colocación de la caja 1 mm 2 que se cuenta. - Utilice herramientas de mejora de contraste para oscurecer los capilares y aclarar el fondo, lo que maximizará la visualización de los capilares. La diferenciación inicial de los capilares de fondo es importante para el cultivo adecuado de la imagen en pasos posteriores. Para ello, el ajuste de la imagen mediante un Para ello haga clic en "mejor histograma en forma.": La captura, la intensidad, la imagen de histograma, mejor ajuste.
- Recortar una región de interés (ROI) para el recuento capilar como una nueva imagen (seleccionar, regiones de interés). Utilice una caja de 1 mm 2, que se determinó mediante la calibración de las imágenes a 530 píxeles igualando 1 mm. compruebe que la imagen recortada coloca el ápice de las asas capilares en la parte superior de la imagen.
- Aplanar la imagen para que todos los ajustes de imagen futuras se aplicarán uniformemente ala imagen. Para ello, haga clic en: Ficha proceso, filtros 2D, aplanar, intensidad BG de "brillante" object width a "75", se aplica.
- El contraste de la imagen para los capilares se visualizan al máximo. Para ello, haga clic en: ficha, pantalla ajustar, aumentar contraste con 75.
- Eliminar manchas en la imagen para suavizar los bordes de los capilares haciendo clic en la pestaña de procesos, filtros 2D, despeckle, el tamaño del núcleo 7 x 7, aplique.
- Finalizar el contraste de la imagen de modo capilares son de color negro y el fondo es blanco. Realice este paso ajustando el histograma para el modelo de "mejor ajuste".
Nota: Por favor consulte la Figura 2 en resultados representativos para un ejemplo de lo que la imagen procesada debe ser similar siguiendo estos pasos.
2. Realizar Condes capilares / cuantificar capilar Densidad
- En cada imagen, seleccionar manualmente una parte de un capilar bien definida mediante el featur "objeto destino"e para ser reconocido como objetos a ser contados por el programa. A continuación, seleccione una pequeña parte del fondo, utilizando la función de "fondo", como referencia a las áreas que necesitan ser ignorado por el algoritmo de recuento.
Nota: La combinación de estos destacados provoca todos los capilares a destacar sin tener en cuenta el ruido de fondo. El protocolo de cuantificación (contando) utiliza las funciones del ordenador para diferenciar partes de la imagen basada en el color y la morfología. - Utilice la función de recuento para contar al instante todos los capilares en la imagen con el equipo de imagen. Ajuste el diámetro mínimo de los objetos contados a 5 píxeles con el fin de evitar contar el ruido de fondo como capilares.
- Para cada individuo, contar el promedio de 3 - 4 imágenes con el fin de obtener una evaluación más fiable.
Nota: Por favor consulte la Figura 3 en resultados representativos para un ejemplo de lo que la imagen debe ser similar durante el procedimiento de recuento. 3. Creación y uso de macros para automatizar Procesamiento de Imágenes - Con el fin de crear una macro, seleccione "Grabar macro" y en una imagen de realizar los pasos y procesos deseados, como se describe en los pasos 1 y 2 anteriores. Nombre de la macro a partir del cual la imagen pasos de procesamiento se realizaron para referencia futura. Cuando using la macro en futuras imágenes, simplemente haga clic en "macro run" y el programa se aplicará automáticamente las mejoras registradas a la imagen (s) deseada.
Nota: Este laboratorio utiliza una macro para realizar todos menos uno de los pasos en la Sección 1 de los métodos en unos segundos. El único paso que requiere la entrada del usuario es la elección de dónde recortar la imagen, paso 1.2.
Nota: Para ahorrar tiempo, las macros se pueden crear con el fin de realizar automáticamente una secuencia específica de los procesos en una o varias imágenes. Estas secuencias pueden ser personalizados con el fin de hacer las modificaciones de imagen más rápida. En esencia, estas macros recuerdan cómo se procesan las imágenes, y llevar a cabo todos los pasos de forma rápida y sin intervención del usuario. Realización de los recuentos en 12 imágenes capilares toma este laboratorio entre 20 a 30 min con las macros (2 a 3 min por imagen), en oposición a aproximadamente 8 min por imagen sin los macros. Por lo tanto el uso de las macros es de 3 a 5 veces más eficiente que el procesamiento manualmente cada imagen individual.
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Representative Results
El objetivo de este procedimiento de procesamiento de imágenes es diferenciar los capilares a partir de la imagen de fondo para que puedan ser cuantificados con precisión. Tanto el procesamiento de imágenes y procesamiento de imágenes incompleta excesiva son perjudiciales para la capacidad del programa para cuantificar los capilares. Como se ve en la Figura 3, el procesamiento de imágenes hace que los capilares incompleta difícil de distinguir del fondo. Es crítico que el usuario sea capaz de distinguir fácilmente la frontera de un capilar ya que el método de recuento descrito anteriormente depende de la capacidad del usuario para resaltar con precisión unos capilares. Por otra parte, como se ve en la Figura 3, la aplicación de los pasos de procesamiento de imágenes innecesarias puede conducir a la difuminación de los capilares y por lo tanto también puede ser perjudicial para el proceso de cuantificación.
Una imagen óptima procesado se puede contar dentro de los 30 segundos y claramente distingue capilares de fondo comoasí como los capilares individuales entre sí. Un ejemplo de una imagen procesada se ve en la Figura 2 la parte D, con la imagen contado muestra en la Figura 3.
La densidad capilar varía en función de la ubicación del lecho ungueal ser contados. La Tabla 1 muestra que los aumentos de la densidad capilar con la distancia desde la fila superior de los capilares en el lecho ungueal. Normalización de la colocación ROI es crucial para contar reproducibilidad. La Figura 1 muestra cómo las imágenes pueden alterarse con diferentes colocaciones de ROI.
| Identificación | T1 | T2 | T3 | T4 | La media Top | M1 | M2 | M3 | M4 | La media de Oriente | L1 | L2 | L3 | L4 | Menor |
| Paciente A | |||||||||||||||
| Línea de base | 46 | 45 | 44 | 46 | 45.25 | 64 | 62 | 62 | 62 | 62.5 | 66 | 67 | 66 | 66 | 66.25 |
| Oclusión Venosa | 51 | 53 | 49 | 59 | 53 | 59 | 61 | 64 | 69 | 63.25 | 70 | 70 | 75 | 72 | 71.75 |
| Paciente B | |||||||||||||||
| Línea de base | 47 | 51 | 48 | 51 | 49.25 | 73 | 74 | 75 | 81 | 75.75 | 76 | 85 | 81 | 80 | 80.5 |
| Oclusión Venosa | 68 | 57 | sesenta y cinco | 64 | 63.5 | 75 | 78 | 76 | 72 | 75.25 | 91 | 89 | 93 | 83 | 89 |
| Paciente C | |||||||||||||||
| Línea de base | 51 | 54 | 51 | 56 | 53 | 66 | 59 | 58 | 60 | 60.75 | 60 | 61 | 62 | 69 | 63 |
| Oclusión Venosa | 62 | 66 | 57 | 59 | 61 | 63 | 63 | 73 | sesenta y cinco | 66 | 83 | 74 | 81 | 77 | 78.75 |
. Tabla 1: Variación del capilar cuenta con posicionamiento diferencial en el lecho de la uña Esta tabla muestra los recuentos obtenidos para tres pacientes diferentes (A, B, C) cuando la caja de retorno de la inversión se coloca de forma variable en la parte superior (cuenta T1 - T4), medio (M1 - M4), y las regiones inferiores (L1 - L4) de la cama uña. Los recuentos medios aumentan desde la parte superior para bajar las regiones, lo que demuestra la necesidad de estandarización de la colocación cuadro de ROI para comparar los recuentos obtenidos en diferentes laboratorios.
Realización de conteos en la zona descrita en el paso 1.2, los recuentos basales deben oscilar entre 30 y 60 capilares / mm 2, mientras que el recuento de oclusión venosa puede variar desde 50 a 100. Como se ve en la Tabla 1, estos densities difieren de otra literatura. Conteos de densidad capilar obtenidos en el laboratorio de los autores son muy probablemente menor debido a esta práctica comienza el recuento en la primera fila de los capilares, donde la densidad es más bajo. Como se observa en la Tabla 1, que realizan conteos en las regiones inferiores del lecho ungueal aumentan los recuentos hacia valores obtenidos previamente por Antonios et al 9 y Debbabi et al. 16 Esta discrepancia ilustra la necesidad de la normalización en la cuantificación de capilaroscopia lecho ungueal contando el primero (la mayoría proximal) hilera de capilares. Contando en la primera fila de capilares también es óptimo debido a que los capilares son más claramente y completamente visualizados en la primera fila y progresivamente se vuelven menos visible con filas posteriores.
Se realizaron estudios de reproducibilidad Cegado utilizando N = 10 sujetos y dos observadores independientes. Fiabilidad resultados se refieren a los recuentos promedio A, B, y C, obtenida por av un prome- resultados entre 4 imágenes para cada uno. Los recuentos de A, B, y C representan diferentes estados fisiológicos dentro del mismo individuo que se utilizan para evaluar la salud microvascular, brevemente resumido aquí. Los detalles se han publicado previamente 21. La densidad capilar se define como el número de capilares por milímetro cuadrado (mm 2) de la piel lecho ungueal dedo. Etapa A es una etapa de la línea de base en reposo en los capilares son perfundidos continuamente 16. Etapa B se produce durante la hiperemia reactiva postocclusive. Estos recuentos representan la suma de perfundidos continuamente perfundido y de forma intermitente (reserva funcional) capilares. Esta etapa se utiliza como una medida de la función capilar 16.
Etapa C se produce durante la oclusión venosa, por lo tanto, que muestra la densidad capilar máxima incluyendo capilares tanto perfundido (con glóbulos rojos activa (RBC) de movimiento) y nonperfused (llenos de glóbulos rojos, estancadas sin movimiento). 22
ontenido "> Para la fiabilidad intra-evaluador, la correlación intraclase (CCI) fueron 0,93 para significar una condes, 0,93 para los recuentos B medias, y 0,94 para la media de C cuenta. Por confiabilidad entre calificadores, los CCI fueron 0,94 para significar una recuentos, 0,98 para los recuentos B medias, y 0,94 para la media C cuenta. Por consiguiente, la técnica descrita aquí demuestra una excelente fiabilidad con buenos resultados tanto intra y reproducibilidad entre observadores.
Figura 1. La estandarización de Cultivos Ubicación. Esta figura ilustra cómo la colocación variable del cuadro de ROI altera visiblemente la imagen recortada. A la izquierda, la caja se coloca demasiado bajo, el corte de la primera fila de los capilares. El cuadro central se coloca demasiado alto, causando un espacio en blanco por encima de la primera fila de capilares. El cuadro de la derecha se coloca de manera óptima. Su imagen recortada se muestra la primera fila de capillaries en la parte superior de la imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Etapas de Procesamiento de Imágenes (A) Etapa A muestra la imagen inicial tomada de lecho ungueal del sujeto con una cámara monocromática;. (B) Etapa B muestra la imagen original después de la primera mejora del contraste. El cuadro verde muestra una caja de píxeles de 530 x 530, lo que equivale a la caja 1 x 1 mm para la cámara; (C) Etapa C representa el cuadro 1 mm recortada de la imagen B; (D) Etapa D muestra la imagen mejorada después de aplicar las mejoras mencionadas anteriormente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 
Figura 3. Imagen Final de Contado. La imagen contado mejorada. El recuento total determinado para esta imagen era de 54 capilares / mm 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Procesamiento de Imágenes incorrecto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La foto de la izquierda muestra una foto que no se procesa suficiente. Los capilares son difíciles de distinguir del fondo y el proceso de cuantificación serán negativamente affected. La foto de la derecha muestra la misma imagen después de procesamiento de imagen incorrecta. Capilares individuales son difíciles de distinguir de sus vecinos y por lo tanto el proceso de cuantificación se verá afectado negativamente.
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Discussion
Capilaroscopia periungueal se muestra prometedor como una herramienta clínicamente útil en el futuro para diversos oncología, cardiovascular, y las aplicaciones de enfermedades reumatológicas. El proceso de adquisición de imágenes es bastante consistente entre los investigadores, sin embargo, en la actualidad hay varios métodos para el procesamiento de imágenes y análisis. Métodos actualmente incluyen recuentos capilares computarizados y manuales. Conteos manuales son problemáticos, ya que son mucho tiempo, y sujeto a la subjetividad de usuario y la fatiga. Métodos basados informáticos actuales requieren un alto nivel de entrada del usuario, tanto en el proceso de mejora de la imagen y el proceso de cuantificación. El nuevo método aquí descrito requiere relativamente poca capacitación de los usuarios o la participación, ya que las medidas de mejora de imagen son totalmente automatizadas. La entrada del usuario sólo se requiere para el proceso de escrutinio inicialmente para distinguir capilar de fondo en las imágenes procesadas. El uso de las macros automáticas como se describe aquí es de tres a cinco veces más eficiente que manualiado procesar cada imagen individual.
Algoritmos basados informáticos normalizados fiables para cuantifican los datos capilaroscopia faltan.
Se necesitan métodos basados en computadoras estandarizada fiable para la cuantificación capilar con el fin de reducir la subjetividad y promover la eficiencia. La técnica descrita aquí demuestra una excelente fiabilidad con buenos resultados tanto intra y reproducibilidad entre observadores con correlaciones intraclase de 0,93 a 0,98. Hemos informado anteriormente de la correlación de los resultados obtenidos a través de la evaluación informatizada densidad capilar, en comparación con el estándar de oro de conteo manual. 21 correlaciones de Pearson entre la línea de base, post-isquémica, y cuenta con la congestión venosa hecho con el software y los recuentos manuales correspondientes en 10 sujetos fueron 0,78, 0,78 y 0,71, respectivamente (p <0,05), lo que indica un acuerdo razonable entre los dos métodos.
Imagen de este laboratorioetapas de manipulación utilizan un número de herramientas de procesamiento de ordenador. Paso 1.3, imagen de "aplanamiento", elimina las diversas "capas" que están presentes en cada imagen. Esto se debe hacer primero para que todos los futuros procedimientos de procesamiento de imágenes se aplicará de manera uniforme a todas las partes de la imagen. Ajuste de contraste tanto oscurece los capilares y palidece el fondo, por lo tanto haciendo los capilares más visible. El proceso de "Limpiar" suaviza los bordes de los capilares y manteniendo su tamaño y forma. Aunque no parece que existan diferencias en una imagen despeckled a simple vista, este es un proceso importante para ayudar a asegurar múltiples capilares no se mezclan entre sí durante el proceso de escrutinio. Finalización de la imagen utilizando un "mejor ajuste histograma" excluye todos los píxeles en cualquiera de los extremos del histograma. Esto ayuda a definir las fronteras de los capilares al tiempo que mejora aún más el contraste entre los capilares y el fondo. En general existentres pasos de mejora de contraste, y los tres son necesarios para maximizar la claridad de la imagen final para el recuento capilar.
De vez en cuando, el programa contará demasiados o muy pocos capilares. El primer paso para solucionar este problema es deshacer el resaltado y simplemente tratar el proceso de resaltado de nuevo. Si los capilares se están resaltados incorrectamente, ajustando el diámetro del capilar mínima puede ser necesario. Los autores recomiendan un diámetro mínimo predeterminado de 5 píxeles. Si el programa está contando demasiados capilares o contar un capilar como múltiples capilares el usuario debe aumentar el diámetro mínimo por uno o dos píxeles. Por otro lado, si el programa no está contando grupos de píxeles oscuros que son capilares, el usuario puede reducir el diámetro mínimo en un píxel.
También hay una necesidad de estandarizar la posición de estos conteos en el lecho ungueal. Como se observa en la tabla, que cuenta en el mismo individuo son altamentedependiente de la posición, que varía basado en gran medida en la que se contó parte del lecho ungueal.
Los pasos críticos del protocolo incluyen la visualización adecuada y óptima de los capilares. Los pasos que permiten la visualización óptima de los capilares en este protocolo son totalmente automatizadas, lo que permite la manipulación de imágenes rápida y precisa. Si bien estos métodos representan un gran avance en la fiabilidad y la facilidad de procesamiento y contando imagen capilaroscópico, la principal limitación de la técnica es el proceso de conteo semiautomático. Idealmente, un proceso totalmente automatizado se creará en un futuro próximo. Los investigadores deben sentirse alentados a construir sobre la metodología descrita en este documento con el fin de desarrollar una tecnología clínicamente útil totalmente automatizado que permite una rápida cuantificación de la densidad capilar del lecho ungueal de un paciente.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Image-Pro Premier | Media Cybernetics, Inc | 9.1 | Image processing software |
References
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