Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

بروتوكول للثلاثي الأبعاد متحد البؤر تحليل المظهرية من النجمية

doi: 10.3791/53113 Published: December 11, 2015

Abstract

كما الخلايا الدبقية في الدماغ، الخلايا النجمية لها أدوار وظيفية متنوعة في الجهاز العصبي المركزي. في ظل وجود مؤثرات الضارة، النجمية تعديل خصائصها الوظيفية والهيكلية، وهي حالة تسمى دباق النجمي رد الفعل. هنا، يتم تقديم بروتوكول للتقييم الخصائص المورفولوجية من الخلايا النجمية. ويشمل هذا البروتوكول الكمي من 12 معلمات مختلفة أي مساحة وحجم الأنسجة من قبل (إقليم نجمية) نجمية المشمولة، ونجمية بأكملها بما في ذلك الفروع، وخلايا الجسم، والنواة، وكذلك الطول الإجمالي وعدد من الفروع، وشدة من مناعية مضان من الأجسام المضادة المستخدمة للكشف عن نجمية، وكثافة نجمية (رقم / 1000 ميكرون 2). لهذا الغرض تم إنشاء ثلاثية الأبعاد (3D) الصور المجهرية مبائر، وصورة 3D برامج التحليل مثل Volocity 6.3 كان يستخدم لقياس. أنسجة المخ الفئران المعرضة للاميلويد بيتا 1-40 1-40) مع أو بدون تدخل علاجي لتقديم الأسلوب. ويمكن أيضا أن هذا البروتوكول استخدامها ل3D تحليل المورفومترية من الخلايا الأخرى في الجسم الحي من أي أو في ظروف المختبر.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في صحي الجهاز العصبي المركزي (CNS)، النجمية تلعب دورا هاما في تنظيم تدفق الدم، واستقلاب الطاقة، وظيفة متشابك واللدونة، والأيونات خارج الخلية والعصبي التوازن 1-3. بالإضافة إلى ذلك، النجمية تستجيب للمؤثرات الضارة المختلفة وظروف غير طبيعية مثل الصدمات النفسية، والعدوى، ونقص التروية أو التنكس العصبي عن طريق رد الفعل دباق النجمي الذي يتميز تضخم وانتشارها وإعادة عرض وظيفي من الخلايا النجمية 4،5.

دباق النجمي رد الفعل يمكن أن مهندس الاستجابة الالتهابية وعملية الإصلاح في الأنسجة، وبالتالي، يمكن أن تؤثر على النتائج السريرية من التدخلات العلاجية. وفقا لذلك، وتلقى اهتماما من الخلايا النجمية الأعصاب خلال العقود الماضية كأهداف محتملة للتدخلات العلاجية لمجموعة متنوعة من الأمراض التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي.

الخلايا النجمية وعادة ما يكون شكل النجمية مع د جيدافروع efined التي تنتشر في جميع أنحاء سوما 6. في حالة المريضة في الدماغ، وفروع نجمية تصبح معقدة وتظهر نهايات منتفخة على سبيل المثال في وجود بيتا اميلويد (Aβ).

تقدم هذه المقالة بروتوكول لتحليل الصور 3D من الخلايا النجمية التي حصل عليها المجهر متحد البؤر. تم قياس اثني عشر المعلمات كمية مختلفة لكل نجمية: المناطق السطحية ومجلدات من الأراضي نجمية (الأنسجة من قبل نجمية المغطاة)، الخلية بأكملها (بما في ذلك فروع)، خلايا الجسم، والنواة. ويبلغ طول وعدد من الفروع؛ كثافة مضان من الأجسام المضادة المستخدمة للكشف عن نجمية. وكثافة الخلايا النجمية (رقم / 1000 ميكرون 2). لهذا الغرض، وكنا أقسام الدماغ من الفئران التي عرضت لintrahippocampal حقن Aβ 1-40 مع أو بدون العلاج جينيستين باعتباره مادة مضادة للالتهابات. بروتوكول صفها يمكن استخدامها لالمورفومترية لalysis من أنواع مختلفة من الخلايا في المختبر أو في الجسم الحي في ظروف مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد أجريت هذه الدراسة وفقا للسياسات المنصوص عليها في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (NIH) التي وافقت عليها لجنة الأخلاق من جامعة ايران للعلوم الطبية (طهران، إيران).

1. الحيوانات والجراحة وعينة الاستعدادات

ملاحظة: إعداد أنسجة المخ ل3D التحليل المجهري متحد البؤر.

  1. الحيوانات الانقسام عشوائيا إلى مجموعتين: Aβ 1-40 -injection (ن = 8)، وAβ 1-40 -injection مع العلاج جينيستين (ن = 8)؛ إدارة جينيستين (10 ملغ / كغ المخفف في سيارة مثل polyethoxylated زيت الخروع) بواسطة التغذية الأنبوبية 1 ساعة قبل الجراحة.
  2. تخدير الحيوانات مع الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ). تأكيد التخدير المناسبة بسبب عدم الانسحاب لا ارادي بعد معسر أخمص قدميه. استخدام مرهم على العينين أثناء الجراحة لمنع جفاف.
  3. وضع الحيوانات في جهاز التجسيمي ورئيس الحلاقة. تطبيق IODالحل المعهد الوطني للإحصاء لتنظيف فروة الرأس قبل شق والحفاظ على موقع عملية عقيمة أثناء الجراحة لتقليل خطر العدوى. حقن Aβ 1-40 stereotaxically (4 ميكرولتر) في قرن آمون في -3.5 ملم الخلفي إلى bregma، ± 2 مم الوحشي على خط الوسط، و-2.8 مم تحت الجافية، وفقا لالفئران أطلس الدماغ 8. لطريقة التجسيمي يرجى الاطلاع على المنشور السابق 9.
  4. توفير ما بعد الجراحة المراقبة / رعاية حتى الحيوانات واعية تماما لضمان راحة الحيوانات. الحفاظ على الحيوانات دافئة أثناء الانتعاش، وعدم إعادتها إلى قفص مع غيرها من الحيوانات حتى الشفاء التام. إيلاء الاهتمام لأي علامة على الإصابة في الحيوانات بعد الجراحة.
  5. تخدير الحيوانات بشدة من الكيتامين (150 ملغ / كلغ) بعد ثلاثة أسابيع من الجراحة. أداء تثبيت transcardial التي كتبها perfusing الحيوانات مع المياه المالحة 0.9٪ تليها بارافورمالدهيد 4٪ في 0.1 M PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4)، ثم إزالة وإصلاح الدماغ كما هو موضح في 10 </ سوب>.
  6. بعد إصلاح العقول في 4٪ امتصاص العرق لمدة 2-3 أيام في 4 ج.
  7. تضمين الأنسجة في كتل البارافين عن طريق استخدام معدات الأنسجة التضمين، وتجنب تحت الحشوة أو الإفراط في ملء الكاسيت لأنها قد تتداخل مع المحاذاة الصحيحة أو التقطيع. إيلاء الاهتمام لاتجاه النسيج في كتلة البارافين.
    ملاحظة: الحصين الفئران، على سبيل المثال، على مقربة من الخلفية جزء من نصف الكرة المخية. وبالتالي، يجب أن تكون جزءا لا يتجزأ من النسيج بطريقة باجتزاء يبدأ في الخلفية جزء من الدماغ. استخدام الأطلس Paxinos 8 كدليل للوصول إلى التركيب التشريحي المطلوب.
  8. وضع مشراح بعيدا عن المسودات الهواء أو المداخل منذ التحركات الجوية تجعل التعامل مع أقسام صعبة.
  9. استخدام مقاطع بسمك ≥20 ميكرون حيث أن هذا العمق مع تكون ضرورية لإنتاج صور Z-كومة من الخلايا النجمية كاملة. لا تستخدم المقاطع القليلة الأولى، كما قد تكون لديهم سمك غير مرغوب فيه بسبب ه الحراريxpansion.
  10. وضع المقاطع على سطح الماء الدافئ (5 ± 2 ج، تحت درجة حرارة انصهار لالبارافين) فترة طويلة بما يكفي لشد الأجزاء.
    ملاحظة: أكثر من التوسع في القسم يمكن أن يعكر التشكل للهيكل. استخدام الفرشاة الصغيرة لنقل بعناية أقسام. جمع 2-3 أقسام على كل شريحة.
  11. متجر الشرائح في رفوف في وضع مستقيم والسماح لهم الجافة في 37 مئوية لعدة ساعة أو O / N.

2. المناعية

  1. Deparaffinize المقاطع في زيلين، 2 × 10 دقيقة، وترطيب من خلال التدرج الكحول (99.8٪، 95٪، و 70٪ و 10 دقيقة لكل منهما) وبرنامج تلفزيوني.
  2. احتضان مع الأجسام المضادة ضد ييفي الدبقية الحمضية البروتين (GFAP) المخفف 1: 1500 في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.25٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، 0.25٪ تريتون X-100 و المصل العادي 3.5٪ (O / N عند 4 ج).
  3. يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني لمدة 3 × 5 دقائق.
  4. احتضان مع الفوسفات القلوية مترافق antibodie الثانويالصورة ل1H (1: 100، 21 ج، مخففة في PBS).
  5. يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني لمدة 3 × 5 دقائق.
    ملاحظة: من المهم أن يغسل المقاطع بشكل صحيح بعد الأجسام المضادة الثانوية للحد من تلوين الخلفية.
  6. احتضان المقاطع في الظلام مع السائل الأحمر الدائم مولد اللون (15-20 دقيقة). ملاحظة: إعداد الحل لا يزيد عن 30 دقيقة قبل الاستخدام.
  7. يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني لمدة 3 × 5 دقائق.
  8. وأخيرا، وصمة عار على النوى مع 4-6-diamidino-2-phenylindole (دابي؛ 1: 500، مخففة في PBS) قبل الانزلاق تغطية. تخزين الشرائح في الثلاجة 24-48 ساعة قبل الفحص المجهري.

3. متحد البؤر المجهر

ملاحظة: للحصول على التقييم الكمي (انظر أدناه)، حدد نجمية مع نواة ملطخة دابي واضحة للعيان مع حد أدنى من تداخل فروع للحد من مخاطر الأخطاء. إنتاج الصور Z-ستاك هو مضيعة للوقت. التحلي بالصبر وعدم التوقف أثناء معالجة. متحد البؤر تستقيم الليزر مجهر المسح هو شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي لخلق صور 3D من الخلايا النجمية.

  1. وضع الشريحة على مرحلة المجهر، وحدد الهدف 63X.
  2. فتح برامج التصوير وانقر على نظام ابدأ. انقر فوق علامة التبويب موقع. الذهاب إلى تعيين وتحديد GFP لضبط الضوء المناسب.
  3. فتح مصراع لتعكس الضوء. العثور على مسدس العاكس على الجانب الأيمن من مصراع واختيار اللون الذي يجب أن ينعكس النجمية (الأخضر والأحمر أو البنفسجي)؛ وقد استخدم اللون الأحمر (FSet20 WF) هنا.
    ملاحظة: لا تنس أن التركيز على صورة مباشرة في بصري المجهر.
  4. للعثور على أفضل التركيز، انقر على جميع مغلقة، ووضع دبوس المجهر في وضع ملء الشاشة، وانقر فوق علامة التبويب الاستحواذ.
  5. انقر على الإعداد الذكي تحت علامة التبويب اكتساب؛ يفتح نافذة. حدد fluorophore المناسب (أي دابي واليكسا فلور 555، في المشروع الحالي) من القائمة. يتم تحديد اللون تلقائيا.
  6. انقر على أفضل إشارة، وتطبيق، ثم انقر على تعيين التعرض؛ وبعد ذلك تعيين الكمبيوتر تلقائيا المعلمات التعرض.
  7. لتحسين الصورة، انتقل إلى إطار القنوات. عدم تحديد Track2، وتسليط الضوء Track1 وانقر على لايف. تركيز الصورة إذا لزم الأمر.
  8. في إطار القنوات ضبط المفاتيح التالية. انقر على 1AU لتحسين تلقائيا الثقب. من المهم جدا للقيام بهذه الخطوة وإلا الصور مبائر يكون غير الأمثل. ضبط كسب الحصول على أفضل كثافة (الحفاظ على هذا الإعداد دون 800 للحد من الضوضاء إضافية). وأخيرا، تعيين كسب الرقمية بين 2 و 3.
  9. عدم تحديد Track1، انقر على Track2 وكرر الخطوة 3.8 لTrack2. ثم توقف لايف.
  10. انتقل إلى إطار الوضع الاستحواذ. تحسين صورة عن طريق تحسين الإطار الحجم ومتوسط. من أجل تغيير حجم الإطار يذهب إلى X * Y وحدد 1024 X 1024. اختيار سرعة بطيئة لخلق صورة أفضل.
  11. الذهاب إلى المتوسطات وحدد عدد ≥4. هذه القيمة المتوسط ​​يشير إلى عدد المسحات التي سيتم متوسط ​​إلى المنتجالبريد الصورة المكتسبة. الآن انقر على زر المفاجئة، وحفظ الصورة 2D القبض عليه.
  12. للتصوير 3D، نحتفل في هذا البند Z-المكدس في إطار الإعداد الذكي مما تسبب في نافذة Z-المكدس لفتح.
  13. تعيين المراكز الأولى والأخيرة لZ-ستاك، أي عمق الخلية. أولا انقر على لايف. ثم استخدم محرك تركيز المجهر التركيز على موقف العلوي من نجمية في الأنسجة، حيث Z-ستاك هو أن تبدأ. انقر على المجموعة الأولى. ثم التركيز وصولا الى أدنى موقف نجمية في الأنسجة، حيث يجب أن يتوقف المسح الضوئي Z-المكدس. انقر على تعيين آخر. ثم توقف لايف.
  14. اختيار الفاصل. 1.01 ميكرون يستخدم في الدراسة الحالية. ويمكن أن يتم اختيار الفاصل الزمني عن طريق النقر على الأمثل لتعيين عدد من شرائح.
  15. انقر فوق ابدأ التجربة. حفظ الصور مرة واحدة اكتمال التفحص. وسوف تستخدم هذه الصورة لقياس المعلمات التالية: مساحة وحجم الأراضي نجمية، ونجمية بأكملها بما في ذلك حمالة الصدرnches، خلايا الجسم، والنواة.
  16. الحصول على صورة 2D باستخدام الهدف 10X 20X أو كما هو موضح في خطوات 3،6-3،11. هذه الصورة يمكن أن تستخدم لقياس كثافة مناعية مضان من الأجسام المضادة، وكثافة نجمية (رقم / 1000 ميكرون 2).

4. كثافة نجمية وGFAP + شدة الإسفار

  1. فتح الصورة 20X 2D. انقر على HISTO (Hisogram) على الجانب الأيسر من نافذة الصورة.
  2. لحساب كثافة نجمية، حدد ثلاثة حقول بصرية متتالية تحت الهدف 20X. حساب عدد الخلايا النجمية التي تظهر على سوما واضح مع الحد الأدنى، وتداخل فروع في الحقول.
  3. لقياس كثافة مضان، حدد أداة مناسبة (مستطيل أو دائرة) على تذييل إطار الصورة، واختيار منطقة لقياس. ملاحظة تظهر قيمة المتوسط ​​والانحراف المعياري تلقائيا تحت الصورة. في الدراسة الحالية، وهو 0.7 مم 2 مساحة مستطيلة بين شارعوقد استخدم iatum وشفرة وسطي من التلفيف المسنن.

5. الفروع نجمية

  1. لتحديد طول وعدد الفروع، واستخدام الصور 3D (المكتسبة مع 20X) في البرنامج صورة تحليل. رسم خط يدويا على طول كل فرع من فروع نجمية المحدد. ثم حدد قياس أداة متخصصة لقياس خط طول. من أجل تحديد عدد من الفروع، وتحديد عدد أداة لحساب عدد من البنود ملحوظ.

6. حجم ومساحة المبنى

ملاحظة: علامات بنية يدويا في 3D تحليل الصور برامج تتطلب التركيز والتدريب. ممارسة عدة مرات قبل بدء التجربة.

  1. لقياس حجم والمساحة السطحية للنجمية النواة، سوما، خلايا الجسم والأرض، ونقل صور 3D (المكتسبة في خطوات 3،1 حتي 3،16) إلى صورة 3D برامج التحليل مثل Volocity 6.1.
  2. فتح البرنامج وخلق جديدمكتبة. سحب جميع الصور إلى العمود الرمادي اليسار في مكتبة جديدة. ثم، حدد صورة واحدة 3D. على اليمين، وهناك قنوات مختلفة بألوان مختلفة. تشغيل قناة واحدة من الفائدة؛ على سبيل المثال القناة الزرقاء للدابي عند قياس النواة. تغيير سطوع يدويا للحصول على النقيض الأمثل.
  3. اختر من القائمة أدوات، انتقل إلى جعل حجم وإنتاج صورة 3D واحدة من الصور Z-المكدس. انقر على خصائص في القائمة تحرير ومما لا شك فيه أن X، Y وترد Z خصائص. وإلا فإنه من المستحيل إجراء تحليل 3D.
  4. انقر على أيقونة الأداة حر RIO في شريط الأدوات. لقياس حجم والمساحة السطحية للنجمية نواة رسم خط حول النواة المسمى دابي.
  5. لقياس حجم والمساحة السطحية للنجمية خلايا الجسم رسم خط حول سوما باستثناء الفروع.
  6. لقياس حجم والمساحة السطحية للنجمية كامل (خلايا الجسم بما في ذلك فروع) رسم خط حول سوما بعدسطح كل الفروع.
  7. لتقييم حجم والمساحة السطحية للأراضي نجمية رسم الخط الفاصل بين نصائح من الفروع.
    ملاحظة: اضغط حذف على لوحة المفاتيح لمحو رسومات غير المرغوب فيها.
  8. انقر على قائمة القياسات في الجزء العلوي من الصورة نافذة لإنشاء بروتوكول القياس؛ يفتح نافذة تحتوي على أدوات مختلفة.
  9. السحب إيجاد الكائنات إلى أعلى النافذة (جزء). إعطاء اسم وصفي للسكان 1، حدد اللون المرتبطة بها، وانقر على التدبير. يفتح نافذة أخرى.
  10. اختيار المنطقة أي معلمة، وحجم أو السطح. انقر على OK. سوف تظهر البيانات في الجدول.
  11. لحفظ النقر البيانات في القائمة قياس وتحديد إجراء القياس البند.
  12. حدد عنصر قياس جديد يسمى من نافذة فتحها. ثم إعطاء اسم للبيانات وانقر على OK.
  13. وأخيرا، تصدير البيانات إلى برنامج إحصاءات مثل لوحة الرسم البياني أو برنامج اكسل. استخدام اختبار (ت) لتحليل البيانات، ثم رسم 2D غرامaphs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يعرض هذا القسم بعض الأمثلة من الملاحظات النوعية والكمية التي تنتجها تحليل المورفومترية 3D. للحصول على نتائج كاملة لجميع المعلمات 12 المذكورة سابقا، يرجى الاطلاع على المنشور السابق 10.

ملاحظات النوعية

الخلايا النجمية أظهرت فروع رقيقة أو سميكة التي كانت عادة ما يكون طويلا في Aβ 1-40 حقن الجرذان (الشكل 1). لوحظ عدد قليل من الخلايا النجمية صغيرة على شكل النجمية التي لها فروع قصيرة في القشرة الدماغية، وقعت شبكة متراصة من الخلايا النجمية في الجسم الثفني.

أظهرت الخلايا النجمية في أنسجة المخ من الحيوانات مع Aβ 1-40 -injection تليها العلاج جينيستين شكل النجمية التي لها فروع قصيرة ورقيقة (الشكل 2) 10. وأظهرت بعض الخلايا النجمية ظهور الضموري.

كثافة نجمية وGFAP + مضان كثافة

وكان متوسط ​​عدد الخلايا النجمية / 1000 ميكرون 2 أعلى بكثير لدى الفئران مع Aβ 1-40 -injection بالمقارنة مع الحيوانات في Aβ 1-40 -injection ومجموعة العلاج جينيستين (P <0.0001). وبالإضافة إلى ذلك، كانت GFAP + مضان كثافة أقل من ذلك بكثير في قسم المخ مع العلاج جينيستين مقارنة مع غير المعالجة Aβ 1-40 حقن الحيوانات (الشكل 3).

تحليل المورفومترية من حجم النجمية

حجم الأراضي نجمية النواة، خلايا الجسم، نجمية بأكملها ونجمية انخفضت بشكل ملحوظ في مجموعة العلاج جينيستين مقارنة مع الحيوانات غير المعالجة. وتشير هذه النتيجة أن جينيستين تحسنا في دباق النجمي الناجمة عن وجود اميلويد (الشكل 4A - D).

r.within صفحة = "1"> الشكل 1
الشكل 1. متحد البؤر صورة من نجمية. ومن نجمية الفردية التي لها فروع سميكة وطويلة (رأس السهم) والمسمى دابي النواة (السهم) في الدماغ الفئران تعرضوا للحقن الحصين من Aβ 1-40. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. متحد البؤر صورة من نجمية. ومن نجمية مع فروع قصيرة (رأس السهم). في دماغ الفئران تعرض لالحصين Aβ 1-40 -injection، وجينيستين قبل العلاج بواسطة التغذية الأنبوبية التي يديرها. P تأجير انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
انخفضت الشكل 3. GFAP + مضان كثافة كبيرة في الحيوانات مع A β 1-40 - حقن التي حصلت جينيستين ما قبل المعالجة القيم يعني ± SEM. تم تقييم خمسين النجمية لكل حيوان. P <كان ينظر 0.05 بالمهم، وكان يستخدم T-اختبار لمقارنة البيانات بين المجموعات مع أو بدون العلاج. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ز "/>
الرقم 4. حجم متوسط ​​من نواة (A)، جسم الخلية (B)، نجمية (بما في ذلك الفروع؛ (C)، وإقليم (D) في عينات المخ المأخوذة من الفئران تعرض لAβ 1-40 -injection، مع أو بدون جينيستين ما قبل المعالجة. جينيستين تفض إلى تحسن كبير في توسيع النواة، خلايا الجسم، ونجمية بأكملها، والأراضي نجمية (انظر المرجع 10). القيم يعني قيمت ± SEM وخمسين النجمية لكل حيوان. P <0.05 كان يعتبر كبيرا، وكان يستخدم T-اختبار لمقارنة البيانات بين المجموعات قبل وبعد العلاج. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في البروتوكول الحالي، نحن العاملين 3D قياس الأشكال متحد البؤر لتقييم 12 المعلمات المختلفة التي ارتبطت نجمية التشكل. لهذا الغرض، والأنسجة قرن آمون من الفئران مع Aβ 1-40 - استخدمت دباق النجمي التي يسببها، مع أو بدون المعالجة جينيستين كعامل مضاد للالتهابات. باستخدام صور 3D والبرمجيات المورفولوجية، كنا قادرين على إظهار تأثير جينيستين على دباق النجمي أي مورفولوجيا الخلايا النجمية.

التغيرات في البيئة الخلوية البينية وإضافية من أنسجة المخ يمكن أن يغير حجم و / أو حجم الخلايا / الأنسجة. وتعتبر هذه التعديلات بصمات المرضية في مختلف إصابات الدماغ 3،11. من أجل تحديد هذه التعديلات ويتم استخدام عدد من التقنيات. وتستند معظم التحقيقات على استخدام 2D الصور ذات الدقة المنخفضة التي استولت عليها الخفيف أو المجهر الإلكتروني (EM) التي تعطي معلومات فقط عن جزء صغير من مليرة لبنانية. للتغلب على هذا القيد، وقد وضعت 3D متحد البؤر القياس الشكلي على صور عالية الدقة 11. ميزة أخرى لالمجهري متحد البؤر هي أن بنية خلية يمكن دراستها منذ يتم الحصول على العديد من الصور 2D متتالية في حين يتم تنفيذ التصوير Z-المكدس. وبالإضافة إلى ذلك، 3D المجهري متحد البؤر يثير إمكانية لتحسين جودة الصور من خلال تصفية الضوضاء في الخلفية 11.

الطريقة المعروضة هنا هو مضيعة للوقت. التقاط صور Z-ستاك مع المجهر متحد البؤر يستغرق عدة دقائق لكل خلية واحدة. بالإضافة إلى ذلك، وضع علامات بنية في البرنامج يدويا يتطلب بعض الممارسة، وربما يحتاج الباحث إلى إعادة رسم عدة مرات للتأكد من أن هيكل يتم وضع علامة بشكل صحيح. وتجدر الإشارة إلى أن علامة التبويب 'ماجيك' في 3D تحليل الصور برامج مثل Volocity، يمكن أن تستخدم للاحتفال كل نواة ملطخة دابي في صورة واحدة تلقائيا. ويمكن استخدام هذا الخيار عندماالخلايا النجمية يتم تربيتها. أقسام الدماغ، ومع ذلك، تحتوي ليس فقط الخلايا النجمية ولكن أيضا العديد من الخلايا الأخرى مثل الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية. وهذا يعني أن العديد من نواة ملطخة دابي لا تنتمي إلى الخلايا النجمية. نوى المرتبطة النجمية يجب وضع علامة يدويا باستخدام الصور وجود كل من نوى دابي المسمى والخلايا النجمية GFAP-مناعيا.

في هذا البروتوكول، واستخدمت أجسام مضادة ضد GFAP لتصور الخلايا النجمية في أقسام البارافين. ويمكن أيضا أن الخلايا النجمية يمكن تصور باستخدام مستضدات أخرى 12،13، أو الفئران المعدلة وراثيا. يجب أن تكون على علم المحققون من القيود المفروضة على الطرق، واستخدام أفضل التصميم التجريبي ممكن على أساس أهدافها. الحد من استخدام الأجسام المضادة ضد GFAP، على سبيل المثال، هو أن 10-15٪ فقط من الهيكل الخلوي يمكن الكشف عنها. هذا القيد، ومع ذلك، يمكن أن تصبح ميزة عند دراسة دباق النجمي. ارتفاع عدد الخلايا النجمية وشبكة كثيفة من الفروع النجمية "في النحوtrogliosis يمكن أن تجعل من الصعب تحديد خلية واحدة إذا تم الكشف عن مساحة أكبر من الخلية. على الرغم من أن هذا البروتوكول وصف الكمي من 12 معلمات مختلفة ولكن المحقق يمكن اختيار تلك التي تناسب هدفهم. وفقا لتجربتنا، يمكن للقياسات جميع المعلمات تعطي معلومات قيمة حول المعلمات التي تتأثر بشكل ملحوظ في حالة معينة أو عن طريق العلاج. ويمكن أيضا أن طريقة القياس الكمي التي أجريت على الصور 3D المأسورة في المجهر متحد البؤر أن يؤديها على الأبواب المجمدة. المسألة لعلاج العينات (التثبيت، والجفاف، والتضمين وباجتزاء) بطريقة مشابهة منذ هذه الخطوات يمكن أن يؤدي إلى انكماش أو تورم في الأنسجة.

وفي الختام، 3D التصوير متحد البؤر، في مزيج مع برنامج المظهرية يجعل من الممكن تحديد العديد من المعلمات المرتبطة مورفولوجية الخلية. بروتوكول قدمنا ​​هنا يمكن أن تستخدم لتقييم الصرفي تشانغيس التي تظهر في زنزانة، في ظروف مرضية مختلفة، أو تأثير استراتيجية التدخل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مجلس مقاطعة Östergötland، (السويد) والخلوية ومركز الأبحاث الجزيئية في جامعة ايران للعلوم الطبية (طهران، إيران).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amyloid beta 1-40 Sigma Aldrich 79793 Keep in -70 °C
Genistein Sigma Aldrich 446-72-0 keep in -20 °C
polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein DAKO Z0334
alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies DAKO
Liquid Permanent Chromogen DAKO K0640
Liquid permanent Red Substrate Buffer DAKO K0640
Cremophor EL Sigma Aldrich 27963 Polyethoxylated castor oil - Step 1.1
LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy Carl Zeiss
Volocity 6.3 Perkin Elmer Inc.,
Image Analysis 2000 Tekno Optic
Streotaxic apparatus Stoelting
Graph pad Prism 5 Graph pad software Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, (3), 430-440 (2008).
  2. Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55, (12), 1251-1262 (2007).
  3. Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, (1), 7-35 (2010).
  4. Pekny, M., Nilsson, M. Astrocyte activation and reactive gliosis. Glia. 50, (4), 427-434 (2005).
  5. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32, (12), 638-647 (2009).
  6. Anderova, M., et al. Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 31, (3), 894-907 (2011).
  7. Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100, (2), 384-396 (1985).
  8. Paxinos, G., Watson, C. A stereotaxic atlas of the rat brain. Academic. New York. (1998).
  9. Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat. J Vis Exp. (65), e4079 (2012).
  10. Bagheri, M., et al. Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study. PloS One. 8, (10), e76526 (2013).
  11. Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices. J Anat. 210, (6), 671-683 (2007).
  12. Kulkarni, P. M., et al. Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images. J Neuroscie Methods. 15, (246), 38-51 (2015).
  13. Wagner, D. C., et al. Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury. Acta Neurobiol Exp. 73, (1), 79-87 (2013).
بروتوكول للثلاثي الأبعاد متحد البؤر تحليل المظهرية من النجمية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bagheri, M., Rezakhani, A., Roghani, M., Joghataei, M. T., Mohseni, S. Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes. J. Vis. Exp. (106), e53113, doi:10.3791/53113 (2015).More

Bagheri, M., Rezakhani, A., Roghani, M., Joghataei, M. T., Mohseni, S. Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes. J. Vis. Exp. (106), e53113, doi:10.3791/53113 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter