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Neuroscience

Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten

doi: 10.3791/53113 Published: December 11, 2015

Abstract

Gliazellen im Gehirn haben Astrozyten diverse funktionelle Rolle im zentralen Nervensystem. In Gegenwart von schädlichen Stimuli, Astrozyten ihre funktionellen und strukturellen Eigenschaften, eine so genannte reaktive Astrogliose modifizieren. Hier wird ein Protokoll für die Beurteilung der morphologischen Eigenschaften der Astrozyten wird vorgestellt. Dieses Protokoll umfasst die Quantifizierung der 12 verschiedene Parameter, dh die Fläche und das Volumen der von einem Astrozyten (Astrozyten Gebiet) abgedeckt Gewebe, das gesamte Astrozyten einschließlich Filialen, Zellkörper und Kern sowie Gesamtlänge und die Anzahl der Filialen, die Intensität Fluoreszenz Immunreaktivität von Antikörpern für Astrozyten Erkennung verwendet, und Astrozyten Dichte (Anzahl / 1000 um 2). Hierzu dreidimensionale (3D) konfokale mikroskopische Bilder wurden erzeugt und 3D-Bildanalyse-Software wie Volocity 6.3 wurde für die Messungen verwendet. Rattenhirngewebe, um Beta-Amyloid 1-40 ausgesetzt (1-40) mit oder ohne einen therapeutischen Eingriff verwendet wurde, um das Verfahren darzustellen. Dieses Protokoll kann auch für 3D morphometrische Analyse anderer Zellen entweder in vivo oder in vitro-Bedingungen verwendet werden.

Introduction

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Bei gesunden zentralen Nervensystems (ZNS), spielen Astrozyten eine wichtige Rolle bei der Regulation des Blutflusses, Energiestoffwechsel, synaptische Funktion und Plastizität und extrazellulären Ionen und Neurotransmitter Homöostase 1-3. Darüber hinaus Astrozyten reagieren auf verschiedene schädliche Reize und anormale Zustände wie Trauma, Infektion, Ischämie oder Neurodegeneration über reaktive Astrogliose die durch Hypertrophie, Proliferation und funktionellen Umgestaltung Astrozyten 4,5 gekennzeichnet ist.

Reaktiv Astrogliose kann die Entzündungsreaktion und Reparaturprozesses in der Gewebezüchtung, und daher kann das klinische Ergebnis therapeutischer Maßnahmen beeinflussen. Dementsprechend Astrozyten Aufmerksamkeit von Neuro in den letzten Jahrzehnten als potentielle Ziele für therapeutische Interventionen für eine Vielzahl von Erkrankungen des ZNS erhalten.

Astrozyten haben normalerweise eine Sternform mit gut defined Zweige, die rund um den Soma 6 zu verbreiten. In einem erkrankten Zustand, in dem Gehirn, Astrozyten Verzweigungen verworren und zeigen gequollenen Enden 7, beispielsweise in Gegenwart von Amyloid-beta (Aß).

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Analyse von 3D-Bildern von Astrozyten durch konfokale Mikroskopie erworben. Zwölf verschiedene quantitative Parameter für jeden Astrozyten wurden gemessen: die Flächen und Volumina der Astrozyten-Gebiet (die durch einen überdachten Astrozyten Gewebe), gesamte Zelle (einschließlich Zweigniederlassungen), Zellkörper und Kern; die Gesamtlänge und die Zahl der Filialen; die Fluoreszenzintensität von Antikörpern für Astrozyten Erkennung verwendet; und die Dichte der Astrozyten (Anzahl / 1.000 & mgr; m 2). Zu diesem Zweck verwendeten wir Gehirnschnitten von Ratten, um die Injektion von 1-40 mit oder ohne Genistein Behandlung eines entzündungshemmenden Substanz intrahippocampal belichtet. Das beschriebene Protokoll kann für eine morphometrische verwendet werdenalysis verschiedener Zelltypen in vitro oder in vivo in verschiedenen Bedingungen.

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Protocol

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Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH) eingestellt Politik von Ethic Ausschuss der Iran University of Medical Sciences (Teheran, Iran) zugelassen wurde.

1. Tiere, Chirurgie und Probenvorbereitungen

HINWEIS: Bereiten Hirngewebe für 3D-konfokale mikroskopische Analyse.

  1. Divide Tiere zufällig in zwei Gruppen: 1-40 -Injektion (n = 8) und 1-40 -Injektion mit Genistein Behandlung (n = 8); verabreichen Genistein (10 mg / kg in einem Vehikel verdünnt wie polyethoxyliertes Rizinusöl) per Schlundsonde 1 Stunde vor der Operation.
  2. Betäuben die Tiere mit Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg). Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch einen Mangel an Ziehreflex nach dem Einklemmen des Zehe. Verwenden Salbe auf die Augen während der Operation bis zur Trockenheit zu verhindern.
  3. Zeigen Tiere in stereotaktischen Apparat und rasieren Kopf. Bewerben iodine Lösung, um die Kopfhaut vor dem Schnitt säubern und zu halten, das den Betrieb vor Ort sterile während der Operation, um das Infektionsrisiko zu verringern. Injizieren 1-40 stereotaktisch (4 ul) im Hippocampus bei -3,5 mm hinter Bregma, ± 2 mm lateral zur Mittellinie, und -2,8 mm unterhalb dura nach Rattenhirnatlas 8. Für stereotaktischen Verfahren finden Sie in früheren Veröffentlichung 9.
  4. Geben Sie postoperative Beobachtungs / Pflege, bis die Tiere bei vollem Bewusstsein, um den Komfort der Tiere zu gewährleisten. Halten Sie die Tiere warmen während der Wiederherstellung, und schützen Sie sie vor einem Käfig mit anderen Tieren zurück, bis vollständige Genesung. Achten Sie auf Anzeichen von Infektionen bei den Tieren nach der Operation.
  5. Betäuben die Tiere tief von Ketamin (150 mg / kg) drei Wochen nach der Operation. Führen transkardialer Fixierung durch Perfusion die Tiere mit 0,9% Kochsalzlösung, gefolgt von 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PBS (pH = 7,4), dann entfernen und zu beheben Gehirn wie in 10 beschrieben </ sup>.
  6. Post-fix die Gehirne in 4% Paraformaldehyd für 2-3 Tage bei 4 ° C.
  7. Betten Sie das Gewebe in Paraffinblöcke durch die Verwendung von Gewebeeinbettungstechnik und vermeiden Unterfüllung oder Überfüllung der Kassette, da es mit der richtigen Ausrichtung oder Schnitte stören. Achten Sie auf die Ausrichtung des Gewebes in der Paraffinblock.
    HINWEIS: Die Ratte Hippocampus, zum Beispiel, ist in der Nähe von hinteren Teil der Hirnhemisphäre. Somit sollte das Gewebe in einer Art und Weise eingebettet werden, dass Schneiden beginnt am hinteren Teil des Gehirns. Verwenden Sie die Paxinos atlas 8 als Führung, um den gewünschten anatomischen Struktur zu erreichen.
  8. Legen Sie das Mikrotom von Zugluft oder Türöffnungen, da Luftbewegungen machen die Handhabung der Teile schwierig.
  9. Verwenden Abschnitte mit einer Dicke ≥20 um, wie diese Tiefe mit notwendig sein, Z-Stapel-Bilder von kompletten Astrozyten produzieren. Verwenden Sie nicht die ersten paar Abschnitte, da sie unerwünschte Dicke haben können, aufgrund der thermischen eXpansion.
  10. Legen Sie die Teile auf der Oberfläche mit warmem Wasser (5 ± 2 C unterhalb der Schmelztemperatur für Paraffin) gerade lang genug, um die Abschnitte zu glätten.
    HINWEIS: Überexpansion des Profils kann die Morphologie der Struktur stören. Verwenden Sie kleine Pinsel, um vorsichtig zu übertragen Abschnitten. Sammeln Sie zwei vor drei Abschnitten auf jeder Folie.
  11. Shop Dias in einem Rack in einer aufrechten Position und lassen Sie sie für mehrere Stunden oder O / N trocken bei 37 ° C.

2. Immunhistochemie

  1. Entparaffinieren Abschnitte in Xylol, 2 x 10 min, und rehydratisieren durch Alkohol-Gradienten (99,8%, 95% und 70%, jeweils 10 min) und PBS.
  2. Inkubieren mit Antikörpern gegen saures Gliafaserprotein (GFAP), verdünnt 1: 1500 in PBS, das 0,25% Rinderserumalbumin (BSA), 0,25% Triton X-100 und 3,5% normales Serum (O / N bei 4 ° C).
  3. Waschen Schnitte in PBS für 3 x 5 min.
  4. Inkubieren mit sekundärem alkalische Phosphatase konjugierten antibodies für 1 h (1: 100, 21 C, verdünnt in PBS).
  5. Für 3 x 5 min Waschen Sie die Schnitte in PBS.
    HINWEIS: Es ist wichtig, um die Abschnitte richtig waschen, nachdem Sekundärantikörper, um Hintergrundfärbung zu minimieren.
  6. Abschnitte in Dunkelheit inkubieren mit Liquid Permanent Red Chromogen (15-20 min). Hinweis: Bereiten Sie die Lösung nicht mehr als 30 Minuten vor dem Gebrauch.
  7. Waschen Schnitte in PBS für 3 x 5 min.
  8. Schließlich färben die Kerne mit 4-6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; 1: 500, verdünnt in PBS) vor der Deckung Rutsch. Speichern Sie die Folien im Kühlschrank 24-48 h vor der Mikroskopie.

3. konfokale Mikroskopie

HINWEIS: Zur quantitativen Auswertung (siehe unten), wählen Sie eine Astrozyten mit einem deutlich sichtbaren DAPI-gefärbten Zellkern mit einem Minimum von überlappenden Ästen, um das Fehlerrisiko zu verringern. Herstellung von Z-Bilder Stapeln ist zeitaufwendig. Seien Sie geduldig und nicht während der Verarbeitung zu stoppen. Upright konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop ist used, um 3D-Bilder von Astrozyten zu erstellen.

  1. Setzen Sie den Schieber auf der Mikroskop-Bühne, und wählen Sie das 63X Ziel.
  2. Öffnen Sie die Imaging-Software und klicken Sie auf Start-System. Klicken Sie auf die Registerkarte Suchen. Zum Ordnen und wählen GFP, um die richtige Licht einzustellen.
  3. Öffnen Sie den Auslöser, um Licht zu reflektieren. Finden Sie den Reflektor Revolver auf der rechten Seite der Shutter und wählen Sie die Farbe, die von Astrozyten (grün, rot oder violett) widerspiegeln sollte; rote Farbe (FSet20 wf) wurde verwendet.
    HINWEIS: Vergessen Sie nicht, um das Bild direkt in das Okular des Mikroskops zu konzentrieren.
  4. Um den besten Fokus zu finden, klicken Sie auf alle geschlossen, legte das Mikroskop Stift im Bildmodus, und klicken Sie auf die Registerkarte Acquisition.
  5. Klicken Sie auf Smart Setup im Register Acquisition; öffnet sich ein Fenster. Wählen Sie die richtige Fluorophors (dh DAPI und Alexa Fluor 555, im aktuellen Projekt) aus der Liste. Die Farbe wird automatisch ausgewählt.
  6. Klicken Sie auf das beste Signal und Übernehmen, und klicken Sie auf Set Exposure; der Computer wird dann automatisch die Belichtungsparameter eingestellt.
  7. Zur Optimierung der Bild, gehen Sie zum Fenster Kanäle. Unmark Track2, markieren Track1 und klicken Sie auf Live. Stellen Sie das Bild, wenn nötig.
  8. Im Fenster Kanäle passen Sie die folgenden Tasten; klicken Sie 1AU automatisch optimieren die Lochkamera. Es ist sehr wichtig, diesen Schritt sonst die konfokale Bilder werden nicht optimalen tun. Verstärkung anpassen um das beste Intensität (halten Sie diese Einstellung unter 800, um zusätzliche Rauschen zu verringern) zu haben. Schließlich, stellen Sie die digitale Verstärkung zwischen 2 und 3.
  9. Unmark Track1, klicken Sie auf Track2 und wiederholen Sie Schritt 3.8 für Track2. Dann hör Live.
  10. Zum Erfassungsmodus-Fenster. Verbessern Sie das Image durch die Optimierung der Bildgröße und Mittelung. Um das zu ändern Frame-Größe auf X * Y und wählen 1.024 x 1.024. Wählen Sie eine langsame Geschwindigkeit, um ein besseres Bild zu erzeugen.
  11. Zum Mittelwertbildung und wählen Sie eine Anzahl ≥4. Diese Mittelung Wert gibt die Anzahl der Scans, die gemittelt werden, um produc werdene die erfasste Bild. Klicken Sie nun auf den Druckknopf, und speichern Sie die aufgenommenen Bildes 2D.
  12. Für 3D-Bildgebung, markieren Sie die Z-Stapel Element unter Smart Setup wodurch die Z-Stapel-Fenster zu öffnen.
  13. Setzen die ersten und letzten Positionen für die Z-Stapel, dh die Tiefe der Zelle ist. Klicken Sie zunächst auf Live. Dann nutzen Sie den Fokustrieb des Mikroskops auf die oberste Position der Astrozyten im Gewebe, wobei die Z-Stapel ist zu Beginn zu konzentrieren. Klicken Sie auf Set Erste. Dann konzentriert bis zur untersten Position der Astrozyten im Gewebe, in dem Z-Stapel Abtastung gestoppt werden soll. Klicken Sie auf Set Last. Dann hör Live.
  14. Wählen Sie das Intervall; 1,01 & mgr; m in der vorliegenden Studie verwendet wird; Wahl-Intervall kann durch Klicken auf Optimal, um die Anzahl der Schichten eingestellt erfolgen.
  15. Klicken Sie auf Start Experiment. Speichern Sie die Bilder, sobald die Überprüfung abgeschlossen ist. Oberfläche und Volumen der Astrozyten Gebiet der gesamte Astrozyten einschließlich BH: Dieses Bild wird für die Messung der folgenden Parameter verwendet werdennches, Zellkörper und Kern.
  16. Erwerben Sie ein 2D-Bild mit einem 10X oder 20X Ziel wie in den Schritten 3,6-3,11 beschrieben. Dieses Bild kann für die Messung der Intensität der Fluoreszenz Immunreaktivität des Antikörper und Astrozyten Dichte (Anzahl / 1000 um 2) verwendet werden.

4. Astrocyte Dichte und GFAP + Fluoreszenzintensität

  1. Öffnen Sie das 20X 2D-Bild. Klicken Sie auf Histo (Hisogram) auf der linken Seite des Bildfensters.
  2. Um Astrozyten Dichte zu berechnen, wählen Sie drei aufeinander folgenden Gesichtsfelder unter 20x-Objektiv. Zählen Sie die Anzahl der Astrozyten, die eine klare soma aufweisen mit einem Minimum an, sich überlappenden Niederlassungen in den Feldern.
  3. Um Fluoreszenzintensität zu quantifizieren, wählen Sie ein geeignetes Werkzeug (Rechteck oder Kreis) in der Fußzeile der Bildfenster, und wählen Sie einen Bereich für die Messung. Beachten Sie, der Mittelwert und Standardabweichung automatisch unter dem Bild erscheinen. In der aktuellen Studie, ein 0,7 mm 2 rechteckigen Bereich zwischen striatum und mediale Klinge Gyrus dentatus wurde verwendet.

5. Astrocyte Branchen

  1. Um die Länge und die Gesamtzahl der Filialen zu quantifizieren, verwenden Sie 3D-Bilder (mit 20X erworben) in der Bildanalysesoftware. Zeichnen Sie eine Linie von Hand entlang der Länge jedes Zweiges des ausgewählten Astrozyten. Wählen Sie dann den Mess-Tool, das zur Messung von Leitungslängen spezialisiert ist. Um die Zahl der Filialen zu quantifizieren, wählen Sie den Count-Werkzeug, um die Anzahl der markierten Objekte zu zählen.

6. Volumen und Oberfläche

HINWEIS: Markieren einer Struktur manuell in 3D-Bildanalyse-Software erfordert Fokus und Ausbildung. Üben Sie mehrmals, bevor ein Experiment.

  1. Um das Volumen und Oberfläche des Astrozyten-Zellkern, soma, Zellkörper und Territorium zu quantifizieren, übertragen Sie die 3D-Bilder (in Schritten von 3,1 bis 3,16 erworben) zu einem 3D-Bildanalyse-Software wie Volocity 6.1.
  2. Öffnen Sie die Software und erstellen Sie eine neueBibliothek. Ziehen Sie alle Bilder auf der linken grauen Spalte in der neuen Bibliothek. Dann wählen Sie eine 3D-Bild. Auf der rechten Seite gibt es unterschiedliche Kanäle mit unterschiedlichen Farben. Schalten Sie einen Kanal von Interesse; beispielsweise die Blaukanal für DAPI bei der Messung der Zellkern. Ändern Sie die Helligkeit manuell, um einen optimalen Kontrast zu erhalten.
  3. Wählen Sie das Menü Extras finden Sie auf Volume Stellen und erzeugen ein einziges 3D-Bild von Z-Stapel-Bildern. Klicken Sie auf Eigenschaften in dem Menü Bearbeiten und stellen Sie sicher, dass X, Y und Z-Eigenschaften werden vorgestellt; sonst ist es unmöglich durchzuführen 3D-Analyse.
  4. Klicken Sie auf das Freihand-RIO-Werkzeug-Symbol in der Symbolleiste. Um das Volumen und Oberfläche der Astrozyten-Zellkern zu messen ziehen Sie eine Linie um den DAPI-markierten Zellkern.
  5. Um das Volumen und Oberfläche der Astrozyten-Zellkörper zu messen, ziehen Sie eine Linie um den Soma ohne Filialen.
  6. Um das Volumen und Oberfläche der gesamten Astrozyten (Zellkörper einschließlich Zweigniederlassungen) messen, ziehen Sie eine Linie um den Soma nach demFläche aller Branchen.
  7. Um das Volumen und Oberfläche der Astrozyten-Gebiet zu bewerten ziehen Sie eine Linie zwischen den Spitzen der Zweige.
    HINWEIS: Drücken Sie Entf auf der Tastatur, um unerwünschte Zeichnungen zu löschen.
  8. Klicken Sie auf die Messungen-Menü am oberen Rand des Bildfensters, um ein Messprotokoll zu erstellen; ein Fenster mit verschiedenen Werkzeugen geöffnet.
  9. Ziehen Sie die Objekte finden, um oben im Fenster (Fensterbereich). Geben Sie einen aussagekräftigen Namen für die Bevölkerung ein, wählen Sie die zugehörigen Farbe, und klicken Sie auf Messen. Ein weiteres Fenster öffnet sich.
  10. Wählen Sie einen Parameter, dh, das Volumen oder Fläche. Klicken Sie auf OK. Die Daten werden in einer Tabelle angezeigt.
  11. Um die Daten klicken Sie auf das Menü Messung zu speichern und wählen Machen Mess Artikel.
  12. Wählen Sie einen neuen Messpunkt aus dem geöffneten Fenster aufgerufen. Dann geben Sie einen Namen ein, um die Daten und klicken Sie auf OK.
  13. Schließlich exportieren Sie die Daten der Statistik-Software wie Graph Pad oder Excel-Programm. Verwenden Sie t-Test, um die Daten zu analysieren, dann zeichnen 2D grAPHS.

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Representative Results

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Dieser Abschnitt enthält einige Beispiele für die qualitative und quantitative Beobachtungen 3D morphometrische Analyse hergestellt. Die vollständigen Ergebnisse aller 12 zuvor genannten Parameter finden Sie in unserer früheren Veröffentlichung 10.

Qualitative Beobachtungen

Astrozyten zeigten dünne oder dicke Äste, die in der Regel in 1-40 injizierten Ratten (Abbildung 1) lang waren. Einige kleine sternförmigen Astrozyten mit kurzen Verzweigungen in der Großhirnrinde beobachtet, und ein dichtes Netz von Astrozyten aufgetreten im Corpus callosum.

Astrozyten im Gehirngewebe von Tieren mit 1-40 -Injektion gefolgt von Genistein Behandlung zeigte eine sternförmige Form mit kurzen und dünnen Zweigen (2) 10. Ein paar Astrozyten zeigten eine atrophische Aussehen.

Astrocyte Dichte und GFAP +Fluoreszenzintensität

Die mittlere Anzahl von Astrozyten / 1.000 & mgr; m 2 war signifikant höher als bei Ratten, die mit 1-40 -Injektion im Vergleich mit Tieren in 1-40 -Injektion und Genistein behandelten Gruppe (P <0,0001). Darüber hinaus war die GFAP + Fluoreszenzintensität in dem Gehirn Schnitt deutlich niedriger Genistein Behandlung im Vergleich zu nicht behandelten 1-40 injizierten Tieren (Abbildung 3).

Morphometrische Analyse von Astrozyten Volume

Das Volumen des Astrozyten-Zellkern, Zellkörper, ganze Astrozyten und Astrozyten-Gebiet sank deutlich im Genistein Behandlungsgruppe im Vergleich zu unbehandelten Tieren. Dieses Ergebnis legt nahe, dass Genistein umging Astrogliose durch das Vorliegen von Amyloid (4A - D) verursacht.


Abbildung 1. Die konfokale Bild eines Astrozyten. Eine individuelle Astrozyten mit dicken und langen Zweigen (Pfeilspitze) und DAPI-markierten Nucleus (Pfeil) in einem Rattenhirn Hippocampus Injektion von 1-40 unterzogen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen dieser Figur.

Figur 2
Abbildung 2. Die konfokale Bild eines Astrozyten. Ein Astrozyten mit kurzen Zweigen (Pfeilspitze). In einem Rattenhirn unterworfen 1-40 -Injektion und Genistein Vorbehandlung durch eine Sonde verabreicht hippocampalen. P mieten klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. GFAP + Fluoreszenzintensität sank deutlich in Tieren mit einer β 1-40 -. Injektion, die Genistein Vorbehandlung empfangenen Werte sind Mittelwerte ± SEM. Fünfzig Astrozyten pro Tier wurden ausgewertet. P <0,05 wurde als signifikant angesehen, und T-Test wurde verwendet, um die Daten zwischen den Gruppen mit oder ohne Behandlung zu vergleichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 4. Das mittlere Volumen der Zellkern (A), Zellkörper (B), Astrozyten (einschließlich Niederlassungen, (C), und Gebiet (D) in Gehirnproben von Ratten, die 1-40 -Injektion unterzogen, mit oder ohne genommen Genistein Vorbehandlung. Genistein deutlich verbessert die Erweiterung der Zellkern, Zellkörper, den gesamten Astrozyten und Astrozyten-Gebiet (siehe Lit. 10). Die Werte sind Mittelwerte ± SEM. Fünfzig Astrozyten pro Tier wurden ausgewertet. P <0,05 wurde als signifikant angesehen, und T-Test wurde verwendet, um die Daten zwischen den Gruppen vor und nach der Behandlung zu vergleichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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In der aktuellen Protokoll beschäftigten wir 3D-konfokale Morphometrie zu 12 verschiedene Parameter, die mit Astrozytenmorphologie verbunden waren zu bewerten. Hierzu Hippocampusgewebe von Ratten mit 1-40 - induziert wurden Astrogliose, mit oder ohne Vorbehandlung Genistein als entzündungshemmendes Mittel verwendet. Durch Verwendung von 3D-Bildern und morphometrische Software, waren wir in der Lage, die Wirkung von Genistein auf Astrogliose dh der Morphologie von Astrozyten zeigen.

Änderungen in der intra- und extrazellulären Umgebung des Hirngewebes Volumen und / oder die Größe der Zellen / Gewebe verändern. Diese Veränderungen werden in verschiedenen Hirnverletzungen 3,11 als pathologischen Kennzeichen. Um diese Veränderungen zu quantifizieren wurde eine Reihe von Techniken verwendet werden. Die meisten Untersuchungen zur Verwendung von 2D-Bildern niedriger Auflösung durch Licht- oder Elektronenmikroskopie (EM) erfasst, die Informationen nur über einen kleinen Teil der CE-basiertenll. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde konfokale 3D Morphometrie auf hochauflösende Bilder 11 entwickelt. Ein weiterer Vorteil der konfokalen Mikroskopie ist, daß die Architektur einer Zelle untersucht, da mehrere aufeinanderfolgende 2D-Bilder erhalten werden, während Z-Stapel-Bildgebung durchgeführt wird. Darüber hinaus wirft 3D Konfokalmikroskopie die Möglichkeit, die Qualität der Bilder durch Filterung Hintergrundrauschen 11 verbessern.

Das hier vorgestellte Verfahren ist zeitaufwendig; wobei Z-Stapel Bilder mit einem konfokalen Mikroskop nimmt mehrere Minuten für jede einzelne Zelle. Darüber hinaus manuell Kennzeichnung eine Struktur, in der Software erfordert einige Übung, und die Forscher müssen auf die Zeichnung mehrmals zu wiederholen, um sicherzustellen, dass die Struktur korrekt gekennzeichnet. Es sollte erwähnt werden, dass der 'Magic' Registerkarte im 3D-Bildanalyse-Software wie Volocity, kann verwendet werden, um automatisch markieren Sie alle DAPI-gefärbten Zellkernen in einem einzigen Bild. Diese Option kann verwendet werden, wennAstrozyten kultiviert. Die Gehirnschnitte enthalten jedoch nicht nur Astrozyten aber auch viele andere Zellen wie Neuronen und Mikroglia. Dies bedeutet, dass viele der DAPI-gefärbten Zellkernen nicht Astrozyten gehören. Die mit Astrozyten assoziiert Kerne sollten manuell mit Bildern, die sowohl DAPI-markierten Kerne und GFAP-immunreaktive Astrozyten markiert werden.

In diesem Protokoll werden Antikörper gegen GFAP wurden verwendet, um Astrozyten in Paraffin-Schnitten zu visualisieren. Astrocyten können auch mit anderen Antigenen 12,13 oder transgenen Mäusen visualisiert werden. Die Ermittler sollten sich bewusst Grenzen der Methoden, und verwenden Sie die bestmögliche Versuchsplanung auf der Grundlage ihrer Ziele. Die Begrenzung der Verwendung von Antikörpern gegen GFAP, zum Beispiel, dass nur 10-15% des Zytoskeletts detektiert werden kann. Diese Beschränkung kann jedoch einen Vorteil bei der Untersuchung Astrogliose werden; der Anstieg Anzahl der Astrozyten und ein dichtes Netz von Niederlassungen Astrozyten 'in sotrogliosis kann es schwierig machen, eine einzelne Zelle zu identifizieren, wenn eine größere Fläche der Zelle erkannt wird. Obwohl dieses Protokoll beschreibt die Quantifizierung von 12 verschiedenen Parametern, aber die Ermittler können Sie diejenigen, die ihr Ziel gerecht zu wählen. Nach unserer Erfahrung können die Messungen aller Parameter wertvolle Informationen über die Parameter, die wesentlich in einem bestimmten Zustand oder durch eine Behandlung nicht beeinflusst werden zu ergeben. Die Quantifizierungsmethode für 3D-Bilder in der konfokalen Mikroskop erfasst geführt können auch auf Gefrierschnitten durchgeführt werden. Das Problem ist, die Proben (Fixierung, Dehydrierung, Einbetten und Schneiden) in einer ähnlichen Weise zu behandeln, da diese Schritte, um Schrumpfung oder Schwellung des Gewebes führen.

Abschließend 3D konfokale Abbildung, in Kombination mit morphometrische Software macht es möglich, mehrere Parameter mit der Morphologie der Zelle zu quantifizieren. Das Protokoll wir hier präsentierten zur Auswertung von morphologischen chan verwendet werdenges in einer Zelle angezeigt werden, in verschiedenen pathologischen Zuständen oder als Effekt eines Interventionsstrategie.

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Disclosures

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem County Council von Östergötland, (Schweden) und der Cellular and Molecular Research Center an der Iran University of Medical Sciences (Teheran, Iran) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amyloid beta 1-40 Sigma Aldrich 79793 Keep in -70 °C
Genistein Sigma Aldrich 446-72-0 keep in -20 °C
polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein DAKO Z0334
alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies DAKO
Liquid Permanent Chromogen DAKO K0640
Liquid permanent Red Substrate Buffer DAKO K0640
Cremophor EL Sigma Aldrich 27963 Polyethoxylated castor oil - Step 1.1
LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy Carl Zeiss
Volocity 6.3 Perkin Elmer Inc.,
Image Analysis 2000 Tekno Optic
Streotaxic apparatus Stoelting
Graph pad Prism 5 Graph pad software Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Cite this Article

Bagheri, M., Rezakhani, A., Roghani, M., Joghataei, M. T., Mohseni, S. Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes. J. Vis. Exp. (106), e53113, doi:10.3791/53113 (2015).More

Bagheri, M., Rezakhani, A., Roghani, M., Joghataei, M. T., Mohseni, S. Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes. J. Vis. Exp. (106), e53113, doi:10.3791/53113 (2015).

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