Abstract
Иннервация играет ключевую роль в разработке, гомеостаза и регенерации органов и тканей. Тем не менее, механизмы, лежащие в основе этих явлений не хорошо, но понял. В частности, роль в развитии иннервации зубов и регенерации пренебречь.
Несколько в естественных исследований получены важные сведения о закономерностях иннервации тканей зубов во время развития и ремонтных процессов различных животных моделях. Тем не менее, большинство из этих подходов не являются оптимальными для выделения молекулярную основу взаимодействий между нервными волокнами и контрольных органов и тканей.
Co-культуры представляют собой ценный метод для исследования и манипулирования взаимодействия между нервными волокнами и зубов в контролируемой и изолированной среде. В последние десятилетия, обычные совместных культурах, используя тот же культуральную среду были проведены в течение очень коротких периодов (например, два дня)исследовать привлекательные или отталкивающие эффекты развивающихся устные и зубные ткани на сенсорных нервных волокон. Тем не менее, продление срока культуры, необходимых для расследования последствий иннервации на зуб морфогенеза и дифференцировки клеток.
Microfluidics системы позволяют совместное культивирование нейронов и различных типов клеток в их соответствующей культуральной среде. Недавно мы показали, что тройничного ганглиев (ТГ) и зубы способны выживать в течение длительного периода времени при совместном культивировании в микрожидкостных устройств, и что они поддерживают в этих условиях тот же шаблон иннервации, что они показывают в естественных условиях.
На этой основе, мы опишем, как изолировать и совместное культивирование развития тройничного ганглиев и зубные бактерии в протоколе микрофлюидных сокультуры system.This описывает простой и гибкий способ совместного культивирования ганглиев / нервы и ткани-мишени и изучать роли специфических молекул на таких взаимодействий в Controlled и изолированная среда.
Introduction
Иннервация играет ключевую роль в разработке, гомеостаза и регенерации органов и тканей 1,2. Кроме того, иннервации участвует в регуляции пролиферации стволовых клеток, мобилизации и дифференциации 3 - 5. Действительно, недавние исследования, реализованные в тканях орофациального комплекса показали, что парасимпатических нервов являются необходимыми для функции эпителия клеток-предшественников во время развития и регенерации слюнных желез 6,7. Точно так же было показано, что иннервация необходимо для развития и поддержания вкусовых рецепторов 8 - 11. Таким образом, важно, чтобы проанализировать еще пренебрегают роли иннервации в развитии других важных орофациальных органов и тканей, таких как зубы.
Несмотря на богатой иннервации взрослых зубов, и в отличие от всех других органов и тканей тела, Develoзубы пинг начинают иннервируются на самых ранних стадиях постнатального. Зубы развиваются в результате последовательных и взаимных взаимодействий между ротовой эктодермы и черепной нервного гребня полученных мезенхимы. Эти взаимодействия приводят к эпителиальным полученных ameloblasts и мезенхимы, полученных одонтобластами, которые отвечают за формирование эмали и дентина, соответственно 12. Сенсорные нервы от тройничного ганглиев и симпатических нервов от верхнего шейного ганглия иннервируют взрослые зубы 13 - 15. В процессе эмбриогенеза, нервные волокна, исходящие из тройничного ганглиев проекта к проявляющему зубных зачатков и постепенно окружают их, но они не проникают в зубной сосочек мезенхимы 13. Нервные волокна входят зубной пульпы мезенхиму на более продвинутых стадиях развития, которые коррелируют с одонтобласт дифференцировки и дентин матрицы осаждения 16. Стоматологическая иннервации мякоть сбореeted вскоре после прорезывания зубов в полости рта 13. Предыдущие исследования показали, что различные Semaphorins и нейротрофины участвуют в регуляции иннервации во одонтогенеза 16 - 19. Более ранние исследования ясно показали, что иннервация предпосылкой для формирования зубов у рыб 20. Более поздние исследования показали, что гомеостаз стоматологическая мезенхимового стволовых клеток в резцах мыши регулируется с помощью сенсорных нервов секреции звуковой еж (тсс) 21. Тем не менее, роль иннервации зубов инициации, развития и регенерации еще весьма спорным у млекопитающих 22 - 24.
Множество естественных условиях исследования в дали важную информацию о закономерностях иннервации тканей зубов во время развития и ремонтных процессов различных животных моделях 13,25,26. Тем не менее, большинство из них APPROболи не являются оптимальными, чтобы выделить молекулярные основы взаимодействий между нервными волокнами и целевых органов и тканей. Co-культуры представляют собой ценный метод для исследования и манипулирования взаимодействия между нервными волокнами и зубов в контролируемой и изолированной среде 26 - 29. В то же время, сокультивирования подлежит различных технических корректировок. Например, нервов и конкретных зубных тканей (например, зубной пульпы, стоматологические фолликул, стоматологические эпителия) часто требуют различных питательных сред для того, чтобы гарантировать выживание ткани в течение длительных периодов времени 30 - 32.
В последние десятилетия, обычные сокультурах, используя тот же питательную среду были проведены в течение очень коротких периодов (например, два дня), чтобы исследовать привлекательные или отталкивающие эффекты развивающихся устные и зубные ткани на сенсорных нервных волокон 27 - 29.Тем не менее, продление срока культуры, необходимых для расследования последствий иннервации на зуб морфогенеза и дифференцировки клеток, и для изучения динамики нервных волокон ветвящихся в органах-мишенях. Таким образом, несмежных сокультурах бы быть более подходящим для выполнения исследований по нейронных-зубных тканей взаимодействий.
Microfluidics системы позволяют совместное культивирование нейронов и различных типов клеток в их соответствующей культуральной среде. В этих устройствах, зубные ткани и нейроны разделены в различных отсеках, позволяя при этом рост аксонов от нервных клеток органов через микроканалы в сторону отсека, содержащего их ткани-мишени 33. Микрофлюидных устройства уже используются для изучения взаимодействий между нейронами и микроглии 34,35, а также клетки к клетке взаимодействий при раке и неоваскуляризации 35. Кроме того, эти системы были использованы для изучения взаимодействия между дверьмиаль ганглии и остеобласты 36.
Мы недавно показали, что невралгия тройничного ганглиев (ТГ) и зубы могут выжить в течение длительных периодов времени при совместном культивировании в микрофлюидных устройств 37. Кроме того, мы показали, что зубы из разных стадиях развития поддерживать в этих условиях в пробирке же отталкивания или притяжения эффектов на тройничного иннервации, что они показывают в естественных условиях 37. Этот протокол предоставляет информацию о простой, но мощный и гибкий способ совместного культивирования ганглиев / нервов и тканей-мишеней и изучения роли специфических молекул на таких взаимодействий в управляемой и изолированной среде.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все мыши были сохранены и обработаны в соответствии с Законом швейцарской защиты животных и в соответствии с правилами офисе Кантональная ветеринарной, Цюрих.
1. Подготовка вскрытия Материал, медиакультуры, микрофлюидных устройств
- Автоклав микро-рассечение пинцет и ножницы (121 ° С, время стерилизации: 20 мин) и хранят их в стерильный контейнер.
- Стерилизовать покровные стекла (24 мм х 24 мм), при инкубировании их в 1 М HCl в течение 24 ч на орбитальном шейкере при 37 ° С. Вымойте их три раза стерильной дистиллированной H 2 O и три раза с этанолом 99%. Сухой затем покровные при 37 ° С или в стерильных капотом потока. Наконец, автоклав и не подвергайте покровные в УФ-свете (30 мин), чтобы завершить стерилизацию. Покровные затем могут быть сохранены в 70% этаноле.
- Удалить внимательно устройств AXIS Изоляция Axon из пакета с помощью стерильного пинцета и положите их в стерильную чашку Петри. Используя стерильный биопсии удар (Ø: 1 мм) создают одно отверстие за образец для культивируют (рис 1) в соответствие с культурой камер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не ударить слишком близко к микродорожек, так как они могут быть повреждены приложенного давления. - Стерилизовать устройств AXIS Изоляция Axon по immerging их в этанол 70%. Сухие затем AXIS Axon Устройства изоляции и покровные полностью под капотом стерильной потока. Подождите минимум 3 часа, прежде чем продолжить.
ПРИМЕЧАНИЕ: неполное сушки приведет к дефектной сборки микрофлюидных устройств. - Поместите каждую покровное в 35 мм чашки Петри или в хорошо в 6-скважин пластины.
- Поместите устройство изоляции AXIS Axon на покровное и нажмите мягко, но твердо с пинцета с изогнутыми концами, чтобы обеспечить полный адгезии между устройством изоляции и покровного стекла.
- В каждой культуре камеры, пипетки 150 мкл поли-D-лизином (0,1 мг / мл в стерильной дистиллированной H 2О). Поместите микрожидкостных устройства под вакуумом в течение 5 мин, чтобы удалить весь воздух из культуральных камерах.
- Если воздух все еще можно увидеть в камерах, повторного пипетки в поли-D-лизин раствора в камерах.
- Инкубируйте устройства с поли-D-лизином O / N при 37 ° С.
- Вымойте камерах три раза стерильной дистиллированной H 2 O.
- Заполните камеры с 150 мкл рабочего раствора ламинин (Sigma-Aldrich, 5 мкг / мл, в PBS или бессывороточной среде), и инкубируют O / N при 37 ° С.
- Подготовка 50 мл среды для культур тройничного ганглиев 37, состоит в следующем: 48 мл среды Neurobasal, 1 мл В-27, 100 ед / мл пенициллина / стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 5 нг / мл фактора роста нервов (NGF) , 12:25 вечера цитозинарабинозид.
- Подготовка 50 мл среды для культур зубного зачатка 37, состоит в следующем: 40 мл DMEM-F12, 10 мл фетальной бычьей сыворотки (ФБС, конечная концентрация: 20%), 100 ед / мл пенициллина / стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 150 мкг / мл аскорбиновой кислоты.
2. эмбриона мыши Генерация и Препарирование
- Определить возраст эмбриона в соответствии с влагалища плагина (вагинального пробки: эмбриональные день развития 0.5, E0.5) и подтвердите его с помощью морфологических критериев. Для этого протокола, мы обычно используем эмбрионов E14.5 E17.5-мыши.
- Очистите область рассечение и стереоскоп с этанолом 70%.
- Жертвоприношение беременная мать с помощью шейных позвонков. Блок шею мыши с первым и вторым пальцем на сетке, и тянуть с решением хвоста.
- Проанализируйте кожу вокруг нижней части живота, и открыть живот с помощью ножниц. Найдите матку: в таких поздних стадиях беременности, матка обильно заполнить брюшную полость.
- Рассеките из матки и место в трубку, заполненную PBS на льду. Когда на льду, ткань может быть оставлена в течение нескольких часов. Откажитесь труп матери в соответствии с ведомственным руководящим принципам <LI> Рассеките из эмбрионов из матки и освободить их от внезародышевых тканей. Поместите эмбрионов в PBS на льду.
- Обезглавьте эмбрионов с помощью ножниц и отделить нижнюю челюсть от остальной части головы с помощью микро-рассечение ножницами (фиг.2А). Удалить именно нижнюю челюсть, не повреждая тройничного ганглиев; так как последний локализованы в непосредственной близости от нижней челюсти, их случайное повреждение возможно. Заповедник нижнюю челюсть и остальную часть головы в холодную PBS, на льду.
- Рассекать TG, взять голову и поместите его на вскрытие стеклянную чашку Петри, ранее заполненной холодной PBS. Используя пинцет, удалите кожу и череп. Удалить тогда мозге и мозжечке путем размещения щипцы ниже мозге и лифтом; конечный мозг и мозжечок щелкнет вместе, из нижней части черепа воздействию.
- Локализация тройничного ганглиев (как показано на рисунке 2, б). Используйте пинцетотделить TG от тройничного нервов. Устранить остатки тройничного прогнозов с использованием рассечение иглы, как ножи. Поместите расчлененный TG в чашке Петри, наполненной холодной PBS и держать их на льду.
- Препарировать зубы эмбриональные, поместите нижнюю челюсть, ранее отделенной от черепа, на рассечение стеклянную чашку Петри, наполненную холодной PBS. Использование рассечение иглы, как ножи, удалить язык и кожу вокруг челюсти. Отделите левую и правую Hemi-челюсти путем разрезания вдоль средней линии челюсти. В зубные зачатки хорошо видны, как показано на рисунке 1С. Изолировать зуб микробов, используя рассечение иглы и удалить избыток не зубных тканей. Поместите расчлененный зубных зачатков в чашке Петри, наполненной холодной PBS и держать их на льду.
3. микрофлюидных Co-культуры
- После вскрытия, удаления ламинин от микрофлюидных устройств. Заполните камеры с 200 мкл respectiве СМИ.
- С пинцетом, аккуратно перенести на рассеченных TG и зубные бактерии в отверстия, созданных путем штамповки (рис 1D). Убедитесь, что зубные зачатки не плавают, и что они тонут, пока они не упрутся в покровные.
- Культура образцы в инкубаторе при 37 ° С, 5% СО 2.
- Изменить культуральной среде каждые 48 ч. Не допускать камер полностью, а не пипетки непосредственно в камерах культуры. Полное опорожнение камер приведет к образованию пузырьков воздуха в камерах; Прямая пипетки в камере может привести к повреждению аксонов. Чтобы избежать этих проблем, удалить носитель, указывающий пипетку к внешней стороне скважин; Аналогично, пипетки свежую среду на стороне скважин, расположенных напротив камер.
- Во время периода культивирования, со-культуры могут быть легко отображены в покадровой микроскопии. Co-культуры может поддерживаться в течение более 10 дней.
- После культивирования пародонтад, мыть камеры с помощью пипетки 150 мкл PBS в одну лунку на камеру, и позволяя проходить через PBS камер три раза.
- Снимите PBS и исправить образцы с помощью пипетки 150 мкл параформальдегида 4% (в PBS) в одной скважине на камеру; инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Вымойте камеры дважды PBS, как описано в 3.6.
- Продолжить дальнейшего анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эти результаты показывают, что изолированные тройничного ганглиев может расти в одном отсеке микрожидкостных устройств и, кроме того, что развитие изолированных зубных зачатков выдержан в течение длительного периода времени в другой отсек микрожидкостных устройств. Различные питательные среды используются в двух отсеках, а микродорожек между двумя отсеками позволяют расширение аксона от ганглий тройничного нерва к проявляющему зубных зачатков. Фиг.3 представляет собой визуализацию с помощью иммунофлюоресценции нейрофиламентов 37, в совместной культуре мыши эмбриональных ганглий тройничного нерва и мышиных эмбриональных резец в описанном микрофлюидного системы сокультуры. Резцы мыши не иннервируются во время развития в естественных условиях;. Последовательно, аксоны от тройничного ганглия отменены развивающихся зубного зачатка в культуре для целых 10 дней 3А показывает обзор аксонов камеры в этом совместно культуры система. 3В и 3С шоу прогрессивные увеличениях невриты внутри аксонов камер и микро-рощами. Зубные бактерии (или любых совместных культурах органов или тканей) могут быть легко удалены из микрожидкостных устройств и анализировали отдельно, например, обработаны для гистологического окрашивания или для анализа экспрессии генов.
Рисунок 1. Просмотров конной Микрожидкостных сокультуры устройства (A) сверху; . (Б) частично боковая Культуральные камеры (см) выделены красным цветом (эозином) и голубой (синий толуидина); микродорожек (мг) можно рассматривать в виде белой линии между камерами культуры. Ганглиев и совместно культивировали органы / ткани помещают в соответствующей культуральной камере с помощью перфорированных отверстий (Ph) в устройстве. Добавляют СМИ и удаляется с помощью скважин (MW). "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53114/53114fig1large.jpg" цель = "_ пустое"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. () вид сбоку мыши эмбриона головы (эмбриональный день развития E14.5). Черная линия показывает, где нижняя челюсть должны быть сокращены для того, чтобы сохранить целостность обеих тройничного ганглиев и зубных микробов. Эмбрион головы (B), мышь (E14.5) после удаления нижней челюсти, черепа и мозге. Черные стрелки указывают тройничного ганглиев (TG). (С) нижней челюсти эмбриона мыши (E14.5) после удаления языка. Черные стрелки указывают на локализацию различных зубных зачатков (включая: резцов; FM: первых моляров). (D) Схематическое представление микрожидкостных устройств совместным культивированием.p_upload / 53114 / 53114fig3large.jpg "цель =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Совместное культивирование тройничного ганглия и зародыша зуба резец из дикого типа эмбрионов E15.5 мыши. () Обзор аксонов камеры (нейрофиламентов, DAPI). Масштабная линейка: 300 мкм. (Б) Высшее увеличения из микродорожек и невриты растущих аксонов в камере (нейрофиламентов, DAPI; суперпозиция люминесцентных и светлого изображения). Масштабная линейка: 150 мкм. (С) большее увеличение, показывая рост аксонов в пределах микродорожек (нейрофиламентов). Масштабная линейка:. 75 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Предыдущая в пробирке исследования зубной иннервации были основаны на обычных сокультурах тройничного ганглиев и зубных тканей или клеток 26,28,29. Эти исследования были проведены, чтобы исследовать в основном привлекательные эффекты этих клеток или тканей на сенсорных аксонов 38. Хотя чего значительные достижения в этой области, несколько технических вопросов, были подняты. Зубные зачатки начинают вырождаться после нескольких дней культуры 37. На основании этих наблюдений, растущие нейроны и зубы в тех же условиях культивирования ухудшают любого возможного анализ молекул, участвующих в перекрестных помех между этими двумя тканями. Оптимальные условия культивирования необходимы для сохранения физиологического молекулярного профиля тройничного ганглиев и зубных тканей.
Microfluidics системы были использованы до сих пор совместное культивирование нейронов и различные типы клеток в оптимизированных средах 34,36. Эта система может представлять микрофлюидики больше верыполностью ситуация в естественных условиях, где нейронные органы клеток, аксонов терминалов и ткани-мишени, как правило, подвержены различным клеточных и молекулярных микросреды. Совсем недавно, Microfluidics устройства были использованы для совместного культивирования весь ганглии задних корешков и остеобласты 36. Мы недавно показали, что невралгия тройничного ганглиев и зубы могут выжить в течение длительных периодов времени при совместном культивировании в микрофлюидных устройств 37. Кроме того, мы показали, что зубы из разных стадиях развития поддерживать в этих условиях в пробирке же отталкивания или притяжения эффектов на тройничного иннервации, что они выставлены в естественных условиях 37.
Протокол, описанный требует практики и ловкость, в частности для микродиссекции тройничного ганглиев и зубных микробов. Тригеминальные ганглии легко рвутся во время вскрытия. Таким образом, мы предлагаем использовать рассечение иглы вместо вскрытия силуPS, чтобы удалить ткань, окружающую ганглиев. Аналогичным образом, особое внимание должно быть принято во время рассечения зубных зачатков, во избежание повреждения эпителия зуба при отделении его от окружающих мезенхимальных тканей. Кроме того, в первый день совместного культивирования, особое внимание должно быть принято в обработку инкубатора, а чрезмерная вибрация может повредить тройничного ганглия адгезию к культуральной покровное. В течение периода со-культуры, средства массовой информации должны быть удалены и добавлена с помощью пипетки в лунки, на стороне, противоположной к культуре камер. Начинающих и дозировочные носитель в непосредственной близости от культуры камер бы привести к повреждению аксонов.
Протокол, описанный может быть изменен, чтобы изучить иннервации нескольких эмбриональных органов и эмбриональных или постнатальных тканей и клеточных типов. Microfluidics системы могут представлять собой подходящую платформу, чтобы длительные периоды культуры для изучения взаимодействий между нейронами и растущей тройникй. Кроме того, разделение нейронов от зубной отсека позволяет анализировать последствия конкретных локализации белка и количественного 33,37. Блокирующие антитела или рекомбинантные белки также могут быть добавлены в отдельных отсеках микрофлюидики устройств для анализа их влияния на нейронные и зубных тканей. Например, лечение невралгии тройничного ганглиев с NGF поддерживает их выживание и позволяет нейронов вырост. Однако в этой работе экзогенные NGF отсутствует из зубного зачатка отсек, где сигналы зубные полученный являются только отвечает за нейронной притяжения или отталкивания. Аналогичным образом, другие рекомбинантные молекулы, антитела или препараты могут быть использованы, чтобы управлять системой в контролируемых условиях.
Основными ограничения протокола, представленного находиться в относительно высокой стоимости коммерческих микрофлюидных устройств и существенно 2D-наладка системы сокультуры. В самом деле, хотя целые органы могут быть культурад, оба органа и аксоны растут в 2D-прилипшие условиях культивирования на покровного стекла; настройка системы будут необходимы для того, чтобы получить трехмерную, реалистичное представление иннервации.
В заключение, микрофлюидных устройства являются оптимальными для исследования роли иннервации в развитии или регенерации органов и разрешить изучение взаимодействий между нейронными и тканях в оптимальных условиях культивирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AXIS Axon Isolation Devices | Millipore | AX15010-TC | Microchannels of different lenght are available |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504 | |
| Recombinant Mouse beta-NGF | R&D Systems | 1156-NG-100 | Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 |
References
- Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 71, 2241-2251 (2014).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
- Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 552-565 (2011).
- Katayama, Y., Battista, M., et al. Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egress from bone marrow. Cell. 124 (2), 407-421 (2006).
- Fitch, S. R., Kimber, G. M., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell stem cell. 11 (4), 554-566 (2012).
- Knox, S. M., Lombaert, I. M. a, Reed, X., Vitale-Cross, L., Gutkind, J. S., Hoffman, M. P. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. Science(New York, N.Y.). 329 (5999), 1645-1647 (2010).
- Knox, S. M., Lombaert, I. M. A., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nature communications. 4, 1494 (2013).
- Oakley, B., Witt, M. Building sensory receptors on the tongue. Journal of neurocytology. 33 (6), 631-646 (2004).
- Oakley, B., Brandemihl, A., Cooper, D., Lau, D., Lawton, A., Zhang, C. The morphogenesis of mouse vallate gustatory epithelium and taste buds requires BDNF-dependent taste neurons. Brain research. Developmental brain research. 105 (1), 85-96 (1998).
- Sun, H., Oakley, B. Development of anterior gustatory epithelia in the palate and tongue requires epidermal growth factor receptor. Developmental biology. 242 (1), 31-43 (2002).
- Mistretta, C. M., Goosens, K. a, Farinas, I., Reichardt, L. F. Alterations in size, number, and morphology of gustatory papillae and taste buds in BDNF null mutant mice demonstrate neural dependence of developing taste organs. The Journal of comparative neurology. 409 (1), 13-24 (1999).
- Mitsiadis, T. a, Graf, D. Cell fate determination during tooth development and regeneration. Birth defects research. Part C, Embryo today reviews. 87 (3), 199-211 (2009).
- Mohamed, S. S., Atkinson, M. E. A histological study of the innervation of developing mouse teeth. Journal of anatomy. 136 (Pt 4), 735-749 (1983).
- Luukko, K. Immunohistochemical localization of nerve fibres during development of embryonic rat molar using peripherin and protein gene product 9.5 antibodies. Archives of oral biology. 42 (3), 189-195 (1997).
- Johnsen, D. Innervation of teeth: qualitative, quantitative, and developmental assessment. Journal of dental research. 64, 555-563 (1985).
- Mitsiadis, T. a, Dicou, E., Joffre, A., Magloire, H. Immunohistochemical localization of nerve growth factor (NGF) and NGF receptor (NGF-R) in the developing first molar tooth of the rat. Differentiation; research in biological diversity. 49 (1), 47-61 (1992).
- Mitsiadis, T. a, Luukko, K. Neurotrophins in odontogenesis. The International journal of developmental biology. 39 (1), 0214-6282 (1995).
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation; research in biological diversity. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kettunen, P., Løes, S., et al. Coordination of trigeminal axon navigation and patterning with tooth organ formation: epithelial-mesenchymal interactions and epithelial Wnt4 and Tgfbeta1 regulate semaphorin 3a expression in the dental mesenchyme. Development (Cambridge, England). 132 (2), 323-334 (2005).
- Tuisku, F., Hildebrand, C. Evidence for a neural influence on tooth germ generation in a polyphyodont species. Developmental biology. 165, 1-9 (1994).
- Zhao, H., Feng, J., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell stem cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Kettunen, P., Kvinnsland, H., Luukko, K. Mouse rudimentary diastema tooth primordia are devoid of peripheral nerve fibers. Anatomy and embryology. 205 (3), 187-191 (2002).
- Lumsend, A., Buchanan, J. An experimental study of timing and topography of early tooth development in the mouse embryo. Archives of oral biology. , 301-311 (1986).
- Kollar, E., Lumsend, A. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de Biologia Buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
- Luukko, K., Kettunen, P. Coordination of tooth morphogenesis and neuronal development through tissue interactions: lessons from mouse models. Experimental cell research. 325 (2), 72-77 (2014).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
- Lumsend, A., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323 (9), 538-539 (1986).
- Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience letters. 308 (3), 161-164 (2001).
- Petrinovic, M. M., Duncan, C. S., et al. Neuronal Nogo-A regulates neurite fasciculation, branching and extension in the developing nervous system. Development(Cambridge, England). 137 (15), 2539-2550 (2010).
- Otsu, K., Fujiwara, N., Harada, H. Odontogenesis. Methods in Molecular Biology. 887, (2012).
- Mitsiadis, T. a, Drouin, J. Deletion of the Pitx1 genomic locus affects mandibular tooth morphogenesis and expression of the Barx1 and Tbx1 genes. Developmental biology. 313 (2), 887-896 (2008).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Hosmane, S., Tegenge, M. A., et al. Toll/interleukin-1 receptor domain-containing adapter inducing interferon-β mediates microglial phagocytosis of degenerating axons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7745-7757 (2012).
- Delamarche, E., Tonna, N., Lovchik, R. D., Bianco, F., Matteoli, M. Pharmacology on microfluidics: multimodal analysis for studying celll-cell interaction. Current opinion in pharmacology. 13 (5), 821-828 (2013).
- Neto, E., Alves, C. J., et al. Sensory neurons and osteoblasts: close partners in a microfluidic environment. Integrative Biology. , (2014).
- Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in physiology. 5 (August), (2014).
- Connor, R., Tessier-Lavigne, M. Identification of maxillary factor, a maxillary process-derived chemoattractant for developing trigeminal sensory axons. Neuron. 24, 165-178 (1999).
