Abstract
Innervering spiller en nøkkelrolle i utviklingen, homeostase og regenerering av organer og vev. Imidlertid er mekanismene bak disse fenomenene ikke godt forstått enda. Spesielt er rollen til innervasjon i tannutvikling og regenerering neglisjert.
Flere in vivo studier har gitt viktig informasjon om mønstre av innervasjon av tannvevet under utvikling og reparasjonsprosesser i ulike dyremodeller. Men de fleste av disse metodene er ikke optimalt å markere det molekylære grunnlaget for samspillet mellom nervefibrene og målet organer og vev.
Ko-kulturer utgjør en verdifull metode for å undersøke og manipulere samspillet mellom nervefibre og tenner i et kontrollert miljø, og isolert. I løpet av de siste tiårene har konvensjonelle ko-kulturer ved å bruke det samme dyrkningsmedium blitt utført for meget korte perioder (for eksempel to dager)å undersøke de attraktive eller frastøtende effekten av å utvikle muntlig og dental vev på sensoriske nervefibre. Imidlertid forlengelse av dyrkningsperioden er nødvendig for å undersøke effektene av innervasjon på tann morfogenese og cytodifferentiation.
Microfluidics systemer tillater co-kulturer av nevroner og ulike celletyper i sitt riktige dyrkingsmedier. Vi har nylig vist at trigeminal ganglia (TG), og tennene er i stand til å overleve i en lang tidsperiode når ko-dyrket i microfluidic anordninger, og at de opprettholder i slike forhold er det samme innervasjonen mønster som de viser in vivo.
På bakgrunn av dette vil vi beskrive hvordan å isolere og co-kulturen utvikler trigeminusgangliene og tann bakterier i en mikrofluid co-kultur system.This protokollen beskriver en enkel og fleksibel måte å co-kultur ganglia / nerver og målet vev og å studere roller av spesifikke molekyler på slike interaksjoner i en kontrolled og isolert miljø.
Introduction
Innervering spiller en nøkkelrolle i utviklingen, homeostase og regenerering av organer og vev 1,2. Videre er innervasjon involvert i reguleringen av stamcelleproliferasjon, mobilisering og differensiering 3-5. Faktisk har nyere studier realisert i vev av orofacial kompleks vist at parasympatiske nervene er nødvendig for epitel stamceller funksjon under utvikling og regenerering av spyttkjertlene 6,7. Tilsvarende har det blitt demonstrert at innervasjon er nødvendig for utvikling og opprettholdelse av smaksløkene 8-11. Derfor er det viktig å analysere, men neglisjert roller innervasjon i utviklingen av andre viktige Orofacial organer og vev, for eksempel tenner.
Til tross for den rike innervasjon av voksne tenner, og i motsetning til alle andre organer og vev i kroppen, utvikledeping tennene begynner å bli stimuleres tidligst postnatal etapper. Tennene utvikles som et resultat av sekvensielle og gjensidige samspillet mellom muntlig ektoderm og kranie neural crest-avledet mesenchyme. Disse interaksjonene gi opphav til epitel-avledet ameloblaster og mesenchyme-avledet odontoblaster som er ansvarlig for dannelsen av emalje og dentin, henholdsvis 12. Sensoriske nerver fra trigeminusgangliene og sympatiske nerver fra den overlegne cervical ganglia innerverer voksen tennene 13-15. Under embryogenesen nervefibre som kommer fra trigeminusgangliene prosjektet mot utviklings tann bakterier og gradvis omgir dem, men de har ikke trenge inn i tann papilla mesenchyme 13. Nervefibrene skriv tannpulpa mesenchyme på mer avanserte utviklingsstadier som korrelerer med odontoblast differensiering og dentin matrise deponering 16. Tannpulpa innervasjon er kompleted snart etter tannfrembrudd i munnhulen 13. Tidligere studier har vist at ulike semaphorins og neurotrofiner er involvert i reguleringen av innervasjon under odontogenesis 16-19. Tidligere studier har klart vist at innervasjon er en forutsetning for tanndannelse i 20 fisker. Nyere studier har vist at homeostase av tann mesenchyme stamceller i mus fortenner er regulert av sensoriske nerver via sekresjon av Sonic pinnsvin (shh) 21. Likevel, er rollen til innervasjon i tann initiering, utvikling og fornyelse fortsatt svært kontroversielt i pattedyr 22-24.
En overflod av in vivo studier har gitt viktig informasjon om de mønstre av innervasjon av tannvevet under utvikling og reparasjonsprosesser i ulike dyremodeller 13,25,26. Men de fleste av disse APPROsmerter er ikke optimalt å markere det molekylære grunnlaget for samspillet mellom nervefibrene og målet organer og vev. Co-kulturer utgjør en verdifull metode for å undersøke og manipulere samspillet mellom nervefibrene og tenner på en kontrollert og isolert miljø 26 - 29. På samme tid, er co-dyrkning gjenstand for ulike tekniske tilpasninger. For eksempel, nerver og spesifikke dental vev (f.eks tannpulpa, dental follikkelen, dental epitel) krever ofte annerledes kultur media for å garantere vev overleve i lange perioder av gangen 30-32.
I de siste tiårene har vanlige co-kulturer som bruker samme dyrkingsmedium utført for svært korte perioder (f.eks, to dager) for å undersøke de attraktive eller frastøtende effekten av å utvikle muntlig og dental vev på sensoriske nervefibre 27-29.Imidlertid forlengelse av dyrkningsperioden er nødvendig for å undersøke effektene av innervasjon på tann morfogenese og cytodifferentiation, og for å studere dynamikken i nervefibrene forgrening i målorganer. Derfor vil ikke-sammenhengende ko-kulturer være mer egnet til å utføre studier på neuronal-tann vev interaksjoner.
Microfluidics systemer tillater co-kulturer av nevroner og ulike celletyper i sitt riktige dyrkingsmedier. I disse anordninger blir tann vev og nerveceller separert i forskjellige kamre, samtidig som den tillater veksten av aksoner fra nervecellelegemer gjennom mikrokanaler inn i rommet som inneholder deres målvev 33. Microfluidic enheter har allerede brukt til å studere samspillet mellom nevroner og mikroglia 34,35, samt celle til celle interaksjoner i kreft og neovascularization 35. Videre har disse systemene vært brukt for å studere interaksjoner mellom dorsal rotganglier og osteoblaster 36.
Vi har nylig vist at trigeminal ganglia (TG), og tennene er i stand til å overleve i lange perioder når ko-dyrket i 37 microfluidic enheter. Videre har vi vist at tennene fra ulike utviklingsstadier opprettholde i disse in vitro forholdene de samme frastøtende eller attraktive effekter på trigeminal innervation at de viser in vivo 37. Denne protokollen gir informasjon om en enkel, kraftig og fleksibel måte å co-kultur ganglia / nerver og målet vev og å studere rollene til spesifikke molekyler på slike interaksjoner i en kontrollert og isolert miljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus ble opprettholdt og håndtert i henhold til den sveitsiske Animal Welfare Law og i samsvar med bestemmelsene i Cantonal Veterinærkontor, Zürich.
1. Utarbeidelse av Dissection Material, Culture Media, mikrofluid Devices
- Autoclave mikro-disseksjon pinsett og saks (121 ° C, sterilisering tid: 20 min), og lagre dem i en steril beholder.
- Steriliser dekkglass (24 mm x 24 mm) ved å inkubere dem i 1 M HCl i 24 timer på en orbital-rystemaskin ved 37 ° C. Vask dem tre ganger med sterilt, destillert H2O og tre ganger med etanol 99%. Kles deretter glassene ved 37 ° C eller under sterile flyt hette. Til slutt, autoklav eller utsette glassene for UV-lys (30 min) for å fullføre steriliseringen. Dekkglass kan deretter lagres i etanol 70%.
- Fjern nøye AXIS Axon Isolation Enheter fra pakken med steril tang og plassere dem i en steril petriskål. Ved hjelp av en steril biopsi stempel (ø: 1 mm) oppretter en hull per prøve som skal dyrkes (figur 1) i samsvar med kulturkamrene.
MERK: Ikke slå for nær mikrorillene, så de kan bli skadet av trykket. - Sterilisere AXIS Axon Isolation enheter ved immerging dem i etanol 70%. Tørre deretter AXIS Axon Isolation Enheter og Dekk helt under en steril flyt hette. Vent minst tre timer før du fortsetter.
MERK: ufullstendig tørking vil resultere i mangelfull montering av microfluidic enhetene. - Plasser hver dekk inn en 35 mm petriskål eller i en brønn i en 6-brønner plate.
- Plasser AXIS Axon Isolation Device på dekkglass og trykk forsiktig, men bestemt med en tang med bøyde ender for å tillate full vedheft mellom isolasjon enheten og dekkglass.
- I hvert kulturkammer, pipette 150 ul av poly-D-lysin (0,1 mg / ml i sterilt, destillert H 2O). Plasser microfluidic enheter under vakuum i 5 minutter, for å fjerne all luft fra dyrknings kamrene.
- Hvis luft kan fortsatt sees i kamrene, re-pipette poly-D-lysin løsning i kamrene.
- Inkuber enheter med poly-D-lysin-O / N ved 37 ° C.
- Vask kamre tre ganger med sterilt, destillert H 2 O.
- Fyll kamre med 150 ul laminin arbeidsløsning (Sigma-Aldrich, 5 ug / ml i PBS eller serumfritt medium), og inkuberes O / N ved 37 ° C.
- Forbered 50 ml medium for trigeminal ganglia kulturer 37, sammensatt som følger: 48 ml Neurobasal medium, 1 ml B-27, 100 U / ml penicillin / streptomycin, 2 mM L-glutamin, 5 ng / ml nervevekstfaktor (NGF) , 12:25 cytosinarabinosid.
- Forbered 50 ml medium for bakteriekulturer tann 37, sammensatt som følger: 40 ml DMEM-F12, 10 ml føtalt bovint serum (FBS, sluttkonsentrasjon: 20%), 100 U / ml penicillin / streptomycin, 2 mM L-glutamin, 150 ug / ml askorbinsyre.
2. Mouse Embryo Generation og Dissection
- Bestem embryonale alder i henhold til vaginal plug (vaginal plug: embryonale dag med utvikling 0,5, E0.5) og bekrefte det via morfologiske kriterier. For denne protokollen, vi vanligvis bruker E14.5-E17.5 mus embryoer.
- Rengjør disseksjon området og stereoskop med etanol 70%.
- Ofre den gravide moren via halsdislokasjon. Blokkere halsen av mus med den første og den andre finger inn i et rutenett, og trekker med avgjørelse halen.
- Dissekere huden rundt nedre del av magen, og åpner buken med saks. Finn livmoren: under slike sene stadier av svangerskapet, livmor klink fylle bukhulen.
- Dissekere ut livmoren og plasser i et rør fylt med PBS på is. Når du er på isen, kan vevet bli liggende i flere timer. Kast liket av moren i henhold til institusjonelle retningslinjer <li> Skjær ut embryoene fra livmor og fri dem fra deres extraembryonic vev. Plasser embryoene i PBS på is.
- Halshogge embryoene bruke saks, og skille underkjeven fra resten av hodet ved hjelp av mikro-disseksjon saks (Figur 2A). Fjern nettopp den nedre kjeve, uten å skade trigeminal ganglia; som det sistnevnte er lokalisert i umiddelbar nærhet til den nedre kjeve, er deres skader mulig. Bevar underkjeven og resten av hodet i kald PBS, på is.
- Å dissekere TG, ta hodet og plassere det på en disseksjon glass petriskål, tidligere fylt med kald PBS. Ved hjelp av pinsett, fjerne huden og hodeskallen. Fjern deretter telencephalon og lillehjernen ved å plassere tang under telencephalon og løft; den telencephalon og cerebellum vil vende sammen, forlater bunnen av skallen eksponert.
- Lokalisere trigeminal ganglia (vist i figur 2B). Bruk pinsettå skille TG fra trigeminal nerver. Eliminere restene av trigeminal anslag ved hjelp av disseksjon nåler som kniver. Plasser dissekert TG i en petriskål fylt med kald PBS og holde dem på is.
- Å dissekere embryonale tenner, plasserer underkjeven, tidligere skilt fra skallen, på disseksjon glass petriskål, fylt med kald PBS. Ved hjelp av disseksjon nåler som kniver, fjerner tungen og huden rundt kjeven. Separer venstre og høyre hemi-kjeft ved å kutte langs midtlinjen i kjeven. Tann bakterier er godt synlig, som vist i figur 1C. Isolere tann bakterier ved hjelp av disseksjon nåler og fjerne overskudd av ikke-dental vev. Plasser de dissekerte tann bakterier i en petriskål fylt med kald PBS og holde dem på is.
3. microfluidic Co-kulturer
- Etter disseksjon, fjerne laminin fra microfluidic enheter. Fylle kamrene med 200 ul av respektivve media.
- Med pinsett, overføre forsiktig de dissekerte TG og tann bakterier inn i hullene som er opprettet ved punching (figur 1D). Kontroller at tann bakteriene ikke flyte og at de synker før de kontakter glassene.
- Culture prøvene i inkubator ved 37 ° C, 5% CO2.
- Endre kulturen medium hver 48 time. Må ikke tømmes kamrene helt, og ikke pipette direkte inn i kultur kamre. Fullstendig tømming av kamrene vil resultere i dannelsen av luftbobler i kamrene; pipettering direkte inn i kammeret ville resultere i aksonal skade. For å unngå disse problemene, fjerner medium peker pipetten mot ytre side av brønner; Tilsvarende, pipette friskt medium på siden av de brønner som ligger motsatt til kamrene.
- I løpet av kultur perioden, kan co-kulturer være lett avbildes med time-lapse mikroskopi. Co-kulturer kan opprettholdes i over 10 dager.
- Etter kulturen period, vaskes kamrene ved pipettering av 150 ul PBS i en brønn pr kammer, og la PBS strømme gjennom kamrene tre ganger.
- Fjern PBS og fikse prøvene ved å pipettere 150 ul Paraformaldehyde 4% (i PBS) i en brønn per kammer; Inkuber ved RT i 15 min.
- Vask kamrene to ganger med PBS, som beskrevet i 3.6.
- Fortsett med videre analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Disse resultatene viser at isolerte trigeminal ganglia kan vokse i et kammer av den mikrofluidanordningen, og i tillegg, at utviklingen av de isolerte tann bakterier opprettholdes i en lengre periode i den annen avdeling av mikrofluidanordningen. Forskjellige kulturmedier blir brukt i de to kamrene, og mikrorillene mellom de to kamrene tillater forlengelse av axon fra trigeminal ganglion mot utviklingstann bakteriene. Figur 3 viser en visualisering av neurofilament via immunfluorescens 37, i en ko-kultur av en mus embryonale trigeminal ganglion og mus embryonale fortann i den beskrevne mikrofluid co-kultur system. Muse fortenner ikke stimuleres under utvikling in vivo;. Konsekvent, er axoner fra trigeminal ganglion opphevet av utviklings tann bakterie i kultur for så mye som 10 dager figur 3A viser en oversikt over aksonal kammeret i dette co-kultur system. 3B og 3C viser progressive forstørrelser av neuritter innenfor aksonale kamre og mikrolunder. Tann bakterier (eller noen co-kulturer organer eller vev) kan lett fjernes fra microfluidic enheter og analyseres separat for eksempel, behandlet for histologiske stainings eller genuttrykk analyse for.
Figur 1. Utsikt over montert microfluidic co-kultur enhet (A) fra ovenfor; . (B) delvis lateral Kultur kamre (cc) er uthevet i rødt (eosin) og blå (toluidinblått); mikrorillene (mg) kan ses på som en hvit linje mellom kulturkamrene. Ganglia og ko-dyrket organer / vev er plassert i passende dyrkingskammeret via de utstansede hullene (PH) i enheten. Media blir tilsatt og fjernet via brønnene (MW). "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53114/53114fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. (A) Lateral visning av en mus embryo hodet (embryonale dag med utvikling E14.5). Den svarte linjen viser hvor underkjeven bør kuttes for å bevare integriteten til både trigeminusgangliene og tann bakterier. (B) Mouse embryo hodet (E14.5) etter fjerning av underkjeven, skull og telencephalon. Svarte piler indikerer trigeminal ganglia (TG). (C) nedre kjeve av muse-embryo (E14.5) etter fjerning av tungen. Svarte piler indikerer lokalisering av de ulike tann bakterier (Inc: fortann, FM: første jekslene). (D) Skjematisk fremstilling av mikrofluid ko-kultur-enhet.p_upload / 53114 / 53114fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Co-kulturen i trigeminal ganglion og fortann tann bakterie fra villtype E15.5 mus embryoer. (A) Oversikt over aksonal kammeret (neurofilament, DAPI). Skala: 300 mikrometer. (B) Høyere forstørrelse av mikrorillene og neuritter vokser inn i axonal kammeret (neurofilament, DAPI, superposisjon av fluorescerende og lysfelt bilder). Skala: 150 mikrometer. (C) Høyere forstørrelse som viser veksten av aksoner i mikrorillene (neurofilament). Skala:. 75 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forrige in vitro studier av tann innervation var basert på konvensjonelle co-kulturer av trigeminal ganglia og dental vev eller celler 26,28,29. Disse undersøkelsene ble gjennomført for å undersøke hovedsakelig de attraktive effektene av disse celler eller vev på sensoriske aksoner 38. Selv bringe betydelige fremskritt i feltet, ble flere tekniske problemer hevet. Tann bakterier begynner å utarte etter noen dager med kultur 37. Basert på disse observasjonene, vokser neuroner og tenner i de samme kulturbetingelser svekke en eventuell analyse av molekyler som er involvert i krysstale mellom disse to vevene. Optimale dyrkingsbetingelser er nødvendig for å bevare den fysiologiske molekyl profil trigeminal ganglia og dentale vev.
Microfluidics systemer har blitt brukt så langt å co-kultur nevroner og ulike celletyper i optimaliserte media 34,36. Dette MicroFluidics system kan representere mer trofullt in vivo situasjon, der nervecellelegemer, aksonale terminaler og målet vev er generelt utsatt for ulike cellulære og molekylære microenvironments. Mer nylig har Microfluidics anordninger blitt brukt til å ko-kultur hele ryggmargen og osteoblaster 36. Vi har nylig vist at trigeminusgangliene og tennene er i stand til å overleve i lange perioder av gangen når co-dyrket i microfluidic enheter 37. Videre viste vi at tennene fra ulike utviklingsstadier opprettholde i disse in vitro forholdene de samme frastøtende eller attraktive effekter på trigeminal innervation at de utstilt i vivo 37.
Protokollen er beskrevet krever øvelse og fingerferdighet, særlig for mikrodisseksjon av trigeminusgangliene og tann bakterier. Trigeminal ganglia er lett revet under disseksjon. Derfor foreslår vi bruk av disseksjon nåler i stedet for disseksjon kraftps, for å fjerne vevet rundt ganglier. Likeledes bør det tas spesielt hensyn mens dissekere tann bakterier, for å unngå skade på tann epitel mens skiller den fra de omkringliggende mesenchymale vev. Videre under den første dagen av co-kultur, særlig forsiktighet bør utvises ved håndtering av inkubatoren, som overdreven vibrasjon kan svekke trigeminal ganglion vedheft til kultur dekkglass. Under co-dyrkningsperioden, bør mediet fjernes og tilsettes ved pipettering i brønnene, på motsatt side til kulturen kamre. Aspiring eller pipettering medier i nærhet av de kultur kamre vil resultere i aksonal skade.
Protokollen er beskrevet kan bli modifisert for å studere innervasjon av flere embryonale organer og embryonale eller postnatal vev og celletyper. Microfluidics systemer kan representere en hensiktsmessig plattform for å tillate lengre kultur perioder for studier av interaksjoner mellom nevroner og voksende teeth. Videre er separeringen av neuronal fra tannrommet tillater analyse av virkningene av spesifikke protein lokalisering og kvantifisering 33,37. Blokkerende antistoffer eller rekombinante proteiner kan også tilsettes til de separate avdelinger for de Microfluidics anordninger for å analysere deres virkninger på neuronale og dentale vev. For eksempel støtter behandling av trigeminal ganglia med NGF deres overlevelse og lar nevronale utvekst. Men i dette arbeidet eksogene NGF er fraværende fra tannen bakterie rommet, hvor tann avledede signaler er bare ansvarlig for neuronal tiltrekning eller frastøting. På samme måte kan andre molekyler, rekombinante antistoffer eller legemidler anvendes for å manipulere systemet under kontrollerte forhold.
De viktigste begrensninger av protokollen present ligge i den relative høye kostnaden av kommersielle microfluidic enheter, og den i det vesentlige 2D-oppsett av ko-kultur-system. Faktisk, selv om hele organer kan være kulturd, både organer og aksoner vokse i 2D-adherente dyrkningsbetingelser på et dekkglass; tilpasning av systemet ville være nødvendig for å oppnå et tredimensjonalt, realistisk gjengivelse av innervasjon.
I konklusjonen, microfluidic enheter er optimal for å undersøke hvilken rolle innervasjon i å utvikle eller regenererende organer og tillater studier av interaksjoner mellom nevronale og målet vev i optimale dyrkningsforhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AXIS Axon Isolation Devices | Millipore | AX15010-TC | Microchannels of different lenght are available |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504 | |
| Recombinant Mouse beta-NGF | R&D Systems | 1156-NG-100 | Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 |
References
- Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 71, 2241-2251 (2014).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
- Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 552-565 (2011).
- Katayama, Y., Battista, M., et al. Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egress from bone marrow. Cell. 124 (2), 407-421 (2006).
- Fitch, S. R., Kimber, G. M., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell stem cell. 11 (4), 554-566 (2012).
- Knox, S. M., Lombaert, I. M. a, Reed, X., Vitale-Cross, L., Gutkind, J. S., Hoffman, M. P. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. Science(New York, N.Y.). 329 (5999), 1645-1647 (2010).
- Knox, S. M., Lombaert, I. M. A., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nature communications. 4, 1494 (2013).
- Oakley, B., Witt, M. Building sensory receptors on the tongue. Journal of neurocytology. 33 (6), 631-646 (2004).
- Oakley, B., Brandemihl, A., Cooper, D., Lau, D., Lawton, A., Zhang, C. The morphogenesis of mouse vallate gustatory epithelium and taste buds requires BDNF-dependent taste neurons. Brain research. Developmental brain research. 105 (1), 85-96 (1998).
- Sun, H., Oakley, B. Development of anterior gustatory epithelia in the palate and tongue requires epidermal growth factor receptor. Developmental biology. 242 (1), 31-43 (2002).
- Mistretta, C. M., Goosens, K. a, Farinas, I., Reichardt, L. F. Alterations in size, number, and morphology of gustatory papillae and taste buds in BDNF null mutant mice demonstrate neural dependence of developing taste organs. The Journal of comparative neurology. 409 (1), 13-24 (1999).
- Mitsiadis, T. a, Graf, D. Cell fate determination during tooth development and regeneration. Birth defects research. Part C, Embryo today reviews. 87 (3), 199-211 (2009).
- Mohamed, S. S., Atkinson, M. E. A histological study of the innervation of developing mouse teeth. Journal of anatomy. 136 (Pt 4), 735-749 (1983).
- Luukko, K. Immunohistochemical localization of nerve fibres during development of embryonic rat molar using peripherin and protein gene product 9.5 antibodies. Archives of oral biology. 42 (3), 189-195 (1997).
- Johnsen, D. Innervation of teeth: qualitative, quantitative, and developmental assessment. Journal of dental research. 64, 555-563 (1985).
- Mitsiadis, T. a, Dicou, E., Joffre, A., Magloire, H. Immunohistochemical localization of nerve growth factor (NGF) and NGF receptor (NGF-R) in the developing first molar tooth of the rat. Differentiation; research in biological diversity. 49 (1), 47-61 (1992).
- Mitsiadis, T. a, Luukko, K.
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation; research in biological diversity. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kettunen, P., Løes, S., et al. Coordination of trigeminal axon navigation and patterning with tooth organ formation: epithelial-mesenchymal interactions and epithelial Wnt4 and Tgfbeta1 regulate semaphorin 3a expression in the dental mesenchyme. Development (Cambridge, England). 132 (2), 323-334 (2005).
- Tuisku, F., Hildebrand, C. Evidence for a neural influence on tooth germ generation in a polyphyodont species. Developmental biology. 165, 1-9 (1994).
- Zhao, H., Feng, J., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell stem cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Kettunen, P., Kvinnsland, H., Luukko, K. Mouse rudimentary diastema tooth primordia are devoid of peripheral nerve fibers. Anatomy and embryology. 205 (3), 187-191 (2002).
- Lumsend, A., Buchanan, J. An experimental study of timing and topography of early tooth development in the mouse embryo. Archives of oral biology. , 301-311 (1986).
- Kollar, E., Lumsend, A. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de Biologia Buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
- Luukko, K., Kettunen, P. Coordination of tooth morphogenesis and neuronal development through tissue interactions: lessons from mouse models. Experimental cell research. 325 (2), 72-77 (2014).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
- Lumsend, A., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323 (9), 538-539 (1986).
- Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience letters. 308 (3), 161-164 (2001).
- Petrinovic, M. M., Duncan, C. S., et al. Neuronal Nogo-A regulates neurite fasciculation, branching and extension in the developing nervous system. Development(Cambridge, England). 137 (15), 2539-2550 (2010).
- Otsu, K., Fujiwara, N., Harada, H.
- Mitsiadis, T. a, Drouin, J. Deletion of the Pitx1 genomic locus affects mandibular tooth morphogenesis and expression of the Barx1 and Tbx1 genes. Developmental biology. 313 (2), 887-896 (2008).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Hosmane, S., Tegenge, M. A., et al. Toll/interleukin-1 receptor domain-containing adapter inducing interferon-β mediates microglial phagocytosis of degenerating axons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7745-7757 (2012).
- Delamarche, E., Tonna, N., Lovchik, R. D., Bianco, F., Matteoli, M. Pharmacology on microfluidics: multimodal analysis for studying celll-cell interaction. Current opinion in pharmacology. 13 (5), 821-828 (2013).
- Neto, E., Alves, C. J., et al. Sensory neurons and osteoblasts: close partners in a microfluidic environment. Integrative Biology. , (2014).
- Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in physiology. 5 (August), (2014).
- Connor, R., Tessier-Lavigne, M. Identification of maxillary factor, a maxillary process-derived chemoattractant for developing trigeminal sensory axons. Neuron. 24, 165-178 (1999).
