ここでは、in vitroでの脊髄固有の接続の機能的再生を研究するために、マルチ電極アレイ上で培養脊髄スライスに基づいてされているプロトコルを提示します。
Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings.
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.
中枢神経系(CNS)の器官型切片培養物は、神経発達の神経変性に到達する様々な生理学的および病理学的現象を研究するために広く使用されています。解離細胞培養物と比較して、器官のスライスは、無傷の細胞構築と地元のシナプス回路をより複雑にするという利点を提供します。同時に、組織は 、インビボのコンテキスト全体の複雑さが関与することなく、孤立したように分析することができます。また、選択したセルに簡単に繰り返しアクセスが保証され、細胞外環境を精密に制御することができ、通常、in vitroモデルは、 それらのインビボ対応よりも低コストです。近年、様々な研究が対応する生きている動物1,2対長期培養の発達プロファイル間の顕著な類似を発表しました。それは、様々なCNSレジオの神経回路が示されていますNSは、開発中に自発的なネットワーク活性を発現し、器官スライスが部分的にこの現象3-7を維持すること 。単離された脊髄調製物は、特にリズム生成6および神経回路1の形成を研究するために使用されています。
器官型スライスの自発的活動を記録する方法は、マルチ電極アレイ(MEAの)の上で培養するそれらです。これらのデバイスは、同時に多数の細胞からの活動電位によって生成された細胞外電位(マルチユニット記録)を監視することができ、複数の電極を含んでいます。 MEA記録の高い時間分解能が与えられた神経回路内の正確な活性の動態を再構築するために使用することができます。さらに、パッチクランプ技術とは対照的に、ニューロンは、それらの動作に影響されないという事実の長期測定し、結果を可能にする、非侵襲的です。
Fまたは、本研究の目的は、器官脊髄共培養およびマルチサイト記録の組み合わせは、脊髄内の機能再生を研究するために使用されました。成人高等脊椎動物の脊髄の損傷から回復する可能性が限られているので、別の戦略は、脊髄損傷後の再生を促進するために研究されています。これまでのところ、皮質脊髄路は、通常、調査のための選択のモデルシステムとなっています。これらの実験は、一般的に高価な時間のかかるであり、単一のグループ内の高い変動に起因する大型動物のコホートを必要とします。また、証拠が脊髄固有の接続(完全脊髄内に閉じ込めているニューロン)は、脊髄損傷8後の回復過程において極めて重要な役割を果たしうることを示唆しています。これらの繊維は、繊維路を昇順と降順の干渉を受けずに、生体内で勉強することは困難です。 BonniciとKapfhammer 9は、長手方向の脊髄を使用しました別のアプローチとして、出生後のマウスのスライス培養。機械的な病変を行った後、彼らは半定量的に脊髄セグメント間の軸索の形態学的再生を分析しました。彼らは成熟した年齢で切断培養における病変部位を横切る少なくはなく、なし、軸索を観察しました。 7日後に損傷 – これとは対照的に、若い段階で病変した培養物は、5軸索再生の高い量を表示しました。しかし、機能的な接続のための証拠が提示されませんでした。
したがって、機能的再生の調査を可能にする脊髄固有の繊維のインビトロモデルにおける代表の開発は、脊髄の再生過程についての知識を拡張するための貴重なツールになります。
提示された手順のいくつかの要素は、正確で再現性のある実験の達成のための基本です。 MEAを、溶液の調製とスライス培養物の製造時の全てのステップは、層流フード内で無菌条件下で行われます。彼らは自発的活動14に影響を与えることができるため、抗生物質を栄養培地には適用されません。 MEAのコーティングの間に、最も重要な部分は、細胞外マトリックスゲル溶液が常に冷たいまま確認することです。それ冷蔵庫の中や、0℃に近い最高温度を確保するために、全体の手順のために氷の上にそれを維持解凍。スライス迅速な隔離の準備中および切片だけでなく、氷冷解剖バッファを使用して低温に注意を払っては健全な文化の割合が増加します。また、プラズマ/トロンビン凝固は最も重要なステップの1つです。まず、プラズマが正しくミヘ族であることを確認してくださいトロンビンでD。第二に、多国間環境協定へのスライスの適切な取り付けを確実にするために、できるだけ多くの残留物を除去することに特別な注意を払います。このステップは非常に時間に敏感です。タイムフレームが短すぎると、プラズマ/トロンビン混合物の過度に除去します。タイムフレームが長すぎると、凝集が既に残留プラズマ/トロンビンと共にスライスを除去する危険性を増大させる、起こりました。
機械的な病変が計画されている場合には、正確なデザインでのMEAを使用することが重要です。病変が意図されている領域は、電極、配線と絶縁体を含まないことが必要です。それ以外の場合は、MEAの電気系統が損傷されようとしているので、何のレコーディングはもう実行することはできません。
もう一つの重要なステップは、病変の大きさに関係します。これは、病変後に二人の若いのスライスを再接続すると、2日程度10を要することが以前に示されています。すべての実験のために、親指のルールは、スペースbetweことに使用しました病変後のスライスエンMEA溝(300ミクロン)の幅よりも大きくなるべきではありません。大きな病変サイズは、病変は、全く再接続大きすぎるされていない場合、再接続のための長い時間枠になるか、可能性があります。注釈を付けるには、前者の実験はさらに離れて非常に低い接続速度が1mmの結果より、2つのスライスの初期配置することを明らかにしました。
録音、室温に少なくとも10分の調整時間の開始前に、インキュベーターの、および細胞外溶液に、代わりに栄養培地の代わりに37℃を推奨します。これらの初期分間の活動パターンの綿密な観察は、測定データが記録を開始した適切後文化の崩壊パターンを表していることを保証します。
(チャンバーを記録し、アンプやアンプへの接続)活性の検出、データ収集、さらなる処理、手作りのハードウェアについては、ラボ内のプログラムVIEW、C ++とIgorProが使用されています。市販のMEAのセットアップおよびその他のソフトウェアパッケージは、これらの操作のためにも適しています。ここで、電極によって見られる信号は、1001倍に増幅された後、6 kHzの速度でデジタル化されています。
なぜなら、インビボで提示したモデルは、脊髄固有の接続を検査するために役立つツールとなることができ、それらは、繊維路を昇順と降順の干渉を受けずに勉強することは困難です。 2脊髄スライスの共培養は、エレガントに、この問題を回避することができます。培養物は、厳密に制御し、簡単に操作することができる微小環境を提供します。一方、脊柱上および感覚入力が不足していることは勿論です。さらに、培養調製方法は、CNS損傷の状況を表しています。アストロサイトとミクログリアのようなグリア細胞が増加増殖と病変に応答することが知られているので、組織を再編成ある程度ですされています。提示モードに関する機械的な損傷を実行した後、Lグリア性瘢痕の形成は観察されませんでした。 1つの説明は、アストロサイトの適応メカニズムが既に準備処理中にトリガされたことや文化の病変がさらに応答を生じなかったことが考えられます。また、ミエリン関連阻害剤、 例えばの関与の証拠はありません。、のNogo-A、老後に病変の文化の低い再生可能性に。しかし、ロリプラムは、スライス10の間で23 DIV増加機能的再生に病変を実行した後に直接起動ホスホジエステラーゼ4阻害剤による治療を示されました。これらの結果は、機能回復が古い培養物中で増加させることができることを示しています。病変部位を横切る軸索の数をカウントするときに顕著に、若い年齢で病変の文化や古い年齢で病変の文化の間には差が発見されませんでした。これらの知見は、軸索再生の欠如が主な理由Fではないことを示唆していますまたはしたがって、文化の中で後半の病変後の回復の損失とは、再生の機能解析を可能にするモデルの必要性を強調しています。シナプス形成とシナプス可塑性は、回復プロセス10において主要な役割を果たしている可能性があります。これらのメカニズムは、近年中に多くの注目を得て、それが今日では広く、彼らは脊髄損傷後の結果に大きな影響を与えることが認められています。したがって、単独でと非常に詳細にこれらのプロセスを調査するために安定した条件を提供するモデルは確かに脊髄の機能的再生に関する洞察を得るのを助けることができます。
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by the Swiss National Foundation (n° 3100AO-120327 and 31003A_140754/1)
Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
Nutrient medium | For 100 ml | ||
Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
distilled, sterile water | 10 ml | ||
Nerve growth factor-7S [5ng/mL] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
Coating solution | |||
Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
Wash solution | [mg/L] | ||
MgCl2-6H2O | 100 | ||
MgSO4-7H2O | 100 | ||
KCl | 400 | ||
KH2PO4 | 60 | ||
NaCl | 8000 | ||
Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
D-Glucose (Dextrose) | 1000 | ||
According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
NaCl | 145 | ||
KCl | 4 | ||
MgCl2 | 1 | ||
CaCl2 | 2 | ||
HEPES | 5 | ||
Na-pyruvate | 2 | ||
Glucose | 5 | ||
Blocking Solution | |||
Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 |