Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

الفيروسية في وقت مبكر فحوصات دخول لتحديد وتقييم المركبات المضادة للفيروسات

Published: October 29, 2015 doi: 10.3791/53124
Automatic Translation
1,2, 3, 4,5, 2,4, 3,6
1Department of Chinese Medicine, Taipei Medical University Hospital, 2Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 3Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 4Division of Hematology and Oncology, Department of Internal Medicine, Taipei Medical University Hospital, 5Department of Internal Medicine, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 6Graduate Institute of Medical Sciences, College of Medicine, Taipei Medical University

Protocol

ملاحظة: تأكد من أن تتم جميع الإجراءات التي تنطوي على زراعة الخلايا وعدوى فيروس في اغطية شهادة السلامة الأحيائية التي هي مناسبة لمستوى السلامة الحيوية من العينات التي يجري التعامل معها. لغرض وصف البروتوكولات، يتم استخدام Gaussia luciferase المراسل HCV-الموسومة مراسل ك فيروس طراز 32. في سياق نتائج ممثل، يتم استخدام حمض المركبات chebulagic (CHLA) وpunicalagin (PUG) كما مضادات الفيروسات المرشحة التي تستهدف التفاعلات بروتين سكري الفيروسية مع الجليكوسامينوجليكان سطح الخلية خلال دخول الفيروس في وقت مبكر خطوات 31. الهيبارين، والذي يعرف لتتداخل مع دخول العديد من الفيروسات 30،31،33،34، ويستخدم كعلاج مراقبة إيجابية في هذا السياق. لالأساسية عن تقنيات علم الفيروسات، والإكثار من الفيروسات، وتحديد عيار الفيروس، والتعبير عن الجرعة المعدية في وحدات اللوحة تشكيل (PFU)، والتركيز حدات تشكيل (FFU)، أو تعدد العدوى (وزارة الداخلية)، والقارئ هو إعادةferred مرجع 35. للحصول على أمثلة السابقة والظروف الأمثل لاستخدام الفيروسات هو مبين في نتائج ممثل، وعلى القارئ الرجوع إلى المراجع 30-32،36-39 فضلا عن تفاصيل المدرجة في الجدول 1، الشكل 1A، والشكل 2A.

الثقافة 1. الخليوي، إعداد المجمع، والسمسة مجمع

  1. تنمو خط الخلية المعنية لنظام عدوى فيروس ليتم تحليلها (الجدول 1). لHCV، وتنمو الخلايا هوه 7.5 في تعديل متوسطة النسر Dulbecco و(DMEM) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS)، و 200 U / البنسلين مل G، 200 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و 0.5 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B.
  2. إعداد اختبار مركبات وضوابط استخدام المذيبات كل منهما: على سبيل المثال، حل CHLA وPUG في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO)؛ إعداد الهيبارين في المياه المزدوج المقطر المعقم. لجميع التخفيفات لاحقة، استخدام وسائل الإعلام الثقافة.
    ملاحظة: تناسق النهائيالتموينية من DMSO في العلاجات اختبار المركب هو أقل من 1٪ في التجارب. يتم تضمين 1٪ DMSO كعلاج سيطرة سلبية في المقايسات للمقارنة.
  3. تحديد السمية الخلوية من المركبات اختبار (على سبيل المثال، CHLA وPUG) على الخلايا لعدوى فيروسية باستخدام بقاء الخلية تحديد كاشف مثل XTT (2،3 مكرر [2-ميثوكسي-4-نيترو-5-sulfophenyl] -5-phenylamino) -carbonyl] هيدروكسيد -2H-نتروبلو):
    1. لHCV، البذور هوه 7.5 الخلايا في لوحة 96-جيدا (1 × 10 4 خلايا لكل بئر)، واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة O / N للحصول على أحادي الطبقة.
    2. تطبيق السيطرة DMSO (1٪) أو زيادة تركيزات من CHLA مركبات اختبار وPUG (مثلا 0، 10، 50، 100، و 500 ميكرومتر) إلى الآبار الثقافة في ثلاث نسخ.
    3. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة، ثم تجاهل المتوسطة في لوحة وغسل الخلايا مع 200 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مرتين.
    4. إضافة 100 ميكرولتر من assayinز حل من عدة في المختبر فحص السموم على أساس XTT إلى كل بئر واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة أخرى 3 للسماح XTT إنتاج formazan.
    5. تحديد الامتصاصية مع قارئ صفيحة ميكروسكوبية في الطول الموجي الاختبار من 492 نانومتر، والطول الموجي إشارة من 690 نانومتر.
    6. حساب النسبة المئوية للبقاء الخلايا باستخدام الصيغة التالية: بقاء الخلية (٪) = في / و× 100٪ "، وفي" حيث و'باسم' الرجوع إلى امتصاص المركبات اختبار ومراقبة المذيبات (مثلا DMSO 1٪. ) العلاجات، على التوالي. تحديد تركيز للخلايا الخلوية 50٪ (CC 50) من المركبات اختبار من البرامج التحليلية مثل GraphPad بريزم وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.

2. قراءات من العدوى الفيروسية

ملاحظة: قراءات من عدوى فيروسية تعتمد على نظام فيروس يستخدم ويمكن أن تشمل أساليب مثل المقايسات البلاك أو الشرق الأوسط وأفريقياسورينغ إشارات مراسل من الفيروسات الموسومة مراسل. وصفت طريقة للكشف عن الإصابة مراسل HCV على أساس النشاط luciferase المراسل أدناه.

  1. جمع supernatants من الآبار المصابة وتوضيح في 17000 x ج في microcentrifuge لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  2. مزيج 20 ميكرولتر من اختبار طاف 50 ميكرولتر من luciferase المراسل الركيزة من Gaussia عدة luciferase الفحص وقياس مباشرة مع luminometer وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  3. التعبير عن HCV العدوى كما سجل 10 وحدات الخفيفة النسبية (RLU) لتحديد تثبيط الفيروسي (٪) وحساب تركيز 50٪ فعالة (EC 50) من المركبات اختبار ضد فيروس التهاب الكبد الوبائي باستخدام خوارزميات من برنامج GraphPad بريزم وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.

3. الفيروسية التعطيل الفحص

ملاحظة: أمثلة من فترة الحضانة وجرعة الفيروسية لمختلف الفيروسات لإعادة المدرجة في الشكل 1A. ويمكن أيضا اختبار تركيزات أعلى من الفيروس عن طريق زيادة وزارة الداخلية / PFU.

  1. البذور هوه 7.5 الخلايا في لوحة 96-جيدا (1 × 10 4 خلايا لكل بئر)، واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة O / N للحصول على أحادي الطبقة.
  2. احتضان مركبات اختبار أو ضوابط (تركيزات النهائي هي: CHLA = 50 ميكرومتر؛ PUG = 50 ميكرومتر؛ الهيبارين = 1000 ميكروغرام / مل؛ DMSO = 1٪) مع جزيئات HCV عند 37 درجة مئوية (الشكل 1A، "طويل الأجل" ) في نسبة 1: 1. على سبيل المثال، إلى اللقاح فيروس 100 ميكرولتر تحتوي على 1 × 10 4 FFU، إضافة 100 ميكرولتر من تمييع العمل 100 ميكرومتر CHLA. ينتج هذا العلاج CHLA بتركيز نهائي 50 ميكرومتر.
  3. تمييع الخليط الفيروس للأدوية إلى (غير فعالة) التركيز "شبه العلاجي" للمركبات الاختبار. على سبيل المثال، وتركيز غير الفعال للCHLA وPUG ضد HCV هو في 1 ميكرومتر 31؛ لذاوهذا يتطلب التخفيف 50 أضعاف من خليط الفيروس للأدوية التي يمكن أن يتحقق مع 9.8 مل من القاعدية المتوسطة (متوسطة زراعة الخلايا مع 2٪ FBS).
    ملاحظة: تخفيف لتركيز شبه العلاجية يمنع تفاعل كبير بين مركبات اختبار وسطح الخلية المضيفة ويسمح فحص تأثير العلاج على virions خالية من الخلايا. لاحظ أن هذا التخفيف تعتمد على الاستجابة للجرعة مضادة للفيروسات من المركبات اختبار ضد عدوى فيروسية معينة، ويتم تحديد مسبق لأداء معين هذا الاختبار 31.
  4. وعلى سبيل المقارنة، مزيج الفيروس مع مركبات الاختبار وعلى الفور تمييع (أي فترة الحضانة) لتركيز الفرعية العلاجي قبل الإصابة (الشكل 1A، "قصير الأجل").
  5. إضافة 100 ميكرولتر من المخفف خليط HCV-المخدرات على هوه 7.5 الخلية أحادي الطبقة (كمية الفيروس الآن في 1 × 10 2 FFU؛ النهائية زارة الداخلية = 0.01)، واحتضان لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية للسماح الفيروسيةالامتزاز.
  6. بعد الإصابة، وإزالة قائح المخفف وغسل بلطف الآبار مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مرتين.
    ملاحظة: إجراء يغسل بلطف لتجنب رفع الخلايا.
  7. تطبيق 100 ميكرولتر من المتوسط ​​القاعدية إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
  8. تحليل العدوى الناجم عن يعاير وطاف لluciferase النشاط كما هو موضح في "2. قراءات من العدوى الفيروسية.

4. الفيروسية الفحص مرفق

ملاحظة: يتم سرد أمثلة من فترة الحضانة وجرعة الفيروسية لمختلف الفيروسات في الشكل 2A، "مرفق". ويمكن أيضا اختبار تركيزات أعلى من الفيروس عن طريق زيادة وزارة الداخلية / PFU.

  1. البذور هوه 7.5 الخلايا في لوحة 96-جيدا (1 × 10 4 خلايا لكل بئر)، واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة O / N للحصول على أحادي الطبقة.
  2. قبل البرد الطبقات الوحيدة الخلية في لوحات في 4 درجات مئوية FOص 1 ساعة.
  3. شارك في علاج الخلايا مع HCV اللقاح (وزارة الداخلية = 0.01) واختبار مركبات أو ضوابط (تركيزات النهائي هي: CHLA = 50 ميكرومتر؛ PUG = 50 ميكرومتر؛ الهيبارين = 1000 ميكروغرام / مل؛ DMSO = 1٪) في 4 درجات مئوية ل 3 ساعة. على سبيل المثال، إلى اللقاح فيروس 90 ميكرولتر تحتوي على 1 × 10 2 FFU، إضافة 10 ميكرولتر من تمييع العمل 500 ميكرومتر CHLA. ينتج هذا العلاج CHLA بتركيز نهائي 50 ميكرومتر والعدوى عن طريق HCV في وزارة الداخلية = 0.01 على أحادي الطبقة الخلية.
    ملاحظة: من المهم لتنفيذ التجربة في 4 ° C لأنه يسمح للفيروس ملزم ولكن يحول دون دخول الذي يحدث بشكل أكثر فعالية في 37 ° C. نفذ إضافة الفيروسات واختبار المركبات على الجليد والحضانة التي تلت ذلك في C الثلاجة 4 درجات للتأكد من أن درجة الحرارة هو الحفاظ على 4 درجات مئوية.
  4. إزالة طاف وغسل بلطف أحادي الطبقة الخلية مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الجليد الباردة مرتين.
    ملاحظة: إجراء يغسل بلطف لتجنب رفع الخلايا <./ لى>
  5. تطبيق 100 ميكرولتر من المتوسط ​​القاعدية إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
  6. تحليل العدوى الناجم عن يعاير وطاف لluciferase النشاط كما هو موضح في "2. قراءات من العدوى الفيروسية.

5. الفيروسية الدخول / فيوجن الفحص

ملاحظة: يتم سرد مثال على فترات الحضانة وجرعة الفيروسية لمختلف الفيروسات في 'دخول / فيوجن "الشكل 2A. ويمكن أيضا اختبار تركيزات أعلى من الفيروس عن طريق زيادة وزارة الداخلية / PFU.

  1. البذور هوه 7.5 الخلايا في لوحة 96-جيدا (1 × 10 4 خلايا لكل بئر)، واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة O / N للحصول على أحادي الطبقة.
  2. قبل البرد الطبقات الوحيدة الخلية في لوحات في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. تصيب الخلايا مع فيروس (سي) (MOI = 0.01) في 4 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. على سبيل المثال، استخدام اللقاح الفيروس 100 ميكرولتر تحتوي على 1 × 10 2 FFU.
    ملاحظة: نفذ عدينشوئها من اللقاح الفيروسي على الجليد والحضانة التي تلت ذلك في C الثلاجة 4 درجات للحفاظ على درجة حرارة 4 درجات مئوية، والذي يسمح دخول ملزم ولكن لا الفيروسي.
  4. إزالة طاف وغسل بلطف الطبقات الوحيدة الخلية مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الجليد الباردة مرتين.
    ملاحظة: إجراء يغسل بلطف لتجنب رفع الخلايا.
  5. علاج الآبار مع مركبات الاختبار أو ضوابط (تركيزات النهائي هي: CHLA = 50 ميكرومتر؛ PUG = 50 ميكرومتر؛ الهيبارين = 1000 ميكروغرام / مل؛ DMSO = 1٪)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. على سبيل المثال، إضافة 10 ميكرولتر من تمييع العمل 500 ميكرومتر CHLA إلى 90 ميكرولتر من وسائل الإعلام، وخلط، ومعالجة الآبار. ينتج هذا العلاج CHLA بتركيز نهائي 50 ميكرومتر.
    ملاحظة: إن التحول من 4 ° C إلى 37 درجة مئوية يسهل الآن الفيروسي حالة دخول / الانصهار، وبالتالي تتيح تقييم تأثير مركبات اختبار 'على هذه الخطوة معينة.
  6. نضح طاف التي تحتوي على المخدرات وإزالة غير المنضوية-الفيروسات خارج الخلية إما عن طريق غسل 200 ميكرولتر من العازلة سيترات (50 ملي سيترات الصوديوم، 4 ملي كلوريد البوتاسيوم، ودرجة الحموضة 3.0) أو برنامج تلفزيوني. تطبيق 100 ميكرولتر من المتوسط ​​القاعدية قبل يحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
  7. تحليل العدوى الناجم عن يعاير وطاف لluciferase النشاط كما هو موضح في "2. قراءات من العدوى الفيروسية.

Representative Results

في الشكل 1، تم إجراء "فحص التثبيط الفيروسي 'لدراسة ما إذا كانت مدة محددة مركبات CHLA الطبيعي وPUG يمكن إبطال نشاط الفيروسات يلفها مختلفة في الدولة خالية من الخلايا ومنع العدوى لاحق. وقد تم تحديد السمية الخلوية وفيروسات الاستجابة للجرعة من هذه المركبات قبل إجراء دراسة الآلية 31. الفيروسات وعولج قبل مع مركبات اختبار ومن ثم تم تخفيفه الخلطات الفيروس للأدوية لتركيزات الفرعية العلاجية قبل التلقيح على أحادي الطبقة خلية منها لكل نظام الفيروس. كما هو مبين في الشكل 1، سواء CHLA وPUG يبدو للتفاعل مع virions خالية من الخلايا، مما يؤدي إلى آثار لا رجعة فيها محمية أحادي الطبقة الخلية من عدوى لاحقة. حققت مركبات اختبار اثنين في القريب 100٪ تثبيط ضد HCMV، HCV، وDENV-2، في حين أن 60 - وقد لوحظ كتلة 80٪ مقابل MV وRSV. هذه النتائج سوجمؤسسة أن CHLA وPUG يكون لها تأثير مباشر على هذه الجسيمات فيروس مجانا عن طريق تعطيل لهم وتحييد العدوى بها.

في الشكل 2، وأجريت المرفق ودخول / المقايسات الانصهار لاستكشاف تأثير CHLA وPUG ضد هذه الأحداث ذات الصلة دخول الفيروسية في وقت مبكر من HCMV، HCV، DENV-2، MV، وRSV. كلا CHLA وPUG منعت بشكل فعال ملزم للفيروسات التحقيق على الخلية المضيفة كما هو مبين من خلال تثبيط على العدوى الفيروسية الناتجة (الشكل 2، "مرفق": أشرطة رمادي فاتح). وكان تأثير كابح بشكل خاص على مرفق الفيروس عن طريق كل من مركبات مماثلة ضد HCMV (الشكل 2B)، HCV (الشكل 2C)، DENV-2 (الشكل 2D)، وRSV (الشكل 2F)، تتراوح 90-100٪. من ناحية أخرى، يبدو PUG أن يكون أكثر فعالية من CHLA ضد MV ملزم (الشكل 2E)، مع معدل تثبيط من TWس المركبات تتراوح بين 50-80٪. الهيبارين معاملة السيطرة، والذي يعرف لمنع دخول العديد من الفيروسات، وأيضا مرفق تحول دون لHCMV، DENV-2، RSV، إعلان MV، ولكن أقل كفاءة ضد HCV. فحص تلت ذلك "الفيروسي دخول / الانصهار فحص" ما إذا كان CHLA وPUG الاحتفاظ نشاطهم خلال مرحلة دخول فيروس / الانصهار (الشكل 2، "دخول / فيوجن": أشرطة رمادية داكنة). مرة أخرى، لوحظت على حد سواء CHLA وPUG مخلا بشكل فعال الفيروسية خطوة دخول / الانصهار من الفيروسات فحص (الشكل 2B - F)، مما أسفر عن 50 - 90٪ تأثير وقائي على أحادي الطبقة خلية منها. الهيبارين أيضا تحول دون دخول أكثر قدرة / الانصهار في DENV-2 والتهابات RSV، ولكن كان أقل فعال ضد HCMV، HCV، وMV (<40٪ تثبيط في المتوسط).

<td> HEL
فيروس نوع من الخلايا
HCMV
HCV هاه 7.5
DENV-2 فيرو
MV CHO-SLAM
RSV التهاب الكبد-2

الجدول 1: المضيف نوع من الخلايا لعدوى فيروسية يشار إلى نوع من الخلايا المستخدمة لكل نظام عدوى فيروسية موضح في نتائج ممثل. تفاصيل إضافية بشأن الخلايا يمكن العثور في اشارة 31.

الشكل 1
الشكل 1. تثبيط الالتهابات الفيروسية التي CHLA مركبات اختبار وPUG تم علاج الفيروسات المختلفة مع مركبات الاختبار لفترة طويلة. (المحتضنة لمدة 1،5-3 ساعة قبل المعايرة؛ القضبان الرمادية الخفيفة) أو فترة قصيرة (مخفف على الفور، الرمادي الداكن القضبان) عند 37 درجة مئوية قبل التخفيف إلى concentra الفرعية العلاجيةنشوئها وتحليل لاحقة للإصابة في الخلايا المضيفة المعنية. (A) الخطط التجربة (كما هو موضح على اليسار) مع تركيز الفيروس النهائي (PFU / جيد أو وزارة الداخلية)، على المدى الطويل فترة حضانة الفيروس للأدوية (ط)، وفيما بعد فترة حضانة (ب) أشار لكل فيروس في الجدول على اليمين. تحليلات ل(B) HCMV، (C) HCV، (D) DENV-2، وأشار (E) MV، و (F) RSV في كل لوحة إضافية. يتم رسم النتائج ضد DMSO العلاج سيطرة سلبية لعدوى فيروس والبيانات المعروضة هي الوسائل ± الأخطاء المعيارية للمتوسط ​​(SEM) من ثلاث تجارب مستقلة. تم تعديل هذا الرقم من إشارة 31. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. تقييم الأنشطة المضادة للفيروسات من CHLA مركبات اختبار وPUG ضد مرفق فيروس ودخول / الانصهار. (A) وإجراء التجارب، وتركيز الفيروس (PFU / جيد أو وزارة الداخلية)، ووقت الجمع والمعالجة مع مركبات الاختبار (الأول والثاني والثالث) يتم عرض لكل الفيروس في الخطط والجداول المرتبطة بها. في التحليل المرفق فيروس (أشرطة رمادي فاتح)، كانت الطبقات الوحيدة من أنواع مختلفة من الخلايا برود قبل في 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة، ثم تعامل المشترك مع الفيروسات منها واختبار مركبات في 4 ° C (1،5-3 ساعة؛ ط) قبل غسل قبالة inoculates والمركبات اختبار للحضانة لاحقة (37 ° C؛ الثاني) وفحص عدوى الفيروس. في دخول الفيروس / تحليل الانصهار (أشرطة رمادية داكنة)، كانت الطبقات الوحيدة الخلية المصنفة مسبقا المبردة في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ثم تحدت مع الفيروسات منها في 4 درجة مئوية لمدة 1،5-3 ساعة (ط). كانت خلايا ثمغسلها وتعامل مع مركبات الاختبار لفترة حضانة إضافية (II) والتي تم خلالها تحول درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية لتسهيل الفيروسي حالة دخول / الانصهار. في نهاية الحضانة، وإزالة الفيروسات خارج الخلية إما عازلة سيترات (درجة الحموضة 3.0) أو يغسل PBS وحضنت الخلايا كذلك (ج) لتحليل عدوى الفيروس. نتائج (B) HCMV، (C) HCV، (D) DENV-2، وأشار (E) MV، و (F) RSV في كل لوحة إضافية. يتم رسم البيانات ضد DMSO العلاج سيطرة سلبية من عدوى فيروس ويتم عرضها كما يعني ± SEM من ثلاث تجارب مستقلة. تم تعديل هذا الرقم من إشارة 31. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM GIBCO 11995-040
FBS GIBCO 26140-079
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15070-063
Amphotericin B GIBCO 15290-018
DMSO Sigma D5879
In vitro toxicology assay kit, XTT-based Sigma TOX2
PBS pH 7.4  GIBCO 10010023
Microplate reader Thermo Scientific 89087-320
Microcentrifuge Thermo Scientific 75002420
BioLux Gaussia luciferase assay kit New England Biolabs E3300L   
Luminometer Promega GloMax-20/20
Sodium citrate, dihydrate Sigma 71402
Potassium chloride Sigma P5405

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Munier, C. M., Andersen, C. R., Kelleher, A. D. HIV vaccines: progress to date. Drugs. 71, 387-414 (2011).
  2. Rothman, A. L. Immunity to dengue virus: a tale of original antigenic sin and tropical cytokine storms. Nat Rev Immunol. 11, 532-543 (2011).
  3. Sung, H., Schleiss, M. R. Update on the current status of cytomegalovirus vaccines. Expert Rev Vaccines. 9, 1303-1314 (2010).
  4. Torresi, J., Johnson, D., Wedemeyer, H. Progress in the development of preventive and therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J Hepatol. 54, 1273-1285 (2011).
  5. Wright, M., Piedimonte, G. Respiratory syncytial virus prevention and therapy: past, present, and future. Pediatr Pulmonol. 46, 324-347 (2011).
  6. Christou, L. The global burden of bacterial and viral zoonotic infections. Clin Microbiol Infect. 17, 326-330 (2011).
  7. Cascio, A., Bosilkovski, M., Rodriguez-Morales, A. J., Pappas, G. The socio-ecology of zoonotic infections. Clin Microbiol Infect. 17, 336-342 (2011).
  8. Grais, R. F. Measles vaccination in humanitarian emergencies: a review of recent practice. Confl Health. 5, 21 (2011).
  9. Gautret, P. Emerging viral respiratory tract infections-environmental risk factors and transmission. Lancet Infect Dis. 14, 1113-1122 (2014).
  10. Sampathkumar, P. Middle East respiratory syndrome: what clinicians need to know. Mayo Clin Proc. 89, 1153-1158 (2014).
  11. Burd, E. M. Ebola Virus: a Clear and Present Danger. J Clin Microbiol. 53, 4-8 (2015).
  12. Bishop, B. M. Potential and Emerging Treatment Options for Ebola Virus Disease. Ann Pharmacother. , (2014).
  13. Arduino, P. G., Porter, S. R. Oral and perioral herpes simplex virus type 1 (HSV-1) infection: review of its management. Oral Dis. 12, 254-270 (2006).
  14. Mitrasinovic, P. M. Advances in the structure-based design of the influenza A neuraminidase inhibitors. Curr Drug Targets. 11, 315-326 (2010).
  15. Soriano, V. Directly acting antivirals against hepatitis C virus. J Antimicrob Chemother. 66, 1673-1686 (2011).
  16. Haqqani, A. A., Tilton, J. C. Entry inhibitors and their use in the treatment of HIV-1 infection. Antiviral Res. 98, 158-170 (2013).
  17. Melby, T., Westby, M. Inhibitors of viral entry. Handb Exp Pharmacol. , 177-202 (2009).
  18. Vanderlinden, E., Naesens, L. Emerging antiviral strategies to interfere with influenza virus entry. Med Res Rev. 34, 301-339 (2014).
  19. Antoine, T. E., Park, P. J., Shukla, D. Glycoprotein targeted therapeutics: a new era of anti-herpes simplex virus-1 therapeutics. Rev Med Virol. 23, 194-208 (2013).
  20. Pawlotsky, J. M., Chevaliez, S., McHutchison, J. G. The hepatitis C virus life cycle as a target for new antiviral therapies. Gastroenterology. 132, 1979-1998 (2007).
  21. Beyleveld, G., White, K. M., Ayllon, J., Shaw, M. L. New-generation screening assays for the detection of anti-influenza compounds targeting viral and host functions. Antiviral Res. 100, 120-132 (2013).
  22. Kilianski, A., Baker, S. C. Cell-based antiviral screening against coronaviruses: developing virus-specific and broad-spectrum inhibitors. Antiviral Res. 101, 105-112 (2014).
  23. Caillet-Saguy, C., Lim, S. P., Shi, P. Y., Lescar, J., Bressanelli, S. Polymerases of hepatitis C viruses and flaviviruses: structural and mechanistic insights and drug development. Antiviral Res. 105, 8-16 (2014).
  24. Frey, S. Temperature dependence of cell-cell fusion induced by the envelope glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 69, 1462-1472 (1995).
  25. Tscherne, D. M. Time- and temperature-dependent activation of hepatitis C virus for low-pH-triggered entry. J Virol. 80, 1734-1741 (2006).
  26. Madan, R. P. Molecular umbrellas: a novel class of candidate topical microbicides to prevent human immunodeficiency virus and herpes simplex virus infections. J Virol. 81, 7636-7646 (2007).
  27. Haywood, A. M., Boyer, B. P. Time and temperature dependence of influenza virus membrane fusion at neutral pH. J Gen Virol. 67 (Pt 12), 2813-2817 (1986).
  28. Haywood, A. M., Boyer, B. P. Sendai virus membrane fusion: time course and effect of temperature, pH, calcium, and receptor concentration). Biochemistry. 21, 6041-6046 (1982).
  29. Wang, G., Hernandez, R., Weninger, K., Brown, D. T. Infection of cells by Sindbis virus at low temperature. Virology. 362, 461-467 (2007).
  30. Lin, L. T. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. J Virol. 85, 4386-4398 (2011).
  31. Lin, L. T. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiol. 13, 187 (2013).
  32. Marukian, S. Cell culture-produced hepatitis C virus does not infect peripheral blood mononuclear cells. Hepatology. 48, 1843-1850 (2008).
  33. Baba, M., Snoeck, R., Pauwels, R., de Clercq, E. Sulfated polysaccharides are potent and selective inhibitors of various enveloped viruses, including herpes simplex virus, cytomegalovirus, vesicular stomatitis virus, and human immunodeficiency virus. Antimicrob Agents ChemotheR. 32, 1742-1745 (1988).
  34. Barth, H. Cellular binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparan sulfate. J Biol CheM. 278, 41003-41012 (2003).
  35. Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of Virology. , 3rd edn, ASM Press. (2008).
  36. Brown, M. G. Dramatic caspase-dependent apoptosis in antibody-enhanced dengue virus infection of human mast cells. J Leukoc Biol. 85, 71-80 (2009).
  37. Huang, Y., Cyr, S. L., Burt, D. S., Anderson, R. Murine host responses to respiratory syncytial virus (RSV) following intranasal administration of a Protollin-adjuvanted, epitope-enhanced recombinant G protein vaccine. J Clin Virol. 44, 287-291 (2009).
  38. Isaacson, M. K., Compton, T. Human cytomegalovirus glycoprotein B is required for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment, assembly, or egress. J Virol. 83, 3891-3903 (2009).
  39. Leonard, V. H., et al. Measles virus blind to its epithelial cell receptor remains virulent in rhesus monkeys but cannot cross the airway epithelium and is not shed. J Clin Invest. 118, 2448-2458 (2009).
  40. Ciesek, S. The green tea polyphenol, epigallocatechin-3-gallate, inhibits hepatitis C virus entry. Hepatology. 54, 1947-1955 (2011).
  41. Lin, L. T. Saikosaponin b2 is a naturally occurring terpenoid that efficiently inhibits hepatitis C virus entry. J Hepatol. 62, 541-548 (2015).
  42. Atkins, C., Evans, C. W., White, E. L., Noah, J. W. Screening methods for influenza antiviral drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7, 429-438 (2012).
  43. Zhang, J. Identification of novel virus inhibitors by influenza A virus specific reporter cell based screening. Antiviral Res. 93, 48-54 (2012).

Tags

علم المناعة، العدد 104، والتنمية المخدرات، والنشاط المضادة للفيروسات، دخول الفيروس في وقت مبكر، تعطيل الفيروسي، الفيروسي مرفق / ملزم، دخول الفيروس / الانصهار.
الفيروسية في وقت مبكر فحوصات دخول لتحديد وتقييم المركبات المضادة للفيروسات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J.,… More

Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J. Vis. Exp. (104), e53124, doi:10.3791/53124 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter