Protocol
Nota: verificare che tutte le procedure che coinvolgono coltura cellulare e l'infezione da virus sono condotte in cappe di biosicurezza certificate che sono appropriati per il livello di biosicurezza dei campioni essere manipolati. Per lo scopo di descrivere i protocolli, Gaussia luciferasi giornalista HCV-tag è usato come modello di virus 32. Nel contesto dei risultati rappresentativi, l'acido composti chebulagic (CHLA) e punicalagin (PUG) sono utilizzati come farmaci antivirali candidati che hanno come target le interazioni glicoproteina virale con glicosaminoglicani superficie cellulare durante la ingresso del virus presto passi 31. Eparina, che è noto per interferire con l'ingresso di molti virus 30,31,33,34, viene usato come trattamento controllo positivo in questo contesto. Per informazioni generali di base sulle tecniche di virologia, la propagazione di virus, determinazione del titolo del virus, e l'espressione della dose infettante in unità formanti placca (PFU), si concentrano unità formanti (FFU), o molteplicità di infezione (MOI), il lettore è reFERRED di riferimento 35. Per esempi precedenti e condizioni ottimizzate utilizzati per virus mostrati nei risultati rappresentativi, si rimanda ai riferimenti 30-32,36-39 e dettagli elencati nella Tabella 1, Figura 1A, 2A e Figura.
Cultura 1. Cella, Preparazione Compound, e Compound citotossicità
- Grow rispettiva linea cellulare per il sistema virus da analizzare (Tabella 1). Per HCV, far crescere le cellule Huh-7.5 in modificata mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS), 200 U / ml di penicillina G, 200 mg / ml di streptomicina, e 0,5 mg / ml di amfotericina B.
- Preparare i composti in esame ei controlli utilizzando rispettivi solventi: per esempio, sciogliere CHLA e PUG in dimetilsolfossido (DMSO); preparare eparina in acqua bidistillata sterile. Per tutte le diluizioni successive, utilizzare terreni di coltura.
Nota: Il concent finalerazione di DMSO nei trattamenti composto in esame è inferiore all'1% negli esperimenti; 1% DMSO è inclusa come trattamento controllo negativo nei saggi di confronto. - Determinare la citotossicità dei composti in esame (per esempio, CHLA e PUG) sulle cellule per l'infezione virale utilizzando una vitalità cellulare determinare reagente come XTT (2,3-bis [2-metossi-4-nitro-5-solfofenil] -5-fenilammino) carbonile] idrossido -2H-tetrazolio):
- Per HCV, sementi Huh-7,5 cellule in un piatto da 96 pozzetti (1 × 10 4 cellule per pozzetto) e incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% O / N per ottenere un monostrato.
- Applicare controllo DMSO (1%) e concentrazioni crescenti dei composti di prova e CHLA PUG (es. 0, 10, 50, 100, e 500 pM) ai pozzetti di coltura in triplice copia.
- Incubare a 37 ° C per 72 ore, poi scarta il mezzo in piastra e lavare le cellule con 200 ml di tampone fosfato salino (PBS) due volte.
- Aggiungere 100 ml di assaying soluzione dal kit in vitro tossicologia basata XTT ciascun pozzetto ed incubare le piastre a 37 ° C per altri 3 ore per permettere la produzione XTT formazan.
- Determinare l'assorbanza con un lettore per micropiastre alla lunghezza d'onda di prova di 492 nm e una lunghezza d'onda di riferimento di 690 nm.
- Calcolare la percentuale di cellule sopravvissute utilizzando la seguente formula: vitalità cellulare (%) = A / As × 100%, dove 'A' e 'Come' consultare l'assorbanza dei composti in esame e il controllo solvente (ex 1% DMSO. ) trattamenti, rispettivamente. Determinare la concentrazione di citotossicità cellulare 50% (CC 50) dei composti in esame da un software di analisi come GraphPad Prism secondo il protocollo del produttore.
2. Lettura di infezione virale
Nota: La lettura di infezione virale dipende dal sistema virus impiegato e può comportare metodi come saggi placca o measuring segnali giornalista da virus giornalista-tag. Il metodo per determinare l'infezione giornalista-HCV in base all'attività della luciferasi è descritto di seguito.
- Raccogliere i surnatanti dai pozzetti infetti e chiarire a 17.000 xg in una microcentrifuga per 5 minuti a 4 ° C.
- Mescolare 20 ml di surnatante di prova a 50 ml di luciferasi substrato dal kit assay luciferasi Gaussia e misurare direttamente con un luminometro secondo le istruzioni del produttore.
- Express HCV infettività come log 10 di unità di luce relativa (RLU) per determinare l'inibizione virale (%) e calcolare la concentrazione del 50% efficace (CE 50) dei composti in esame contro l'infezione da HCV utilizzando algoritmi da software GraphPad Prism secondo il protocollo del produttore.
3. disattivazione virale Assay
Nota: esempi di periodo di incubazione e la dose virale per vari virus unri elencati nella Figura 1A. Concentrazioni più elevate del virus possono essere testati aumentando il MOI / PFU.
- Seme Huh-7.5 celle in una piastra a 96 pozzetti (1 × 10 4 cellule per pozzetto) e incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% O / N per ottenere un monostrato.
- Incubare i composti di prova o di controllo (concentrazioni finali sono: CHLA = 50 micron; PUG = 50 micron; eparina = 1,000 mg / ml; DMSO = 1%) con le particelle di HCV a 37 ° C (Figura 1A, 'a lungo termine' ) in un rapporto 1: 1. Ad esempio, per un inoculo del virus 100 ml contenente 1 x 10 4 FFU, aggiungere 100 ml di una diluizione di lavoro 100 mM CHLA; questo produce trattamento CHLA ad una concentrazione finale di 50 mM.
- Diluire la miscela virus-farmaco (inefficace) concentrazione "sub-terapeutica" dei composti in esame. Ad esempio, la concentrazione di CHLA inefficace e PUG contro l'HCV è a 1 pM 31; dunquequesto richiede una diluizione di 50 volte della miscela virus farmaco che può essere realizzato con 9,8 ml di mezzo basale (medium di coltura delle cellule con 2% FBS).
Nota: La diluizione a concentrazione sub-terapeutica impedisce significativa interazione tra i composti di prova e la superficie della cellula ospite e consente l'esame degli effetti del trattamento sui virioni cell-free. Si noti che questa diluizione è dipendente dalla dose-risposta antivirale dei composti in esame contro la particolare infezione virale, ed è determinata prima di eseguire questo particolare test 31. - Per confronto, mescolare il virus con i composti di test e immediatamente diluito (senza periodo di incubazione) alla concentrazione sub-terapeutica prima di infezione (Figura 1A, 'a breve termine').
- Aggiungere 100 pl di miscela HCV-farmaco diluito sulla Huh-7.5 monostrato di cellule (la quantità di virus è ora a 1 x 10 2 FFU; finale MOI = 0.01) e incubare per 3 ore a 37 ° C per consentire viraleadsorbimento.
- Seguendo l'infezione, rimuovere il inoculi diluito e lavare delicatamente i pozzetti con 200 ml di PBS due volte.
Nota: Eseguire le lava delicatamente per evitare di sollevare le cellule. - Applicare 100 ml di terreno di base a ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C per 72 ore.
- Analizzare l'infezione risultante analizzando il surnatante per l'attività luciferasi come descritto in '2. Lettura di infezione virale '.
4. Viral Allegato Assay
Nota: esempi di periodo di incubazione e la dose virale per vari virus sono elencati nella Figura 2A, 'allegato'. Concentrazioni più elevate del virus possono essere testati aumentando il MOI / PFU.
- Seme Huh-7.5 celle in una piastra a 96 pozzetti (1 × 10 4 cellule per pozzetto) e incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% O / N per ottenere un monostrato.
- Pre-raffreddare i monostrati cellulari in piastre a 4 ° C for 1 ora.
- Co-trattare le cellule con HCV inoculo (MOI = 0.01) e composti di prova o controlli (concentrazioni finali sono: CHLA = 50 mM; PUG = 50 mM; eparina = 1,000 g / ml; DMSO = 1%) a 4 ° C per 3 ore. Ad esempio, per un inoculo del virus 90 ml contenente 1 x 10 2 FFU, aggiungere 10 ml di una diluizione di lavoro 500 mM CHLA; questo produce trattamento CHLA ad una concentrazione finale di 50 mM e un'infezione da HCV a MOI = 0.01 sul monostrato cellulare.
Nota: È importante effettuare l'esperimento a 4 ° C in quanto consente per il legame del virus, ma preclude ingresso che si verifica più efficiente a 37 ° C. Effettuare l'aggiunta di composti di virus e di test su ghiaccio e la conseguente incubazione in un 4 ° C frigorifero per garantire che la temperatura è mantenuta a 4 ° C. - Rimuovere il surnatante e lavare delicatamente il monostrato cellulare con 200 ml di ghiacciata PBS due volte.
Nota: Eseguire le lava delicatamente per evitare di sollevare le cellule <./ li> - Applicare 100 ml di terreno di base a ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C per 72 ore.
- Analizzare l'infezione risultante analizzando il surnatante per l'attività luciferasi come descritto in '2. Lettura di infezione virale '.
5. Viral Entrata / Fusion Assay
Nota: Esempio di periodi di incubazione e la dose virale per vari virus sono elencati nella Figura 2A 'Entry / fusione'. Concentrazioni più elevate del virus possono essere testati aumentando il MOI / PFU.
- Seme Huh-7.5 celle in una piastra a 96 pozzetti (1 × 10 4 cellule per pozzetto) e incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% O / N per ottenere un monostrato.
- Pre-raffreddare i monostrati cellulari in piastre a 4 ° C per 1 ora.
- Infettare le cellule con HCV (MOI = 0,01) a 4 ° C per 3 ore. Ad esempio, utilizzare un inoculo del virus 100 ml contenente 1 x 10 2 FFU.
Nota: Eseguire la addizione dell'inoculo virale su ghiaccio e la conseguente incubazione in un 4 ° C frigorifero per mantenere la temperatura a 4 ° C, che permette virale entrata ma non vincolante. - Rimuovere il surnatante e lavare delicatamente i monostrati cellulari con 200 ml di ghiacciata PBS due volte.
Nota: Eseguire le lava delicatamente per evitare di sollevare le cellule. - Trattare i pozzetti con i composti in esame o controlli (concentrazioni finali sono: CHLA = 50 mM; PUG = 50 mM; eparina = 1,000 g / ml; DMSO = 1%) e incubare a 37 ° C per 3 ore. Ad esempio, aggiungere 10 ml di una diluizione di lavoro di 500 micron CHLA a 90 ml di media, mescolare, e trattare i pozzetti; questo produce trattamento CHLA ad una concentrazione finale di 50 mM.
Nota: Il passaggio da 4 ° C a 37 ° C facilita ora l'evento di ingresso / fusione virale e quindi permette la valutazione dell'effetto composti di prova 'su questo particolare punto. - Aspirare il surnatante contenente droga e rimuovere non interiorizzatovirus extracellulari né dal lavaggio con 200 ml di tampone citrato (citrato di sodio 50 mM, cloruro di potassio 4 mM, pH 3,0) o PBS. Applicare 100 ml di terreno di base prima di incubazione a 37 ° C per 72 ore.
- Analizzare l'infezione risultante analizzando il surnatante per l'attività luciferasi come descritto in '2. Lettura di infezione virale '.
Representative Results
Nella figura 1, il 'inattivazione virale test' stata effettuata per verificare se due specifici composti CHLA naturale e PUG potrebbero inattivare i diversi virus con involucro in stato senza cellulare e prevenire l'infezione successiva. La citotossicità e antivirale dose-risposta di questi composti sono stati determinati prima di eseguire lo studio meccanicistica 31. I virus sono stati pretrattati con composti in esame e poi le miscele virus-farmaco sono stati diluiti a concentrazioni sub-terapeutiche prima dell'inoculazione sul rispettivo monostrato cellulare per ogni sistema virus. Come mostrato in Figura 1, sia CHLA e PUG sembravano interagire con i virioni cellule libere, con gravi effetti irreversibili che proteggeva il monostrato cellulare dalla successiva infezione. I due composti in esame ha realizzato un vicino di inibizione 100% contro HCMV, HCV e DENV-2, mentre un 60 - blocco 80% è stata osservata contro MV e RSV. Questi risultati Suggest che CHLA e PUG hanno un impatto diretto su queste particelle virali libere inattivando loro e neutralizzando la loro infettività.
Nella figura 2, l'allegato e di ingresso / test di fusione sono stati eseguiti per esplorare l'effetto di CHLA e PUG contro questi eventi rapida entrata correlati virali da HCMV, HCV, DENV-2, MV, e RSV. Sia CHLA e PUG efficacemente impedito vincolante del virus esaminati sui rispettivi cellula ospite come mostrato dalla inibizione virale risultante (Figura 2, 'Allegato': luce barre grigie). L'effetto inibitorio sulla attaccamento virus da entrambi i composti era simile contro HCMV (Figura 2B), HCV (Figura 2C), DENV-2 (Figura 2D), e RSV (Figura 2F), che vanno da 90 - 100%. D'altra parte, PUG sembrava essere più efficace contro CHLA MV assorbente (figura 2E), con il tasso di inibizione della two composti variabili tra 50 - 80%. L'eparina trattamento di controllo, che è noto per impedire l'ingresso di molti virus, anche inibito attaccamento di HCMV, DENV-2, RSV, annuncio MV, ma era meno efficace contro HCV. La conseguente 'test di ingresso / fusione virale' esaminato se CHLA e PUG conservato la loro attività durante la fase di entrata del virus / fusione (Figura 2, 'Entry / Fusion': barre grigio scuro). Ancora una volta, sia CHLA e PUG stati osservati compromettere efficacemente l'ingresso virale passo / fusione dei virus esaminati (Figura 2B - F), ottenendo un 50 - effetto protettivo 90% corrisponde monostrato cellulare. Eparina anche potentemente inibito l'ingresso / fusione DENV-2 e infezioni da RSV, ma era meno efficace contro HCMV, HCV, e MV (<40% di inibizione in media).
| Virus | Tipo di cella |
| HCMV | <td> HEL|
| HCV | Huh-7.5 |
| DENV-2 | Vero |
| MV | CHO-SLAM |
| RSV | HEp-2 |
Tabella 1:. Tipo cellula ospite per infezione virale è indicato il tipo cellulare utilizzato per ogni sistema infezione virale descritto nei risultati rappresentativi. Ulteriori dettagli riguardanti le cellule possono essere trovati in riferimento 31.
Figura 1. L'inattivazione di infezioni virali da parte CHLA composti di prova e PUG diversi virus sono stati trattati con i composti di prova per un lungo periodo. (Incubate per 1,5-3 ora prima titolazione; luce barre grigie) o breve periodo (immediatamente diluita; grigio scuro bar) a 37 ° C prima di una diluizione di concentrazione sub-terapeuticizione e successiva analisi di infezione delle cellule rispettivo ospitanti. (A) Schema dell'esperimento (mostrato a sinistra) con la concentrazione di virus finale (PFU / pozzetto o MOI), il periodo di incubazione del virus farmaco-lungo termine (i), e tempo di incubazione successivo (ii) indicato per ciascun virus nella tabella a destra. Analisi per (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV, e (F) RSV sono indicati in ogni pannello supplementare. I risultati sono riportati contro il trattamento di controllo negativo DMSO per infezione da virus ed i dati indicati sono il mezzo ± errori standard della media (SEM) da tre esperimenti indipendenti. Questa cifra è stata modificata da riferimento 31. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Valutazione delle attività antivirale del CHLA composti di prova e PUG contro virus e attaccamento entrata / fusion. (A) La procedura sperimentale, concentrazione virale (PFU / pozzetto o MOI), e il tempo di aggiunta e trattamento con i composti in esame (i, ii, iii) sono presentati per ogni virus negli schemi e le tabelle associate. Nell'analisi allegato virus (luce barre grigie), monostrati di diversi tipi cellulari sono stati pre-raffreddato a 4 ° C per 1 ora, poi co-trattati con rispettivi virus e composti di prova a 4 ° C (1.5 - 3 ore; i) prima di lavare via i monostrati e composti di prova per la successiva incubazione (37 ° C; ii) e l'esame di infezione da virus. In entrata virus / analisi fusione (barre grigio scuro), monostrati di cellule sono stati seminati pre-raffreddata a 4 ° C per 1 ora e poi sfidato con rispettivi virus a 4 ° C per 1,5 - 3 ore (i). Le cellule sono state poilavata e trattata con i composti di prova per un periodo di incubazione addizionale (ii) durante il quale la temperatura è stata spostata a 37 ° C per facilitare l'evento di ingresso / fusione virale. Al termine dell'incubazione, virus extracellulari sono stati rimossi da uno tampone citrato (pH 3,0) o lavaggi PBS e le cellule sono state ulteriormente incubate (iii) per l'analisi di virus. Risultati per (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV, e (F) RSV sono indicati in ogni pannello supplementare. I dati sono riportati contro il trattamento di controllo negativo DMSO di infezione da virus e sono presentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti. Questa cifra è stata modificata da riferimento 31. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Microplate reader | Thermo Scientific | 89087-320 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | |
| BioLux Gaussia luciferase assay kit | New England Biolabs | E3300L | |
| Luminometer | Promega | GloMax-20/20 | |
| Sodium citrate, dihydrate | Sigma | 71402 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 |
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