Protocol
注：細胞培養およびウイルス感染に関連するすべての手続きが処理されたサンプルのバイオセーフティーレベルに適した認定バイオセーフティフードに行われていることを確認してください。プロトコルを説明する目的のために、ガウシアルシフェラーゼレポータータグ付きHCVモデルウイルス32として使用されます。代表的な結果との関連では、化合物chebulagic酸（CHLA）とpunicalagin（PUG）を早期にウ イルスの侵入31ステップの間に細胞表面グ リコサミノグリカンとウイルス糖タンパク質相互作用を標的とする候補抗ウイルス剤として使用されています。多くのウイルス30,31,33,34の進入を妨害することが知られているヘパリンは、このような状況における陽性対照処理として使用されます。基本的なウイルス学技術の背景、ウイルスの増殖、ウイルス力価の決意、そしてプラーク形成単位で感染用量（PFU）の発現のために、形成単位（FFU）、または感染（MOI）を多数集中、読者は再です35を参照するように移し。前の例と代表的な結果に示されているウイルスを使用する最適化された条件のために、読者は 、表1、図1A、図2Aに記載されている参考文献30-32,36-39などの詳細に言及されます。
1.細胞培養、化合物の調製、および化合物の細胞毒性
- 分析されるウイルス感染システム（ 表1）のためのそれぞれの細胞株を成長させます。 HCVについては、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した、200 U / mlのペニシリンG、200 / mlのストレプトマイシン、および0.5 / mlの中のHuh-7.5細胞は、アムホテリシンBを成長します
- それぞれの溶媒を用いて、試験化合物およびコントロールを準備する：例えば、ジメチルスルホキシド（DMSO）にCHLAとPUGを溶解します。無菌二重蒸留水にヘパリンを準備します。後続のすべての希釈のために、培養培地を使用しています。
注：最後のコンセント試験化合物治療におけるDMSOの比は、実験には1％未満です。 1％のDMSOを比較するためのアッセイで陰性対照処理として含まれています。 - そのようなXTT（2,3-ビス[2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル]などの試薬 を決定する細胞生存率を使用して、ウイルス感染細胞に対する試験化合物（例えば、CHLAとPUG）の細胞毒性を決定します-5-フェニルアミノ）カルボニル] -2H-テトラゾリウムヒドロキシド）。
- HCVについては、96ウェルプレート（ウェル当たり1×10 4細胞 ）中のHuh-7.5細胞を播種し、単層を得るために、5％CO 2インキュベータO / N中で37℃でインキュベートします。
- 三連で培養ウェルにDMSOコントロール（1％）または試験化合物のCHLAとPUGの濃度の増加（例：0、10、50、100、および500μM）を適用します。
- その後、72時間37℃でインキュベートし、プレート中の培地を廃棄し、二回リン酸緩衝生理食塩水を200μl（PBS）で細胞を洗浄します。
- assayin100μlのを追加Gの各ウェルにXTTベースのインビトロ毒性アッセイキットからの溶液とXTTをホルマザンの生産を可能にするために、別の3時間37℃で培養します。
- 492 nmでのテスト波長でマイクロプレートリーダーおよび690nmでの参照波長で吸光度を決定します。
- ここで、「時」と試験化合物と溶媒対照（元の吸光度を参照してください」と」、細胞生存率（％）=×100％として、/で1％のDMSO：次の式を用いて細胞の生存率を計算します。それぞれ）の治療、。製造業者のプロトコルに従って、このようなグラフパッドプリズムなどの分析ソフトウェアから試験化合物の50％細胞傷害（CC 50）の濃度を決定します。
ウイルス感染の2読み出し
注意：ウイルス感染の読み出しが用いられるウイルスのシステムに依存し、そのようなプラークアッセイやMEAなどの方法を含むことができますレポータータグ付きウイルスからのレポーターシグナルをジューリング。ルシフェラーゼレポーター活性に基づくレポーターHCV感染を検出するための方法について説明します。
- 感染したウェルからの上清を収集し、4℃で5分間、微量で17000×gで明らかにする。
- ガウルシフェラーゼアッセイキットからのルシフェラーゼ基質の50μlにテスト20μlの上清を混合し、直接製造元の指示に従って、ルミノメーターで測定します。
- ウイルス阻害（％）を決定するための相対的光単位（RLU）のlog 10として HCV感染を発現し、そして製造業者のプロトコルに従ってグラフパッドプリズムソフトウェアアルゴリズムを用いてHCV感染に対する試験化合物の50％有効濃度（EC 50）を計算します 。
3.ウイルス不活性化アッセイ
注：さまざまなウイルスの潜伏期間およびウイルス用量の例としてA図1Aに記載されている再。ウイルスのより高い濃度もMOI / PFUを増加させることによって試験することができます。
- シードホ- 7.5 96ウェルプレート中の細胞（ウェル当たり1×10 4細胞 ）と単層を得るために、5％のCO 2インキュベーター中、37℃でO / Nインキュベートします。
- 試験化合物またはコントロールインキュベート（最終濃度は以下のとおりです。CHLAを= 50μM; PUG = 50μM;ヘパリン=千/ mlの; DMSO = 1％）、37℃（ 図1AでのHCV粒子と、「長期」 ）1：1の比率。例えば、1×10 4 FFUを含む100μlのウイルス接種物に、100μMのCHLA作業希釈液100μlを追加します。これは、50μMの最終濃度でCHLA治療をもたらします。
- 試験化合物の「準治療」（無効）濃度のウイルス - 薬物混合物を希釈します。例えば、HCVに対するCHLAとPUGの非有効濃度は1μM31です。故にこれは、基本培地の9.8 mlの（2％FBSでの細胞培養培地）を用いて達成することができるウイルス - 薬物混合物の50倍希釈を必要とします。
注：サブ治療濃度に希釈が、試験化合物と宿主細胞表面との間に有意な相互作用を防止し、無細胞ビリオンに対する治療効果の検討を可能にします。この希釈は、特定のウイルス感染に対する試験化合物の抗ウイルス用量応答に依存して、この特定のアッセイ31を実行する前に決定されることに留意されたいです。 - 比較のために、試験化合物とウイルスを混合し、直ちにサブ治療濃度感染前に（ 図1A、「短期」）に（何の潜伏期間）を希釈していません。
- （ウイルスの量は、1×10 2 FFUになりました;最終MOI = 0.01）ホ-7.5細胞単層上に希釈したHCV-薬物混合物の100μlを添加して、ウイルスを可能にするために、37℃で3時間インキュベート吸着。
- 感染後、希釈された接種物を除去し、軽く二回200μlのPBSでウェルを洗浄します。
注：細胞を持ち上げ避けるために静かに洗浄液を実行します。 - 各ウェルに基礎培地100μlを適用し、72時間、37℃でインキュベートします。
- 2 'で説明したようにルシフェラーゼ活性のために上清をアッセイすることによって生じた感染を分析。ウイルス感染の読み出し」。
4.ウイルスの付着アッセイ
注：さまざまなウイルスの潜伏期間およびウイルス用量の例は、 図2Aに記載された「添付」されています。ウイルスのより高い濃度もMOI / PFUを増加させることによって試験することができます。
- シードホ- 7.5 96ウェルプレート中の細胞（ウェル当たり1×10 4細胞 ）と単層を得るために、5％のCO 2インキュベーター中、37℃でO / Nインキュベートします。
- 4°C FOでプレート中の細胞単層を事前に冷やしますR 1時間。
- HCV接種（MOI = 0.01）を有する細胞と試験化合物またはコントロール共同治療（最終濃度は以下のとおりです。= 50μMCHLAを、PUG = 50μM;ヘパリン=1,000μgの/ mlの; DMSO = 1％）、4℃でのために3時間。例えば、1×10 2 FFUを含む90μlのウイルス接種物に、500μMのCHLA作業希釈液10μlを添加します。これは、50μMの最終濃度と細胞単層にMOI = 0.01でHCVによる感染でCHLA治療をもたらします。
注：これは、ウイルスの結合を可能にするが、最も効率的に、37℃で発生したエントリを排除するので、それは4℃で実験を行うことが重要です。温度を4℃に維持されることを保証するために氷と4℃の冷蔵庫で続くインキュベーションにウイルスおよび試験化合物の添加を行います。 - 上清を除去し、優しく二回氷冷PBS200μlで細胞単層を洗浄します。
注：細胞を持ち上げ避けるために静かに洗浄液を実行します<。/ LI> - 各ウェルに基礎培地100μlを適用し、72時間、37℃でインキュベートします。
- 2 'で説明したようにルシフェラーゼ活性のために上清をアッセイすることによって生じた感染を分析。ウイルス感染の読み出し」。
5.ウイルスの侵入/融合アッセイ
注：インキュベーション期間および種々のウイルスのためのウイルスの投与量の例は、 図2（a）「侵入/融合」に記載されています。ウイルスのより高い濃度もMOI / PFUを増加させることによって試験することができます。
- シードホ- 7.5 96ウェルプレート中の細胞（ウェル当たり1×10 4細胞 ）と単層を得るために、5％のCO 2インキュベーター中、37℃でO / Nインキュベートします。
- 1時間4℃でプレート中の細胞単層を事前に冷やし。
- 3時間、4℃で、HCVを有する細胞（MOI = 0.01）に感染。例えば、1×10 2 FFUを含む100μlのウイルス接種物を使用しています。
注意：ADDIを実行氷の上でウイルス接種し、ウイルス結合ではなく、エントリを許可し、4℃、温度を維持するために4℃の冷蔵庫でその後のインキュベーション化。 - 上清を除去し、優しく二回氷冷PBS200μlで細胞単層を洗浄します。
注：細胞を持ち上げ避けるために静かに洗浄液を実行します。 - （最終濃度は以下のとおりです。PUG = 50μM;ヘパリン=千/ mlの、CHLA =50μMのDMSO = 1％）の試験化合物またはコントロールでウェルを治療し、3時間37℃でインキュベートします。たとえば、メディアの90μlに500μMのCHLAワーキング希釈液10μlを加え混ぜ、ウェルを扱います。これは、50μMの最終濃度でCHLA治療をもたらします。
注：37℃〜4℃からのシフトは現在、ウイルスの侵入/融合事象を容易にし、したがって、この特定のステップの試験化合物」効果の評価を可能にします。 - 薬物含有上清を吸引除去し、非内在化を削除クエン酸緩衝液（50mMクエン酸ナトリウム、4mMの塩化カリウム、pHは3.0）または200μlのPBSのいずれかで洗浄することにより細胞外ウイルス。 72時間37℃でインキュベートする前に、基礎培地100μlを適用します。
- 2 'で説明したようにルシフェラーゼ活性のために上清をアッセイすることによって生じた感染を分析。ウイルス感染の読み出し」。
Representative Results
図1では 、「ウイルス不活性化アッセイは、「2つの特定の天然化合物CHLAとPUGは、細胞のない状態で別のエンベロープウイルスを不活性化し、その後の感染を防止することができるかどうかを調べるために行きました。細胞毒性化合物及びこれらの化合物の抗ウイルス用量応答は、従来の機構的研究31を実行することに決定しました。ウイルスは、試験化合物で前処理し、その後、ウイルス薬の混合物は、各ウイルスシステムのそれぞれの細胞単層に接種する前に、副治療濃度に希釈しました。 図1に示すように 、CHLAとPUG両方がその後の感染から細胞単層を保護不可逆的効果をもたらす、無細胞ビリオンと相互作用するように思われました。 80％ブロックMV及びRSVに対して観測された - 60に対し2つの試験化合物は、HCMV、HCV、およびDENV-2に対してほぼ100％の阻害を達成しました。これらの結果はsuggEST CHLAとPUGは、それらを不活性化し、その感染性を中和することにより、これらの無料のウイルス粒子に直接的な影響を持っていること。
図2では 、添付ファイル、および侵入/融合アッセイは、HCMV、HCV、DENV-2、MV、およびRSVからこれらの初期のウイルスの侵入関連イベントに対してCHLAとPUGの影響を調査するために実施しました。 CHLAとPUGの両方が効果的に得られたウイルス感染の阻害（：灰色のバーを点灯図2、「添付ファイル」）によって示されるように、それぞれの宿主細胞に調査し、ウイルスの結合を防ぎます。 100％ -両方の化合物によるウイルスの添付ファイルに対する抑制効果は90に至るまで、HCMV（ 図2B）、HCV（図2C）、DENV-2（図2D）、およびRSV（ 図2F）に対して同様でした。一方、PUGはTWの阻害率と、（ 図2E）結合MV CHLAに対してより効果的であると思われました80％ - O化合物は、50の間で変化します。多くのウイルスの侵入を阻止することが知られている制御処理ヘパリンもまた、阻害さHCMVの付着、DENV-2、RSV、広告MVが、HCVに対してあまり効率的でした。その後の「ウイルスの侵入/融合アッセイは、「CHLAとPUGは、ウイルスの侵入/融合相中にその活性を保持しているか否かを調べた（ 図2、「侵入/融合」：暗い灰色のバー）。それぞれの細胞単層の90％保護効果- 50を得、 -ここでも、CHLAとPUGの両方を効果的に（F図2B）を調べ、ウイルスのウイルスの侵入/融合ステップを損なうことが観察されました。 DENV-2のヘパリンも強力に阻害侵入/融合およびRSV感染症が、HCMV、HCV、及びMV（平均の<40％阻害）に対してあまり有効でした。
| このウイルス | 細胞型 |
| HCMV | <TD> HEL|
| HCV | ホ - 7.5 |
| DENV-2 | ベロ |
| MV | CHO-SLAM |
| RSV | HEp-2 |
表1：ウイルス感染のための宿主細胞型の代表的な結果で説明した各ウイルス感染システムに用いられる細胞型が示されています。細胞に関するさらなる詳細は、参考文献31に見出すことができます。
図1.試験化合物のCHLAとPUGによるウイルス感染の不活性化の異なるウイルスが長期間にわたって試験化合物で処理した。（1.5インキュベート-滴定前に3時間、ライトグレーの棒グラフ）または短期間（すぐに希釈し、濃い灰色サブ治療concentraに希釈前の37℃でのバー）ると、各宿主細胞に感染のその後の分析最終ウイルス濃度（左図）実験（A）回路図（PFU /ウェルまたはMOI）、長期ウイルス薬のインキュベーション期間（I）および（ii）その後のインキュベーション時間は、右側のテーブル内の各ウイルスのために示しました。 （B）HCMV、（C）HCVの分析は、（D）DENV-2、（E）MV、及び（F）RSVは、各追加のパネルに示されています。結果は、3回の独立した実験からの平均（SEM）の標準誤差±手段は、ウイルス感染のDMSO陰性対照処理と示されたデータに対してプロットされています。この図は、参照31から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.ウイルスの付着および侵入/融合に対する試験化合物のCHLAとPUGの抗ウイルス活性の評価。（A）実験手順、ウイルス濃度（PFU /ウェルまたはMOI）、および試験化合物との付加及び処理の時間（I、II、III）は回路図および関連する表に各ウイルスのために提示されています。ウイルス付着分析（薄い灰色の棒）において、異なる細胞型の単層を、4℃でそれぞれのウイルスおよび試験化合物と同時処理し、その後、1時間4℃で予め冷却した（1.5 - 3時間; I）その後のインキュベーションのために接種し、および試験化合物を洗浄する前に、（37℃; ii）及びウイルス感染の検査。ウイルスの侵入/融合分析（濃い灰色の棒）で、シードされた細胞の単層は、1時間4℃で予備冷却し、次いで1.5 4℃でそれぞれのウイルスでチャレンジ - 3時間（I）。次いで、細胞を洗浄し、温度がウイルス侵入/融合事象を促進するために37°Cに移行した時に追加のインキュベーション期間のための試験化合物（II）で処理しました。インキュベーションの終わりに、細胞外のウイルスは、いずれのクエン酸緩衝液（pH 3.0）またはPBS洗浄によって除去し、細胞をさらにウイルス感染の分析のために（III）でインキュベートしました。 （B）HCMV、（C）HCVについての結果は、（D）DENV-2、（E）MV、及び（F）RSVは、各追加のパネルに示されています。データは、ウイルス感染のDMSO陰性対照処理に対してプロットされており、3つの独立した実験からの平均±SEMとして示されます。この図は、参照31から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Microplate reader | Thermo Scientific | 89087-320 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | |
| BioLux Gaussia luciferase assay kit | New England Biolabs | E3300L | |
| Luminometer | Promega | GloMax-20/20 | |
| Sodium citrate, dihydrate | Sigma | 71402 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 |
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