Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

प्रारंभिक वायरल एंट्री पहचान के लिए assays और antiviral यौगिकों का मूल्यांकन

Published: October 29, 2015 doi: 10.3791/53124
Automatic Translation
1,2, 3, 4,5, 2,4, 3,6
1Department of Chinese Medicine, Taipei Medical University Hospital, 2Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 3Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 4Division of Hematology and Oncology, Department of Internal Medicine, Taipei Medical University Hospital, 5Department of Internal Medicine, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 6Graduate Institute of Medical Sciences, College of Medicine, Taipei Medical University

Protocol

नोट: सेल संस्कृति और वायरस के संक्रमण से जुड़े सभी प्रक्रियाओं संभाला जा रहा नमूनों की जैव सुरक्षा स्तर के लिए उपयुक्त हैं कि प्रमाणित जैव सुरक्षा डाकू में आयोजित की जाती हैं कि सुनिश्चित करें। प्रोटोकॉल का वर्णन करने के प्रयोजन के लिए, Gaussia luciferase संवाददाता टैग एचसीवी एक मॉडल वायरस 32 के रूप में इस्तेमाल किया जाता है। प्रतिनिधि परिणामों के संदर्भ में, यौगिकों chebulagic एसिड (CHLA) और punicalagin (PUG) 31 कदम जल्दी वायरल प्रवेश के दौरान कोशिका की सतह ग्लाइकोसअमिनोग्लाइकान्स के साथ वायरल ग्लाइकोप्रोटीन बातचीत लक्ष्य है कि उम्मीदवार विषाणु-विरोधी के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। कई वायरस 30,31,33,34 के प्रवेश के साथ हस्तक्षेप करने के लिए जाना जाता है जो हेपरिन, इस तरह के संदर्भ में एक सकारात्मक नियंत्रण के उपचार के रूप में प्रयोग किया जाता है। बुनियादी विषाणु विज्ञान तकनीक पर पृष्ठभूमि, वायरस के प्रसार, वायरस अनुमापांक का दृढ़ संकल्प, और पट्टिका गठन इकाइयों में संक्रामक खुराक (pfu) की अभिव्यक्ति के लिए, गठन इकाइयों (FFU), या संक्रमण (MOI) की बहुलता ध्यान देते हैं, पाठक फिर से है35 संदर्भ के लिए ferred। पूर्व के उदाहरण और प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया गया है वायरस के लिए इस्तेमाल किया अनुकूलित शर्तों के लिए, पाठक तालिका 1, चित्रा 1 ए, और चित्रा 2A में सूचीबद्ध संदर्भों 30-32,36-39 के रूप में अच्छी तरह से जानकारी के लिए भेजा है।

1. सेल संस्कृति, यौगिक तैयार करना, और यौगिक cytotoxicity

  1. वायरस के संक्रमण प्रणाली के लिए संबंधित सेल लाइन बढ़ो (तालिका 1) विश्लेषण किया जाना है। एचसीवी के लिए, Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक (DMEM), 200 यू / एमएल पेनिसिलिन जी, 200 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन में हं 7.5 कोशिकाओं के विकास, और 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल amphotericin बी
  2. उनके संबंधित सॉल्वैंट्स का उपयोग कर परीक्षण यौगिकों और नियंत्रण तैयार: उदाहरण के लिए, CHLA और डाइमिथाइल sulfoxide में PUG (DMSO) को भंग; बाँझ डबल आसुत जल में हेपरिन तैयार करते हैं। बाद के सभी dilutions के लिए, संस्कृति मीडिया का उपयोग करें।
    नोट: अंतिम एकाग्रतापरीक्षण यौगिक उपचार में DMSO के राशन प्रयोगों में 1% से कम है; 1% DMSO तुलना के लिए assays में एक नकारात्मक नियंत्रण के इलाज के रूप में शामिल किया गया है।
  3. ऐसे XTT के रूप में अभिकर्मक का निर्धारण करने के लिए एक सेल व्यवहार्यता का उपयोग करके वायरल संक्रमण के लिए कोशिकाओं पर परीक्षण यौगिकों (जैसे, CHLA और पग) की cytotoxicity का निर्धारण करते हैं (2,3-बीआईएस [2-methoxy-4-नाइट्रो-5-sulfophenyl] -5-phenylamino) -carbonyl] -2H-tetrazolium हाइड्रॉक्साइड):
    1. एचसीवी के लिए, एक 96 अच्छी तरह से थाली में हं 7.5 कोशिकाओं (अच्छी तरह से प्रति 1 × 10 4 कोशिकाओं) बीज और एक monolayer प्राप्त करने के लिए एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर हे / एन में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. तीन प्रतियों में संस्कृति कुओं के लिए DMSO के नियंत्रण (1%) या परीक्षण यौगिकों CHLA और पग की बढ़ती सांद्रता (उदा। 0, 10, 50, 100, और 500 माइक्रोन) को लागू करें।
    3. तो, 72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं थाली में मध्यम त्यागने और दो बार फॉस्फेट खारा बफर के 200 μl (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    4. Assayin के 100 μl जोड़ेंजी अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए XTT आधारित इन विट्रो विष विज्ञान परख किट से समाधान और XTT formazan उत्पादन की अनुमति के लिए एक और 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।
    5. 492 एनएम का एक परीक्षण तरंग दैर्ध्य में एक microplate पाठक और 690 एनएम के संदर्भ तरंग दैर्ध्य के साथ absorbance के निर्धारण करते हैं।
    6. । परीक्षण यौगिकों के absorbance और विलायक नियंत्रण करने के लिए देखें (पूर्व 1% DMSO 'के रूप में' 100%, जहां 'पर' × के रूप में / सेल व्यवहार्यता (%) में = और: निम्न सूत्र का उपयोग कोशिकाओं जीवित रहने के प्रतिशत की गणना क्रमशः) उपचार,। निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार इस तरह के GraphPad चश्मे के रूप में एक विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर से परीक्षण यौगिकों का 50% सेलुलर cytotoxicity (सीसी 50) की एकाग्रता का निर्धारण।

वायरल संक्रमण के 2. पढ़ा गया

नोट: वायरल संक्रमण के readout इस्तेमाल किया वायरस सिस्टम पर निर्भर करता है और इस तरह की पट्टिका assays या विदेश मंत्रालय के तरीके के रूप में शामिल कर सकते हैंसंवाददाता टैग वायरस से रिपोर्टर संकेतों Suring। luciferase संवाददाता गतिविधि पर आधारित रिपोर्टर-एचसीवी संक्रमण का पता लगाने के लिए विधि नीचे वर्णित है।

  1. संक्रमित कुओं से supernatants लीजिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एक microcentrifuge में 17,000 XG पर स्पष्ट।
  2. Gaussia luciferase परख किट से luciferase सब्सट्रेट के 50 μl के लिए परीक्षण सतह पर तैरनेवाला के 20 μl मिक्स और सीधे निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक luminometer साथ मापने।
  3. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार GraphPad चश्मे सॉफ्टवेयर से एल्गोरिदम का उपयोग एचसीवी संक्रमण के खिलाफ टेस्ट यौगिकों का 50% प्रभावी एकाग्रता (ईसी 50) वायरल निषेध (%) का निर्धारण करने के लिए रिश्तेदार प्रकाश इकाइयों (RLU) के प्रवेश के रूप में 10 एचसीवी संक्रामकता एक्सप्रेस और गणना।

3. वायरल निष्क्रियता परख

नोट: विभिन्न वायरस के लिए ऊष्मायन अवधि के उदाहरण और वायरल खुराक एकचित्रा 1 ए में सूचीबद्ध कर रहे हैं। वायरस के उच्च सांद्रता भी MOI / PFU बढ़ाने के द्वारा परीक्षण किया जा सकता है।

  1. बीज हं-7.5 एक 96 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं (अच्छी तरह से प्रति 1 × 10 4 कोशिकाओं) और एक monolayer प्राप्त करने के लिए एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं।
  2. परीक्षण यौगिकों या नियंत्रण सेते (अंतिम सांद्रता हैं: CHLA = 50 माइक्रोन; PUG = 50 माइक्रोन; हेपरिन = 1000 माइक्रोग्राम / एमएल, DMSO = 1%) 37 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 1 ए पर एचसीवी कणों के साथ, 'लंबी अवधि' ) एक 1: 1 अनुपात। उदाहरण के लिए, 1 एक्स 10 4 FFU युक्त 100 μl वायरस inoculum करने के लिए, एक 100 माइक्रोन CHLA काम कर कमजोर पड़ने के 100 μl जोड़ने; इस 50 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता में CHLA उपचार अर्जित करता है।
  3. वायरस से दवा मिश्रण परीक्षण यौगिकों के लिए "उप-चिकित्सीय" (अप्रभावी) एकाग्रता पतला। उदाहरण के लिए, एचसीवी के खिलाफ CHLA और पग के अप्रभावी एकाग्रता 1 माइक्रोन 31 में है; इसलियेइस (2% FBS के साथ सेल संवर्धन माध्यम) बेसल माध्यम की 9.8 मिलीलीटर के साथ पूरा किया जा सकता है, जो वायरस दवा मिश्रण की एक 50 गुना कमजोर पड़ने की आवश्यकता है।
    नोट: उप-चिकित्सीय एकाग्रता के कमजोर पड़ने परीक्षण यौगिकों और मेजबान कोशिका की सतह के बीच महत्वपूर्ण बातचीत को रोकता है और सेल मुक्त virions पर उपचार के प्रभाव की परीक्षा की अनुमति देता है। इस कमजोर पड़ने विशेष वायरल संक्रमण के खिलाफ टेस्ट यौगिकों के एंटीवायरल खुराक प्रतिक्रिया पर निर्भर है, और यह विशेष रूप से परख 31 प्रदर्शन करने के लिए पूर्व निर्धारित होता है कि ध्यान दें।
  4. तुलना के लिए, परीक्षण यौगिकों के साथ वायरस मिश्रण और तुरंत उप चिकित्सीय एकाग्रता पूर्व संक्रमण (चित्रा 1 ए, 'शॉर्ट टर्म') के लिए (कोई ऊष्मायन अवधि) पतला।
  5. और वायरल अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए सेते; हं-7.5 सेल monolayer पर पतला एचसीवी-दवा के मिश्रण के 100 μl जोड़ें (अंतिम MOI = 0.01 वायरस की मात्रा 1 एक्स 10 2 FFU पर अब है)सोखना।
  6. संक्रमण के बाद, पतला inocula हटाने और धीरे दो बार पीबीएस के 200 μl के साथ कुओं धो लें।
    नोट: कोशिकाओं उठाने से बचने के लिए धीरे washes के प्रदर्शन करना।
  7. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए बेसल माध्यम के 100 μl लागू करें और 72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  8. 2 'के रूप में वर्णित luciferase गतिविधि के लिए सतह पर तैरनेवाला परख करने की क्रिया द्वारा परिणामस्वरूप संक्रमण का विश्लेषण करें। वायरल संक्रमण के पढ़ा गया '।

4. वायरल अनुलग्नक परख

नोट: विभिन्न वायरस के लिए ऊष्मायन अवधि और वायरल खुराक के उदाहरण हैं, चित्रा 2A में सूचीबद्ध 'लगाव' कर रहे हैं। वायरस के उच्च सांद्रता भी MOI / PFU बढ़ाने के द्वारा परीक्षण किया जा सकता है।

  1. बीज हं-7.5 एक 96 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं (अच्छी तरह से प्रति 1 × 10 4 कोशिकाओं) और एक monolayer प्राप्त करने के लिए एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस के लिए कम से प्लेटों में सेल monolayers पूर्व ठंडआर 1 घंटा।
  3. एचसीवी inoculum के साथ कोशिकाओं (MOI 0.01 =) और परीक्षण यौगिकों या नियंत्रण मिलकर इलाज (अंतिम सांद्रता हैं: CHLA = 50 माइक्रोन; DMSO = 1% PUG = 50 माइक्रोन; हेपरिन = 1000 माइक्रोग्राम / एमएल) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटा। उदाहरण के लिए, 1 एक्स 10 2 FFU युक्त एक 90 μl वायरस inoculum करने के लिए, एक 500 माइक्रोन CHLA काम कर कमजोर पड़ने के 10 μl जोड़ने; इस CHLA 50 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता में उपचार और MOI में एचसीवी से एक संक्रमण = 0.01 सेल monolayer पर अर्जित करता है।
    नोट: यह बाध्यकारी वायरस के लिए अनुमति देता है, लेकिन सबसे अधिक कुशलता से 37 डिग्री सेल्सियस पर होता है जो प्रविष्टि का निवारण होता है, क्योंकि यह 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोग बाहर ले जाने के लिए महत्वपूर्ण है। तापमान 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा है कि यह सुनिश्चित करने के लिए बर्फ पर वायरस और परीक्षण यौगिकों के अलावा और एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में आगामी ऊष्मायन प्रदर्शन करते हैं।
  4. तैरनेवाला निकालें और धीरे दो बार ठंडा पीबीएस के 200 μl के साथ सेल monolayer धो लें।
    नोट: कोशिकाओं उठाने से बचने के लिए धीरे washes के प्रदर्शन करना <।/ Li>
  5. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए बेसल माध्यम के 100 μl लागू करें और 72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  6. 2 'के रूप में वर्णित luciferase गतिविधि के लिए सतह पर तैरनेवाला परख करने की क्रिया द्वारा परिणामस्वरूप संक्रमण का विश्लेषण करें। वायरल संक्रमण के पढ़ा गया '।

5. वायरल एंट्री / फ्यूजन परख

नोट: ऊष्मायन अवधि और विभिन्न वायरस के लिए वायरल खुराक का उदाहरण चित्रा 2A 'प्रवेश / फ्यूजन' में सूचीबद्ध हैं। वायरस के उच्च सांद्रता भी MOI / PFU बढ़ाने के द्वारा परीक्षण किया जा सकता है।

  1. बीज हं-7.5 एक 96 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं (अच्छी तरह से प्रति 1 × 10 4 कोशिकाओं) और एक monolayer प्राप्त करने के लिए एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं।
  2. 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों में सेल monolayers पूर्व ठंड।
  3. 3 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एचसीवी के साथ कोशिकाओं (MOI 0.01 =) को संक्रमित। उदाहरण के लिए, 1 एक्स 10 2 FFU युक्त 100 μl वायरस inoculum का उपयोग करें।
    नोट: addi प्रदर्शन करनाबर्फ पर वायरल inoculum और एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में आगामी ऊष्मायन के लिए tion वायरल बाध्यकारी नहीं है लेकिन प्रवेश परमिट जो 4 डिग्री सेल्सियस, पर तापमान बनाए रखने के लिए।
  4. तैरनेवाला निकालें और धीरे दो बार ठंडा पीबीएस के 200 μl के साथ सेल monolayers धो लें।
    नोट: कोशिकाओं उठाने से बचने के लिए धीरे washes के प्रदर्शन करना।
  5. (अंतिम सांद्रता हैं:; PUG = 50 माइक्रोन; हेपरिन = 1000 माइक्रोग्राम / एमएल, CHLA = 50 माइक्रोन DMSO = 1%) परीक्षण यौगिकों या नियंत्रण के साथ कुओं को समझो और 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। उदाहरण के लिए, मीडिया के 90 μl के लिए एक 500 माइक्रोन CHLA काम कर कमजोर पड़ने के 10 μl जोड़ने के मिश्रण, और कुओं का इलाज; इस 50 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता में CHLA उपचार अर्जित करता है।
    नोट: 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस से पारी अब वायरल प्रविष्टि / संलयन घटना की सुविधा है और इसलिए इस विशेष कदम पर परीक्षण यौगिकों 'प्रभाव के आकलन के लिए अनुमति देता है।
  6. दवा युक्त सतह पर तैरनेवाला Aspirate और गैर-भाँति हटानेसाइट्रेट बफर (50 मिमी सोडियम साइट्रेट, 4 मिमी पोटेशियम क्लोराइड, पीएच 3.0) या पीबीएस के 200 μl के साथ या तो धोने से कोशिकी वायरस। 72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubating से पहले बेसल माध्यम के 100 μl लागू करें।
  7. 2 'के रूप में वर्णित luciferase गतिविधि के लिए सतह पर तैरनेवाला परख करने की क्रिया द्वारा परिणामस्वरूप संक्रमण का विश्लेषण करें। वायरल संक्रमण के पढ़ा गया '।

Representative Results

चित्रा 1 में, 'वायरल निष्क्रियता परख' दो विशिष्ट प्राकृतिक यौगिकों CHLA और पग सेल मुक्त राज्य में विभिन्न छा वायरस को निष्क्रिय और बाद के संक्रमण को रोकने सकता है कि क्या जांच करने के लिए किया गया था। इन यौगिकों के cytotoxicity और एंटीवायरल खुराक प्रतिक्रिया यंत्रवत अध्ययन 31 प्रदर्शन करने के लिए पूर्व निर्धारित किया गया है। वायरस परीक्षण यौगिकों के साथ पहले से इलाज किया गया और उसके बाद वायरस-दवा के मिश्रण प्रत्येक वायरस सिस्टम के लिए संबंधित सेल monolayer पर टीका से पहले उप-चिकित्सीय सांद्रता को पतला कर रहे थे। चित्र 1 में दिखाया गया है, CHLA और पग दोनों बाद के संक्रमण से सेल monolayer संरक्षित कि अपरिवर्तनीय प्रभाव में जिसके परिणामस्वरूप, सेल मुक्त virions के साथ बातचीत करने के लिए दिखाई दिया। 80% ब्लॉक एमवी और आरएसवी के खिलाफ मनाया गया - एक 60 जबकि दो परीक्षण यौगिकों, एचसीएम्वी, एचसीवी, और DENV-2 के खिलाफ एक के पास 100% निषेध हासिल की। इन परिणामों के suggस्था CHLA और पग उन्हें निष्क्रिय और उनके संक्रामकता को निष्क्रिय करने से इन मुक्त वायरस कणों पर सीधा प्रभाव पड़ता है कि।

चित्रा 2 में, लगाव और प्रवेश / संलयन assays के एचसीएम्वी, एचसीवी, DENV -2, एमवी, और आरएसवी से इन जल्दी वायरल प्रवेश से संबंधित घटनाओं के खिलाफ CHLA और पग के प्रभाव का पता लगाने के लिए किए गए। CHLA और पग दोनों को प्रभावी ढंग से परिणामस्वरूप वायरल संक्रमण (: हल्के भूरे रंग सलाखों चित्रा 2, 'लगाव') पर अवरोध के रूप में दिखाया संबंधित मेजबान सेल पर जांच वायरस के बंधन को रोका। दोनों जोड़ियों के द्वारा वायरस लगाव पर निरोधात्मक प्रभाव एचसीएम्वी (चित्रा 2 बी), एचसीवी (चित्रा -2) के खिलाफ इसी तरह की थी, DENV -2 (चित्रा 2 डी), और 90 से लेकर आरएसवी (चित्रा 2 एफ), - 100%। दूसरी ओर, पग TW से निषेध दर के साथ, एमवी बाध्यकारी (चित्रा 2 ई) के खिलाफ CHLA की तुलना में अधिक प्रभावी हो दर्शन80% - 50 के बीच अलग ओ यौगिकों। कई वायरस के प्रवेश, एचसीएम्वी की भी हिचकते लगाव, DENV -2, आरएसवी, विज्ञापन एमवी ब्लॉक करने के लिए जाना जाता है, लेकिन एचसीवी के खिलाफ कम कुशल था जाता है, जो नियंत्रण उपचार हेपरिन,। आगामी 'वायरल प्रविष्टि / संलयन परख' CHLA और पग वायरस प्रवेश / संलयन चरण के दौरान उनकी गतिविधियों को बनाए रखा है कि क्या जांच (चित्रा 2, 'प्रवेश / फ्यूजन': गहरे भूरे रंग की सलाखों)। संबंधित सेल monolayer पर 90% सुरक्षात्मक प्रभाव - एक 50 उपज - फिर, CHLA और पग दोनों को प्रभावी ढंग से जांच वायरस (एफ चित्रा 2 बी) के वायरल प्रविष्टि / संलयन कदम ख़राब मनाया गया। हेपरिन भी potently हिचकते प्रवेश / DENV -2 और आरएसवी संक्रमण में संलयन, लेकिन एचसीएम्वी, एचसीवी, और एमवी (<औसतन 40% निषेध) के खिलाफ कम प्रभावशाली था।

<टीडी> हेल
वाइरस सेल के प्रकार
एचसीएम्वी
एचसीवी हं-7.5
DENV -2 वेरो
एमवी चो स्लैम
आरएसवी एचईपी-2

तालिका 1:। वायरल संक्रमण के लिए मेजबान कोशिका प्रकार प्रतिनिधि परिणामों में वर्णित प्रत्येक वायरल संक्रमण प्रणाली के लिए इस्तेमाल सेल प्रकार संकेत दिया है। कोशिकाओं के बारे में अतिरिक्त जानकारी के संदर्भ 31 में पाया जा सकता है।

चित्र 1
चित्रा 1. परीक्षण यौगिकों CHLA और पग से वायरल संक्रमण की निष्क्रियता अलग वायरस एक लंबी अवधि के लिए परीक्षण यौगिकों के साथ इलाज किया गया। (1.5 के लिए incubated - अनुमापन पहले 3 घंटा, प्रकाश धूसर बार) या छोटी अवधि (तुरंत पतला, अंधेरे ग्रे उप-चिकित्सीय concentra करने के लिए एक कमजोर पड़ने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर बार)मोर्चे और संबंधित मेजबान कोशिकाओं पर संक्रमण के बाद के विश्लेषण। अंतिम वायरस एकाग्रता के साथ (बाईं ओर दिखाया गया है) प्रयोग (ए) schematics (pfu / अच्छी तरह से या MOI), लंबी अवधि के वायरस से दवा ऊष्मायन अवधि (i) और (ii) बाद में ऊष्मायन समय सही पर तालिका में प्रत्येक वायरस के लिए संकेत दिया। (बी) एचसीएम्वी, (सी) एचसीवी के लिए विश्लेषण, (डी) DENV -2, (ई) एमवी, और (एफ) आरएसवी प्रत्येक अतिरिक्त पैनल में संकेत कर रहे हैं। परिणाम तीन स्वतंत्र प्रयोगों से मतलब है (SEM) के मानक त्रुटियों ± साधन वायरस के संक्रमण के लिए DMSO के नकारात्मक नियंत्रण उपचार और दिखाया गया डेटा के खिलाफ हैं प्लॉट किए जाते हैं। यह आंकड़ा संदर्भ 31 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. वायरस लगाव और प्रवेश / संलयन के खिलाफ टेस्ट यौगिकों CHLA और पग की एंटीवायरल गतिविधियों का मूल्यांकन। (ए) प्रयोगात्मक प्रक्रिया, वायरस एकाग्रता (pfu / अच्छी तरह से या MOI), और परीक्षण यौगिकों के साथ इसके अलावा और उपचार के समय (मैं, द्वितीय, तृतीय) schematics और जुड़े तालिकाओं में प्रत्येक वायरस के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं। वायरस लगाव विश्लेषण (हल्के भूरे रंग की सलाखों) में, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के monolayers 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व ठंडा थे, तब 4 डिग्री सेल्सियस पर संबंधित वायरस और परीक्षण यौगिकों के साथ सह-इलाज (1.5-3 घंटा, मैं) बाद में ऊष्मायन के लिए inoculates और परीक्षण यौगिकों बंद धोने से पहले (37 डिग्री सेल्सियस; ii) और वायरस के संक्रमण की परीक्षा। वायरस प्रवेश / संलयन विश्लेषण (डार्क ग्रे सलाखों) में, वरीय सेल monolayers 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व ठंडा थे और उसके बाद 1.5 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संबंधित वायरस के साथ चुनौती दी - 3 घंटा (मैं)। कोशिकाओं तो थेधोया और तापमान वायरल प्रविष्टि / संलयन घटना की सुविधा के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए स्थानांतरित कर दिया गया था (द्वितीय) के दौरान जो एक अतिरिक्त ऊष्मायन अवधि के लिए परीक्षण यौगिकों के साथ इलाज किया। ऊष्मायन के अंत में, बाह्य वायरस या तो साइट्रेट बफर (पीएच 3.0) या पीबीएस washes द्वारा हटा दिया गया है और कोशिकाओं को आगे वायरस के संक्रमण के विश्लेषण के लिए (iii) incubated रहे थे। (बी) एचसीएम्वी, (सी) एचसीवी के लिए परिणाम, (डी) DENV -2, (ई) एमवी, और (एफ) आरएसवी प्रत्येक अतिरिक्त पैनल में संकेत कर रहे हैं। डेटा वायरस के संक्रमण का DMSO के नकारात्मक नियंत्रण उपचार के खिलाफ साजिश रची है और तीन स्वतंत्र प्रयोगों से ± SEM के साधन के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। यह आंकड़ा संदर्भ 31 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM GIBCO 11995-040
FBS GIBCO 26140-079
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15070-063
Amphotericin B GIBCO 15290-018
DMSO Sigma D5879
In vitro toxicology assay kit, XTT-based Sigma TOX2
PBS pH 7.4  GIBCO 10010023
Microplate reader Thermo Scientific 89087-320
Microcentrifuge Thermo Scientific 75002420
BioLux Gaussia luciferase assay kit New England Biolabs E3300L   
Luminometer Promega GloMax-20/20
Sodium citrate, dihydrate Sigma 71402
Potassium chloride Sigma P5405

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Munier, C. M., Andersen, C. R., Kelleher, A. D. HIV vaccines: progress to date. Drugs. 71, 387-414 (2011).
  2. Rothman, A. L. Immunity to dengue virus: a tale of original antigenic sin and tropical cytokine storms. Nat Rev Immunol. 11, 532-543 (2011).
  3. Sung, H., Schleiss, M. R. Update on the current status of cytomegalovirus vaccines. Expert Rev Vaccines. 9, 1303-1314 (2010).
  4. Torresi, J., Johnson, D., Wedemeyer, H. Progress in the development of preventive and therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J Hepatol. 54, 1273-1285 (2011).
  5. Wright, M., Piedimonte, G. Respiratory syncytial virus prevention and therapy: past, present, and future. Pediatr Pulmonol. 46, 324-347 (2011).
  6. Christou, L. The global burden of bacterial and viral zoonotic infections. Clin Microbiol Infect. 17, 326-330 (2011).
  7. Cascio, A., Bosilkovski, M., Rodriguez-Morales, A. J., Pappas, G. The socio-ecology of zoonotic infections. Clin Microbiol Infect. 17, 336-342 (2011).
  8. Grais, R. F. Measles vaccination in humanitarian emergencies: a review of recent practice. Confl Health. 5, 21 (2011).
  9. Gautret, P. Emerging viral respiratory tract infections-environmental risk factors and transmission. Lancet Infect Dis. 14, 1113-1122 (2014).
  10. Sampathkumar, P. Middle East respiratory syndrome: what clinicians need to know. Mayo Clin Proc. 89, 1153-1158 (2014).
  11. Burd, E. M. Ebola Virus: a Clear and Present Danger. J Clin Microbiol. 53, 4-8 (2015).
  12. Bishop, B. M. Potential and Emerging Treatment Options for Ebola Virus Disease. Ann Pharmacother. , (2014).
  13. Arduino, P. G., Porter, S. R. Oral and perioral herpes simplex virus type 1 (HSV-1) infection: review of its management. Oral Dis. 12, 254-270 (2006).
  14. Mitrasinovic, P. M. Advances in the structure-based design of the influenza A neuraminidase inhibitors. Curr Drug Targets. 11, 315-326 (2010).
  15. Soriano, V. Directly acting antivirals against hepatitis C virus. J Antimicrob Chemother. 66, 1673-1686 (2011).
  16. Haqqani, A. A., Tilton, J. C. Entry inhibitors and their use in the treatment of HIV-1 infection. Antiviral Res. 98, 158-170 (2013).
  17. Melby, T., Westby, M. Inhibitors of viral entry. Handb Exp Pharmacol. , 177-202 (2009).
  18. Vanderlinden, E., Naesens, L. Emerging antiviral strategies to interfere with influenza virus entry. Med Res Rev. 34, 301-339 (2014).
  19. Antoine, T. E., Park, P. J., Shukla, D. Glycoprotein targeted therapeutics: a new era of anti-herpes simplex virus-1 therapeutics. Rev Med Virol. 23, 194-208 (2013).
  20. Pawlotsky, J. M., Chevaliez, S., McHutchison, J. G. The hepatitis C virus life cycle as a target for new antiviral therapies. Gastroenterology. 132, 1979-1998 (2007).
  21. Beyleveld, G., White, K. M., Ayllon, J., Shaw, M. L. New-generation screening assays for the detection of anti-influenza compounds targeting viral and host functions. Antiviral Res. 100, 120-132 (2013).
  22. Kilianski, A., Baker, S. C. Cell-based antiviral screening against coronaviruses: developing virus-specific and broad-spectrum inhibitors. Antiviral Res. 101, 105-112 (2014).
  23. Caillet-Saguy, C., Lim, S. P., Shi, P. Y., Lescar, J., Bressanelli, S. Polymerases of hepatitis C viruses and flaviviruses: structural and mechanistic insights and drug development. Antiviral Res. 105, 8-16 (2014).
  24. Frey, S. Temperature dependence of cell-cell fusion induced by the envelope glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 69, 1462-1472 (1995).
  25. Tscherne, D. M. Time- and temperature-dependent activation of hepatitis C virus for low-pH-triggered entry. J Virol. 80, 1734-1741 (2006).
  26. Madan, R. P. Molecular umbrellas: a novel class of candidate topical microbicides to prevent human immunodeficiency virus and herpes simplex virus infections. J Virol. 81, 7636-7646 (2007).
  27. Haywood, A. M., Boyer, B. P. Time and temperature dependence of influenza virus membrane fusion at neutral pH. J Gen Virol. 67 (Pt 12), 2813-2817 (1986).
  28. Haywood, A. M., Boyer, B. P. Sendai virus membrane fusion: time course and effect of temperature, pH, calcium, and receptor concentration). Biochemistry. 21, 6041-6046 (1982).
  29. Wang, G., Hernandez, R., Weninger, K., Brown, D. T. Infection of cells by Sindbis virus at low temperature. Virology. 362, 461-467 (2007).
  30. Lin, L. T. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. J Virol. 85, 4386-4398 (2011).
  31. Lin, L. T. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiol. 13, 187 (2013).
  32. Marukian, S. Cell culture-produced hepatitis C virus does not infect peripheral blood mononuclear cells. Hepatology. 48, 1843-1850 (2008).
  33. Baba, M., Snoeck, R., Pauwels, R., de Clercq, E. Sulfated polysaccharides are potent and selective inhibitors of various enveloped viruses, including herpes simplex virus, cytomegalovirus, vesicular stomatitis virus, and human immunodeficiency virus. Antimicrob Agents ChemotheR. 32, 1742-1745 (1988).
  34. Barth, H. Cellular binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparan sulfate. J Biol CheM. 278, 41003-41012 (2003).
  35. Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of Virology. , 3rd edn, ASM Press. (2008).
  36. Brown, M. G. Dramatic caspase-dependent apoptosis in antibody-enhanced dengue virus infection of human mast cells. J Leukoc Biol. 85, 71-80 (2009).
  37. Huang, Y., Cyr, S. L., Burt, D. S., Anderson, R. Murine host responses to respiratory syncytial virus (RSV) following intranasal administration of a Protollin-adjuvanted, epitope-enhanced recombinant G protein vaccine. J Clin Virol. 44, 287-291 (2009).
  38. Isaacson, M. K., Compton, T. Human cytomegalovirus glycoprotein B is required for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment, assembly, or egress. J Virol. 83, 3891-3903 (2009).
  39. Leonard, V. H., et al. Measles virus blind to its epithelial cell receptor remains virulent in rhesus monkeys but cannot cross the airway epithelium and is not shed. J Clin Invest. 118, 2448-2458 (2009).
  40. Ciesek, S. The green tea polyphenol, epigallocatechin-3-gallate, inhibits hepatitis C virus entry. Hepatology. 54, 1947-1955 (2011).
  41. Lin, L. T. Saikosaponin b2 is a naturally occurring terpenoid that efficiently inhibits hepatitis C virus entry. J Hepatol. 62, 541-548 (2015).
  42. Atkins, C., Evans, C. W., White, E. L., Noah, J. W. Screening methods for influenza antiviral drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7, 429-438 (2012).
  43. Zhang, J. Identification of novel virus inhibitors by influenza A virus specific reporter cell based screening. Antiviral Res. 93, 48-54 (2012).

Tags

इम्यूनोलॉजी अंक 104 नशीली दवाओं के विकास एंटीवायरल गतिविधि जल्दी वायरल प्रविष्टि वायरल निष्क्रियता वायरल लगाव / बाध्यकारी वायरल प्रविष्टि / संलयन।
प्रारंभिक वायरल एंट्री पहचान के लिए assays और antiviral यौगिकों का मूल्यांकन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J.,… More

Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J. Vis. Exp. (104), e53124, doi:10.3791/53124 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter