Introduction
それらの作用モードは、多くの場合、従来の生化学的手法により検出し、評価することが困難な低親和性相互作用によって定義されているので、膜タンパク質は、それらの細胞の機能を果たすするメカニズムを理解することは、多くの場合、困難な作業になることができます。膜タンパク質は、さらに、非常に特異的な膜ドメイン5,6に富むまたは原則としてそれらの生物活性を変化させることができる7動的な高次構造を形成することができます。
非侵襲的なレーザ支援単一分子蛍光顕微鏡は、このように複雑な細胞環境におけるタンパク質の挙動を研究するために選択した方法論となっています。これらは、原理的にノイズ低減全反射（TIRF）モードで監視することができ、これは、細胞膜で起こる生化学的プロセスのために特に当てはまります。ここではサンプルの照明がガラスのsuに近接した200nmの薄いスライスまでに制限されていますまた、蛍光シグナル強度8,9の実質的な増加に起因エバネッセント励起光の特性は、細胞のバックグラウンドにおける有意な損失をもたらすとrface。単一分子の検出に高い位置分解能と時間分解能を目指すと、両方の側面が重要です。
平面のSLBは、TIRF顕微鏡でのみ互換性がありません。適切なリガンドで官能とき、彼らはまた、彼らは免疫細胞または他の細胞で発生するように、細胞 - 細胞認識の分子動力学を研究への直接アクセスを提供します。これらは、単に、そのような細胞は、導通試験は、単一分子追跡または単一分子ベースの超解像に関与するときに非常に望ましいTIRF照明で画像化することができるように、スライドガラスに十分に近い運動性、そうでなければ、非接着細胞を配置するために利用することができます。この目的を達成するために、タンパク質は非常にモバイルSLBにロードする必要があります。使用のLiの固有の利点 PIDは、すべてのタンパク質のない非特異的結合がないことです。また、SLBのは、自分自身を癒すために、固有の能力を持つ二次元液体とみなすことができます。ガラス支持体中に凹凸がある程度まで補償されます。ステップバイステップの手順は、目的のタンパク質と高度に荷電した移動体の二重層を発生させるために設けられています。平面のSLBの形成は、主成分（90-99％）、合成および官能化脂質1,2- dioleoyl-として1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（POPC）を含有する、記載されていますSN -glycero-3 - {[N（5-アミノ-1-カルボキシペンチル）イミノ二酢酸]スクシニル}ニッケル塩（DGS NTA-Ni）の少量（1〜10％）です。 POPCは、一飽和脂肪酸と一つのモノ不飽和脂肪酸を運び、さらに室温で高流動性の脂質二重層を形成します。 DGS NTA-Niは、ポリヒスチジン尾部への頭部基と結合すると、選択したポリヒスチジンタグ化タンパク質（ 図1）のアンカーとして機能します。
">重要なことは、顕微鏡のハードウェアが提供された情報と光学系とレーザー物理学のいくつかの基本的な知識が、任意の生物学者は、単一分子イメージングのセットアップを構築することができる必要があります。以下で説明されている周辺機器の番号を含める必要があります。サンプルの励起は、理想的であるべきですこの計画は、偽の光と細胞の自家蛍光9からそうでない場合は、得られた過剰なバックグラウンドを減少させるように全反射（全反射）モードで倒立顕微鏡で行った。このために、特別なTIRF対応の目的（下記参照）とレーザー照射が必要とされています。いくつかの実験は、ミリ秒の範囲内の照明時間を必要と矢継ぎ早に操作します。点灯時間を節約するために、または、2つ以上のスペクトルチャネルに放出された光を分割することがしばしば有用である反復的な照明による不要な漂白を避けるために。これは、同時読み出しを可能にしますconduc重要な要因となることができる2つ以上の発光プロファイルのフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）を含むティン実験。ここで、単一の励起光パルスから生じる発光はFRETドナーから、および（増感発光のような）をFRETアクセプターの両方を記録することができます。カメラは、照射時間の間に、単一の蛍光色素分子を可視化するために十分に低いバックグラウンドで十分な光子をキャプチャする必要があります。コンピュータソフトウェアは、励起シャットと画像取得を同期させるために、最大タスクになる必要があります。総合的な概要は以下および図2に示されています：TIRF対応の目的は、対物系のTIRF照明用対物レンズの開口数（NA）は、に等しいか、または標準的なガラススライドを使用して1.4より大きくなければならない（N = 1.515）9。倍率は150倍に60倍の間の範囲であることができます。目的は、クロマチック異なる蛍光体を撮像する際共焦点を可能にするために修正する必要があります。
レーザー：使用可能なレーザー光をあてるの数Rオプションが大幅に過去数年にわたって増加しています。現代の電子的に変調連続波ダイオードレーザは、コスト効率的であり、前例のない周波数と速度で動作させることができます。より高価なガスイオンレーザーは、レーザービームの品質に優れるが、外部シャット（下記参照）、多くの場合、広範囲（水）冷却を必要とします。
励起シャッター：音響光学変調器（AOM）が急速に連続10で高速シャットを可能にします。タイトな機械式シャッター付きのAOMの組み合わせを遮断することをお勧めします。このように原因連続光暴露にAOMの大規模な加熱が回避され、オフの位置にAOMから漏れる光が相殺されます。
レンズは、レーザビームを広げると、対物レンズの後焦点面にそれらを集中するために使用されます。このように、励起光は、TIRF照明のために必要とされる平行光束（ 図3）のような目的を残しサンプル。目的の周囲に中心から後焦点面内に焦点を移動する機能である試料でのレーザスポット（ 図3）、の位置ビームが目的を離れる角度を変更しませんが、全体的なビーム形状の。 TIRF照明は、対物レンズの焦点面内にレーザの焦点を変換する潜望鏡として機能するミラーのセットを使用して調整することができる臨界角で行なわれます。レンズは、色彩補正されるべきであり、二、三のレンズのセットで使用することができます。三レンズ系は、対物レンズ（ 図4）の後側焦点面に幅広ビームを集束するために、レーザビーム（したがって、試料に照明スポット）と第3レンズを広げるための望遠鏡として機能する2枚のレンズで構成されています。両方の機能（望遠鏡及びフォーカシング）はまた、唯一の二つのレンズの組み合わせによって達成することができる（ 図4参照）。
ミラーは、レーザ光 の損失を回避するために、少なくとも95％の反射率であるべきです。このような配置は、正確にレーザビームの任意の角度と位置を調整するのに十分であるように、各ビーム調整のための二つのミラーの組は、通常適用されます。
二色オーバーレイは反射し、異なる指定された波長の光を透過し、2つのレーザビームを重畳または分割するために使用されます。
Polychroicフィルタは、ダイクロイックフィルタよりも複雑であり、入ってくる励起光を反射し、試料からの出射光を出射する送信するために必要とされます。それらは、対物レンズと顕微鏡管レンズとの間にフィルタキューブ内に配置されています。
フィルターをクリーンアップ ：レーザーemploye d個のレーザーの種類に応じて、それはレーザーを離れた直後に、レーザビームの中に配置する必要があり、狭い伝送帯域幅を有するフィルタをクリーンアップします。
ノッチフィルタ効果的に狭い帯域幅を有するレーザー光を吸収し、他のすべての光を透過するように設計されています。それらは、任意のスプリアスのレーザー励起光をフィルタリングするための放射経路内に配置されています。しかし、ノッチフィルタは、0°の入射角でのみ動作します。ノッチフィルタの帯域幅は非常にシャープである場合は、別の着信角度が任意のより反映されない場合があります。コリメートされたレーザのレーザ光の遮断には影響しませんが、後方散乱光を効率的にカメラに到達するのを妨げていない可能性があります。
レシオメトリックキセノンまたは水銀アークランプの前に置かれたときに適切なフィルタホイールを備えた電動フィルターホイールを容易に励起および発光経路に配置され、異なる光強度（NDフィルタを搭載した場合）、または蛍光チャネル（の間の単純な切り替えを可能にすることができ発光の蛍光体を選択するためにカルシウムイメージングやカメラの前で）。
50:50キューブビームスプリッターC二つの別々の励起ビーム路にレーザービームを分割するために使用され、また、潜望鏡の前にそれらを結合します。
ビームスプリッター（排出路）：物理的なフィルタの変更を必要とせずに高速な画像取得のために、放射ビームをシフト青と赤方偏移チャネルに分割されます。原理的には、ビームスプリッタは、ダイクロイックウェッジまたはミラーのセットと、波長依存性の様式で放出光を分離するダイクロイックミラーを用いることにより構築することができます。 2つの発光フィルタは、放出されたチャネルをクリーンアップするために必要とされます。
空間フィルター：励起ビームの空間フィルタリングは、しばしば低品質のレーザ光 から射出された非平行光線を除去する必要があります。空間フィルタは、両方のレンズの焦点に正確に配置された小さなピンホールを持つ2つのレンズ望遠鏡で構成されています。レーザビームの非平行な部分から得られるこのようスプリアス光を効率的にブロックされた状態になります。蘇TIRFベースの顕微鏡を確立するとき、CHの条件が満たされなければなりません。焦点に位置するのがより困難である小さいピンホールを有する、第1レンズの焦点距離が小さくなると、空間フィルタリングが増加します。レンズ収差による影響を低減するためではなく、単純なレンズを低倍率（10倍または20倍）の高品質と無限遠補正顕微鏡対物レンズを使用することが有利です。
ペリスコープ：潜望鏡セットアップ目的、TIRFイメージングのための前提条件の後焦点面内に集束レーザービームを変換する必要があります。これは、簡単に2つの2インチのミラー、第1のミラーを調整するための並進ステージと顕微鏡（ 図5）に広がり、集束励起ビームを反射するように第2のミラーを位置決めするためのポストから構築することができます。
カメラ：裏面照射型電子増倍電荷結合素子（EMCCD）が日常的に使用されています単一分子信号の記録。これは、高い量子効率の高い収集速度、（95％まで）（最大30 MHz）の比較的低ノイズです。 -80℃に冷却すると、熱雑音を低減し、現在利用可能なEMCCDカメラの数によって支持されています。 EMCCD技術の限界は、カメラノイズはカメラ利得の両方と捕獲される信号に線形的に増加することです。これは、sCMOSチップの特別なアーキテクチャにもはるかに高速EMCCDカメラよりも大幅に安価であり、動作科学CMOS（sCMOS）カメラ、の場合ではありません。しかし、CMOS技術に関連する問題は、各画素が異なる検出感度を備えていますので、画像の取得は、まだ、単一分子レベルでの定量的な読み出しをある程度欠いているということです。主に、これは、画素の正規化を介して補償することができるが、この手順は、11自明されるものではありません。我々はまだ再することを躊躇理由はここにあります単一分子顕微鏡のためsCMOSカメラを称賛するが、この技術の急速な発展の観点から、sCMOSカメラはすぐに好みのカメラになるかもしれません。スロースキャンCCDカメラカメラは、すべて一緒に、増幅に関連するノイズや画素の分散を回避し、これらはいわゆる「運動」モードで動作させることができれば最速取得レートをサポートします。このモードでは、関心領域（ROI）を除いて全体のカメラチップは、記憶装置としてのチップ自体を使用することを可能にするれ、マスクされています。 ROIが最初に露出した後、得られた電荷は、画像がさらに露光から保護される画素ラインによりチップ画素ラインのマスクされた領域にシフトされます。マスクされた領域へのROIのすべての行の移動が（サブミリ秒の範囲内で）完了すると、ROI自体が次の露光のための準備ができています。 CCDチップのすべての画素ラインが充電されるまで、このサイクルが繰り返されます。チップはその後著しくのReduでゆっくり読み出され、CED読み出しノイズ。 1000 x 1300ピクセルのチップ上に、例えば、50×50画素の20のROIは、急速に連続して記録することができます。画像が読み出される前に、かなりの時間のために、チップ上に残るので、高品質のマスキングを確実にするために、過度の熱雑音を低減する手段としてのカメラ（例えば、液体窒素を用いて）を冷却することが重要です。いくつかのEMCCDカメラはまた、運動モードをサポートしています。
ソフトウェア：レーザーのタイミング、シャッターのAOMと、カメラの露出だけでなく、適切な画像の保存は、あらゆる成功したイメージング実験に不可欠です。原則的に、多くの定義された操作は、カメラに付属している利用可能なソフトウェアパッケージを用いてプログラムすることができます。市販のソフトウェアパッケージは少し技術的なノウハウを用いて実施することができるハードウェア・ペリフェラル、多数のをサポートしています。
パルス発生、（アナログおよびデジタル出力チャンネル）データ集録（DAQ）ボードとオシロスコープ：パルス発生器であります定義された時間と電圧のパルスにトリガパルスを変換するための優れた選択肢。このようにレーザーを正確に出力するための制御サブミリ秒の範囲のミリ秒でタイムアウトすることができます。アナログ出力とDAQボードは、同じことを達成するため、容易にPCIスロットを介してコンピュータのマザーボードに組み込まれています。パルス継続時間、振幅と周波数をオシロスコープで確認されています。
全体の励起光路のエンクロージャ：空気による対流に全体の励起光路を励起プロファイルの変動を回避するためには、ラボ環境から囲む必要があります。 TIRF顕微鏡を行う際に、この措置は、特に重要です。光学部品は、また、ほこりやレーザー露光から人間の目から保護されます。エンクロージャは、簡単に芸術の供給の店で購入することができます黒のカードボード、からビルドすることができます。
Photobleac後SLB蛍光回復の流動性を測定するために、興（FRAP）測定12が行われます 。 FRAPのために2つの励起ビーム経路が存在する（図3参照）ことが望ましいです。第1のビーム経路は、画像に二層の蛍光を設計されています。これはTIRF構成で、低光強度で行うことができます。それは光軸に沿って目標を残すように、第2のビーム経路は、短いが強烈な漂白剤パルスを可能にすべきであると非TIRFモードで設定する必要があります。円形開口部は、定義されたエッジを完全に丸い漂白プロファイルを投影する（ 図8参照 ）、励起ビーム経路内に配置することができます。物体面上にこの開口イメージするために、その最適な位置（図3参照 ）は、レンズ3の焦点面にあるであろう。開口が少しずれた位置に配置されたときただし、このレンズの長焦点に、十分な品質のアパーチャ像も生成することができます。
Tを行った後彼は生データを適切に分析しなければならない実験を画像化します。いくつかのステップバイステップのプロトコルは、取得したデータを分析し、メイン設定（照射パワーと時間、全反射角）の調整をカバーする、提供されています。
Protocol
1.生成と平面のSLBの機能化
- 脂質の混合
- 10％DGS NTA-Ni系/ 90％POPC脂質組成に到達するには、250ミリリットルの丸底フラスコに、クロロホルム中のPOPCおよび6.9 mgのDGS NTA-Niを45 mgを溶解します。次のステップでそれを蒸発させ、クロロホルム低い（ちょうどいくつかのミリリットル）のボリュームを維持します。 1％DGS NTA-Ni系/ 99％POPC脂質組成は49.5ミリグラムPOPCおよび0.69 mgのDGS NTA-Ni系を使用してください。
- ゆっくりロータリーエバポレーターを用いてクロロホルムを削除 - 周囲温度を超える上昇は必要ありません。代替的に、窒素またはアルゴンなどの不活性ガス気流中で化学フード内側に吹き飛ばします。これをやっている間、常に丸底フラスコの下半分に乾燥脂質の同等の堆積を可能にするために、フラスコを回します。
- クロロホルムの大部分が蒸発されると、定量的にクロロホルムを除去するために、O / Nを真空フラスコを接続します。
注：この手順は、汚染を避けるために重要です後の段階では毒性クロロホルムでタンパク質や細胞の脂質二重層の流動性を確保します。
- 乾燥した脂質の単層小胞（SUVの）の生成
注：小型単層小胞（SUVの）直径は20nmと100nmの間であり、容易に浴超音波処理することにより製造することができます。脂質押出し、別の方法では、押出成形のために適用されるフィルターの細孔サイズに応じて、SUV車を生じさせることができ、また、大単層小胞（LUVを）、サイズが100ナノメートル〜1000ナノメートルです。しかし、SUVがのSLBを形成するのに最適です。- バス超音波処理を通じてのSUV（ビデオに示されています）：
- PBS Degass。 10 mlの250 mlの乾燥した脂質混合物を懸濁さ丸底フラスコに、PBSを脱気しました。
- 、窒素やアルゴンなどの不活性ガスでフラスコを記入ストッパーで、それを閉じ、オートクレーブテープでフラスコを密封します。
- バス超音波処理器に密封されたフラスコを置き、脂質懸濁液aを超音波処理トン120 170 Wにそれが透明になるまで。これは、30〜60分かかります。
- 小胞形成の分光測光法の進行状況を監視します。PBSと比較して、未希釈エマルジョンの吸収が（脂質濃度のおおよその指標として）234 nmで一定のまま、まだ原因を経由して減少し、光散乱（550nmで著しく低下する必要があることを結果として起きますより大きな粒子）。
- 連続したSLBの形成を妨げる重い非単層小胞を、ペレットに、25℃で1時間150,000×gで遠心分離によって小胞懸濁液をペレット化した後、288,000×gで、4℃で8時間。
- 孔径0.2μmのシリンジフィルターを通して上清をフィルタリングします。
- 小胞の準備の明快さと脂質の残量を監視するために、234 nmおよび550 nmでODを測定します。
- アルゴンまたは窒素下で4℃で小胞を保管してください。必要に応じて、二層の製造のための小胞懸濁液を使用数ヶ月のために。
- 脂質押し出しを通じてのSUV：
- 簡潔には、孔径0.1μmのフィルターを介して脂質懸濁液を数回通過します。かかわらず、製造方法、遠心ベシクル懸濁液の二倍（1H、15万グラム、25℃、その後8時間、4℃、288000グラム）重く、非単層小胞をペレット化します。
注：不活性ガス下で4℃で保存したとき、小胞は、数ヶ月のための二層の調製のために使用することができます。
- 簡潔には、孔径0.1μmのフィルターを介して脂質懸濁液を数回通過します。かかわらず、製造方法、遠心ベシクル懸濁液の二倍（1H、15万グラム、25℃、その後8時間、4℃、288000グラム）重く、非単層小胞をペレット化します。
- バス超音波処理を通じてのSUV（ビデオに示されています）：
- SLBの形成とタンパク質と充電
- 濃硫酸と30分間、30％過酸化水素水の3：1混合物で24×50mmの＃1.5ガラススライドを処理します。
注：これにより、混合物の積極的な性質のために特別な注意を払うビデオに示すように、すなわち白衣や安全ゴーグルを着用！ - 噴出ボトルのうちのddH 2 Oの流れの下でガラススライドを洗浄します。テフロンスタンドにそれらを配置し、それらを乾燥させ10〜30分間。
- 、8または16ウェルチャンバーの底のガラススライドを削除するエポキシ接着剤で底を記入し、慎重に接着剤で覆われたチャンバーの底部に清潔で乾燥したスライドガラスを配置します。接着剤は、約10分間硬化してみましょう。下から余分な接着剤を除去します。
注：スライドガラスとチャンバとの間の気密シールはまた、容易に10〜30分以内に硬化する歯科用二成分シリコーンモデリングペーストを使用して達成することができます。このシールはエポキシ接着剤のようにしっかりとではなく、定期的な歪みに耐えます。実験後には容易に将来の実験において、次に再利用可能である、チャンバから除去することができます。 - 8（16）の各ウェルに10倍のPBSで希釈された脂質懸濁液のピペット120μL（60μL） - 20分とさせて二層形式（上記のように調製した）ウェルチャンバー。慎重に15ミリリットルPBSで2回二重層をすすぎます。二重層が形成されると、それは常にバッファ内に沈めなければならず、空気にさらされることはありません。 330μl（8ウェルチャンバー）または165μl（16ウェルチャンバー）を脱いで、その後、PBSで各ウェルのすべての方法を入力します。ウェル内に残って（175μl）350μlのがあります。各ウェル（400または200μlの最終）にPBSで希釈したHisタグ化タンパク質を含むカクテル50μlの（25μlの）を追加し、暗所で60分間室温でインキュベートします。表面タンパク質の濃度は、このインキュベーション工程の間にタンパク質濃度を変えることによって調整することができます。
- 15ミリリットルPBSで2回各ウェルを洗浄します。
注：一般的には、SLBのは、彼らがタンパク質で充電した後、もはや6時間以上の実験で使用されるべきではありません。この期間中、光退色後の蛍光体回収率は95％まで残り、二重層関連タンパク質には損失を検出することはできません。タンパク質濃度は、（下記参照）は、実験に先立って決定されるべきです。 - オプションのステップ：SLBを含むタンパク質DGS NTA-Ni系の非特異的結合について試験するために、PBSを300mMのイミダゾールを含有する一回SLBを洗います。プロテインは完全にオフに来る必要があります。
- 濃硫酸と30分間、30％過酸化水素水の3：1混合物で24×50mmの＃1.5ガラススライドを処理します。
2.顕微鏡のセットアップ
- 単一蛍光色素の蛍光を検出することができる顕微鏡システムを構築するための導入に記載された勧告を参照してください。
3.パワー測定
注意：フルオロフォアは、容易に過剰な励起光を飽和させることができます。これは、発光の無い、さらにゲインで退色加速ので、避けるべきです。試料照明を最適化するために、励起パワー密度は、試料において直接測定されるべきです。このような測定は、将来の実験のための基準として機能することができます。光は撮像システムで失われる場合に評価する際にさらに、入力および出力のレーザパワーとの比を知ることは有用です。
- それは90°角度で目標を残すように直立位置に励起ビームを移動します。
- トップOに電力計のヘッドを配置ビームfおよびビーム（= P）の電力を測定します。その結果を文書化します。
- 潜望鏡を使用して、全反射位置とイメージそのまま均質な蛍光二重層にビームを向けます。漂白およびCCD信号飽和の場所を回避するために、中性密度（ND）励起光路内に2〜3の光学密度（OD）を用いて濾過します。
- 全体の照明視野（=私は合計 ）の統合されたカウント数を測定します。また、照明領域（= 合計 ）の大きさを測定します。最大限に照らさ中心スポットだけでなく、スポット（= 中央 ）のサイズの積算計数値（= I・センター）を測定します 。
- ピクセルあたりの背景信号を測定する（= B）のいずれか照射領域外またはサンプル照明なし。
- 3での測定結果）からのバックグラウンド信号を減算します。背景に質問（全体照明領域または中央スポット）内の領域の画素数を乗じてこれを行いますピクセル当たりのカウント。 （=私は合計 - 総 .Bと私の中心 - 中心 .B）を。
- 割り統合されており、背景には、照明のフィールド全体の統合とバックグラウンド補正された信号によって中央スポットの信号を修正しました。
注：結果は、中心スポット（=（I センター - センター .B）/（私は合計 - 総 .B））内に位置する総電力の割合を示しています。 2で測定された電力Pと、この結果の乗算）光照射の中心スポットのパワーの結果。 - スポットμm² の中央のサイズを決定します。これは、対物レンズの倍率によってμm単位でカメラの画素サイズを分割するために、ピクセルあたりμm²として結果の二乗を取ります。
- あるいは、顕微鏡上に配置されたマイクロメータスライドを使用して、画像内のピクセルサイズを測定し、画素あたりの面積と結果の二乗を取ります。 MULTiplyセンタースポット内に位置する画素数で、この値は、照射スポットのエリアに到達します。
- センタースポットセンターの大きさで、中心スポットを照射する電力Pを分割し、μmの2あたり照明強度を計算するμm²。一例が図6に示されています。
- 非TIRF照明で測定された電力密度の値は、典型的には、レーザ光 が全反射される正確な角度に依存するTIRF照明13内に存在するものよりも低いです。 TIRF照明下で現在の電力密度に到達するには、画像非TIRFとTIRFの両方では0.1μm径の蛍光ビーズをキャリブレーション。 TIRF非TIRFモードで測定されたビーズの蛍光強度の比は、TIRF照明（式1）の下で効果的なものに測定された電力密度値の変換を可能にする変換係数Cに達します。
電力密度 TIRF = C•電力密度非TIRF（式1）
Cと=ビーズ強度T IRF /ビーズ強度非TIRF
4.密度測定
- 二層に位置して、個々の蛍光体の平均信号を決定します。蛍光性ペプチドを負荷した二層付MHC分子は、タンパク質ので、この目的のために理想的である：ラベルの化学量論は、1つのです。視野内の二層に必要な漂白剤は、すべてのラベルの場合、蛍光は、単一の蛍光色素分子を可視化するために回復しましょう。
- 立て続けに記録する画像（例えば、ストリーミング取得プロトコルを適用）と、複数のフレームの上に単一分子の移動を監視します。詳細については、図7を参照してください 。
- これだけROI内の単一分子とバルク蛍光を決定します。単一エミッタの点広がり関数の99％以上を捕捉するのに十分な大きさのROIの信号を統合します。 （メーカーのカメラ仕様に記載された）16-20ミクロンの画素サイズを有するカメラを用いる場合、100倍の倍率に等しいまたは1.45より大きい開口数を有する対物レンズを備えた7画素で7領域を取ります広場の中央に位置する強度ピーク。
- バックグラウンド信号を決定するために、蛍光シグナルが含まれていない隣の7 7ピクセルの正方形の数を統合します。単一分子フッ素ための補正値を決定するために、単一分子のシグナルからバックグラウンドを差し引きますescence。まだ次のフレームに表示されている信号のみを選択します。
5.テスト二層の整合性
- 蛍光二重層を準備し、上記のように顕微鏡のステージ上に置きます。
- フォーカスを調整し、全反射モードでの二重層の画像を取ります。小さな円盤状のROI内の蛍光を除去するために、非TIRFモードで短いが強烈な漂白剤パルスを適用します。
- 蛍光回復の速度を監視するために、すぐに漂白し、その後、5〜10秒後に低強度のTIRFモードで二重層の画像を取ります。
- モー二層の異なる領域にVEの、ステップ2と3は、漂白剤のパルスの後に低強度TIRFモードで5分を別の画像を取るに従ってください。次のように不動の割合（IF）を計算するために（何の漂白が発生していないはずです）、実験の開始時に、I 0を漂白する前に、私は漂白剤領域に漂白剤を投稿強度を決定し、強度にそれを比較します：
不動の分画（％）=（I 0 -私は漂白剤を投稿 ）IF /（I 0 -背景）は、×100
適用されていない励起光のROI内の背景=測定された強度を持ちます
IFは、10％未満（理想的には5％未満）であるべきです。
Representative Results
単一分子蛍光顕微鏡システムのアーキテクチャは 、図2にかなり詳細に概説されている。このような光学部品やその他のハードウェアコンポーネントなどの個々の部品は、導入部で説明されています。 TIRFと非TIRF照明に定義された方法で生じる光学的励起ビーム経路は、示され、5〜図3で説明されています。に位置する第1のペリスコープ鏡の前で50:50のビームスプリッタの位置に注意してください。マイクロメートル翻訳可能な段階（ 図5）。このビームスプリッタは、（緑色で表示）イメージングに使用TIRFビームと（赤で示した）非TIRFビーム（ 図3で説明したように）漂白またはローカル開口定義の光媒介サンプルの活性化のために使用を重畳します。 （オレンジ色で示された図5）合成された光路が反転MICRの背面ポートに二潜望鏡のミラーを介して反射され、oscope。 図4で説明し、 図2に概説したように、2つ、または3つの凸レンズの実装では、レーザビームプロファイルを広げ、TIRFで試料を照射する2平行ビームを生じさせるために対物レンズの後焦点面にレーザ光 を集光しそれぞれ、非TIRFインチ
試料上の電力密度を計算するために必要な測定された強度値の一例は、図6に示されている。平均背景信号（画像化のために使用される）照明され、中央部に測定された強度から減算されるように、内の領域において決定されますレーザー光（ ここでは7089カウント）によって照明されていない視野。点灯（1684カウント）、中央エリア（4830カウント）のバックグラウンド補正後の平均強度が、その後積分強度を生じさせるために対応する領域のサイズを乗算している（1.471照射された領域のための ×10 8カウントと中央エリアの3.424×10 7カウント）。中央と照らされた領域内の積分強度の比は、中央エリア（0.23または23％）を照明する全体の電力の割合をもたらします。映画の中で示されるように、全体的なパワーは、非TIRF照明モードでパワーメータを用いて客観的に決定されなければなりません。この例では、このように中央領域内の5ミリワットのx 0.23 = 1.15ミリワットの電力を生じさせる、5ミリワットに調整されます。 1〜2μm程度の例で41.5ピクセル量は、中央領域が7089ピクセル/41.5ピクセル×μmの2 = 170.8 平方 μmの大きさを有しています。このエリア（170.8 平方 μm）により中央エリア（1.15 MW）を照射する光のパワーを分割すること、平均電力が得られ中央エリア内の0.7キロワット/ cm 2の密度。
図7は 、画像や（すなわち10ミリ秒の時間枠で、毎秒100フレーム）迅速に連続して取得し、単一の蛍光色素分子の対応する強度結果を提供しています。強度の定量化のための蛍光シグナルをカバー7（= 49）画素、7つの矩形領域の平均信号は、決定されます。また、バックグラウンドの平均シグナルは、単一分子信号に近接して7 7ピクセルの矩形領域内で決定されます。バックグラウンド補正された平均値信号（太字で示される）単一分子シグナルを生じる領域内の画素の数（= 49）が乗算されます。
SLBに関連した蛍光標識タンパク質の移動度を評価するために設計された代表的なFRAP実験は図8に示されている。 図8Aに repeti注広がった低強度のイメージングビームと0秒の時点でより狭く、迅速な蛍光色素の切除のための開口部に定義された高強度の光第二の単回使用の的を使用。前漂白剤パルスに初期の平均強度値で規格化された黄色の円内のバックグラウンドを差し引いた平均強度は、蛍光が回復した先の速度と程度を記録するための時間に対して、図8（b）にプロットされています。図に示すように、最初の二層強度の90％以上が（緑の線で示される）蛍光色素アブレーション、次の75秒以内に回復しました。結果として示さSLBに埋め込まれたタンパク質の10％未満は不動です。
SLBシステムの概略1.概要図。 （A）のSLBは、POPC（百分の90から99）と合成脂質DGS NTA-Nで作られていますI（1〜10％）。きれいなガラス表面は、対応する脂質からなるSUV車で充電しているとき、彼らが自発的に形成される。（B）一旦形成されると、これらのSLBは、簡単に可溶性タンパク質で装飾することができますいずれかのCまたはのための12個のヒスチジン（12Hを含むN末端 タグで拡張例共刺激分子B7-1および接着分子ICAM-1）または6個のヒスチジン各（2x6H、例えばαβMHCクラスII二量体）を含む二つのタグで拡張タンパク質二量体。 これの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください図。
励起および発光ビーム経路の図2の概要。ガスイオンレーザー（例えば、アルゴンやKr + +）は、音響光学MOを用いて高速遮断する動作させることができます dulators。レーザーダイオードは、多くの波長で、今日利用可能であり、それらが電子的にマイクロ秒、怒りに変調することができるような優れた代替手段を表します。レーザビームは容易に2つ（ダイクロイック）ミラーと分割して調整し、二つ以上のビーム経路を生じさせるために、単純なビームスプリッタの使用と組み合わせることができます。この例では、TIRFイメージングビーム（イベントを監視するため）および（漂白剤フルオロフォアまたは開口部に定義された方法で、フォトアクティブケージ分子のいずれかに）漂白ビームが使用されています。両方の励起経路は、追加のシャッターを使用することによって互いに独立して動作させることができます。ペリスコープは、サンプルのTIRF照明を生成するために、対物レンズの後焦点面内で集束レーザ光を変換することができます。蛍光画像は、分光超高感度カメラ（例えば、EM-CCDまたは科学CMOSカメラ）を用いて取得する前に放射ビームスプリッタを使用して分割することができます。.COM /ファイル/ ftp_upload / 53158 / 53158fig2large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3の対物の後焦点面内で集束ビームを変換することによってTIRF照明を調整するレーザ光 の焦点位置を示すように、ビームの移動を介して周囲の中心から対物レンズの後焦点面内でずれています（潜望鏡ミラー構成を使用して）。臨界角は、全内部反射が起こるに到達するまで、結果として平行ビームが傾いた照明で対物レンズを残します。エバネッセント場は、全反射が生じるガラス・メディア・インターフェースで生成される。 このFiのの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいグレ。
図4.単純な光学系は、対物レンズの後焦点面にレーザビームを集束させる。3つまたは二つのレンズは、レーザビームを広げるとTIRF対物レンズの後焦点面上に焦点を合わせるために必要とされます。二つのレンズシステムは、三レンズ系よりも少ないレンズに関連するエラーを含むとTIRFイメージングビームを生成するために適している可能性があります。定義されたビームの広がりとシャープなエッジを持つ照明スポットを目指したときに光活性化または-bleachingを採用した研究のために必要とされるであろうように、3つのレンズは、望ましいかもしれない。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図5は、蛍光顕微鏡の背面にあるビーム経路の写真を注釈付き。既に図2に 1杖を概説するように簡単に示されている（非TIRFモード（緑色で示されている）他の2つの励起光、TIRFに1を実装赤）。これらは、50：50ビームスプリッタ（BS）を使用して重ねなります。凸面レンズ（L1及びL2）は、対物レンズの後焦点面にそれらを集中するために、それぞれのビームに配置されている（図示せず）。二つのミラー（M1とM2）からなる潜望鏡は、顕微鏡へのエントリのポートを介して両ビームを案内します。第1のミラー（M1）は、TIRF位置にビームの一方を移動させるための（示されるようにマイクロメータねじを回すことにより）平行移動ステージ（TS）を使用して移動させることができます。 TIRFが確立されると、（ここでは赤で示される光退色または - 活性化のために使用される）第2のビームは、非TIRF対物を残す独立TIRFビームを調整することができモード。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6は、照明スポットの中央領域内の電力を測定する。示されたようなイベントは、後に記録される背景を反映して、関心の適当な領域、全体の照明領域（IA）および中央エリア（CA）を、選択しました。 IAおよびCAの記録されたものからバックグラウンド値を減算し、各領域（=積分強度）内に存在する画素数で補正平均強度を乗じて強度を統合します。 CA（：23％この例では）を照射するビームパワーの割合に到達するために、IAのそれによってCAの積分強度を分割します。 5メートル：ここで全体的なビームパワーを（乗算して、CAを照射する光のパワーを決定します0.23）：CA（ここでは照明割合はW）。 （：1 / 41.5μmの2ピクセル-1ここ）ピクセル・ツー・エリアサイズ変換係数で：中央領域のサイズを決定するために（7089ピクセルここ）面積を掛けます。 CAを照射励起光の平均電力密度に到達するために、電力分割：（ここで：170.8μmの2）は、CAの大きさ（ここでは1.15 MW）を。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
単一分子信号の図7.定量。（A）SLB上の単一のフルオロフォアの時間経過。関心領域（ROI、イエロー）の7×7画素サイズの領域を定量するための信号の周りに配置されています。バックグラウンドは、隣接する7×7画素から決定されます。ROI（緑）。（B）定量化し、平均ピクセル強度が表示されます。単一分子の信号を決定するために、バックグラウンド値（緑ROI）が1の蛍光体の単一分子強度を時間に対してプロットされた信号値（黄色ROI）から減算し、49（C）で乗算されます。フルオロフォアが漂白の過程にあるよう90ミリ秒の時点が省略されていることに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
SLBの完全性を決定するために（FRAP）解析を光退色後蛍光回復8.図。 （A）に示した実験の（A）は、FRAP実験の全ての10番目の画像が表示されているIEK / MCC-アレクサフルオロ647を担持する二重層について実施した。（B）FRAP定量。値は、漂白前の初期強度（I 0）で割った値（A）に示す黄色のROI内の平均強度（I）を示しています。レッドデータポイントは緑色の線は、元の強度の0.9回復を示し、（A）に表示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
単一分子顕微鏡は、それらの天然の細胞環境内のタンパク質の挙動を研究するユニークな機会を提供します。分子イメージングは、広範な科学界に、したがって、ますます魅力的になり、まだ多くの生命科学者はまだ離れて技術とノウハウの初期投資を敬遠。自分のイメージングシステムの組み立てに起因する主な利点は、それが容易に誰の特定のニーズに合わせることができるということです。
本明細書に示唆されるように、非TIRF励起光が容易に既存のTIRF光路に加えて実施することができ、フルオロフォアおよびリガンドの迅速で定義された光退色（または-活性化）が望まれる場合、例えば実行FRAPまたはリガンドアンケージング実験14 。放射ビームスプリッタの導入は、少なくとも二つの、いくつかのケースでは4つの蛍光チャンネルまでの同時録音が可能になります。拡張子のリストは、本質的にのみによって制限されています自分の想像力。
例えば、放射パスに電動式発光フィルタホイールを実装する最大10個の異なる蛍光チャネル間の高速スイッチングが可能になります。直列に（それぞれ10フィルタスロットを装備した）は、2つの電動発光フィルタホイールを組み合わせる場合、最大18の蛍光チャネルを読み出すことができます。 TIRFベースのイメージングは、キセノンまたは水銀ランプ励起経路の統合後のカルシウム動員の測定値と干渉反射顕微鏡（IRM）で補完することができます。 IRMは、ガラス表面またはSLBに結合している細胞及びTIRFベースの撮像データを解釈するとき、従って、重要な情報を提供することができる程度を視覚化するために選択される方法です。シンプルなダイクロイックミラーを使用すると、光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）または確率的光学再構築顕微鏡（STORM）を実施できますnmで405の追加のレーザー、すなわち2 superresolutに広がった励起ビームの確立可視光15,16の回折限界以下の位置精度でイオン方法。
しかし、実験の成功だけでなく、適切なハードウェアの問題です。ノイズ低減TIRFベースのイメージングを最大限に活用するために、細胞は、細胞表面上の制約を課すか、それはその形質膜の生理機能に干渉しないやり方で表面に接触する必要があります。すべてのSLB-埋め込みリガンドは、横方向に、移動され、結合および分離ダイナミクスを受容体に応答して、二重層内での横方向の位置を調整するため、細胞接着のための適切なタンパク質で官能のSLBは、この目的によく適している超えます。
再現可能な方法でのSLBを製造するためには、高純度のSUV車でスタートするのがベストです。本明細書に記載されるように、これらのIのような2つの超遠心分離工程においても、超音波処理の間に生成された多重膜小胞を除去することが重要です高い流動性を特色に連続するのSLBの形成とnterfere。唯一のきれいなガラス表面上に高品質のフォームののSLB。一度洗浄したガラススライドは、直ちに使用または真空に格納する必要があります。これは彼らの混乱につながるとして重要なのは、SLBのは、空気にさらされてはなりません。 SLBの洗浄はこの保存はなく、時間を節約する手順だけではないように、バッファは血清学的ピペットを使用してすすぎ、示されるように、関与します。
SLB常駐タンパク質の回収および精製中に界面活性剤の使用は避けるべきです。ときに微量に存在する界面活性剤があっても有意にタンパク質の移動性が低下するからです。すべて一緒に洗剤の必要性を回避するために、分泌されたポリヒスチジンタグを搭載したリガンドの可溶性発現は、哺乳動物細胞や昆虫細胞で推奨されています。大腸菌封入体からのリフォールディングが必要な場合は、注意が彼らの不およびリフォールディングの前に封入体から効果的に界面活性剤を除去するために適用する必要があります。
具体的には、細胞活性化および細胞接着のために与えられた受容体 - リガンド相互作用の役割を分析することができ、それらのモジュール式reconstitutive自然からのSLB結果を採用する主な利点は、。これに関して、DGS NTA-NiはNTA-NI結合部位について競合するタンパク質を防止するために、SLB内の10％に存在するべきであることを言及することは重要です。わずか1％または2％のDGS NTA-Ni系、与えられたポリヒスチジンタグ融合タンパク質種は未発表（第2ポリヒスチジンタグ付きタンパク質種の量の増加を同時インキュベートする場合は特に、気づいたことができるの関連の減少を保有するSLBを使用する場合観察）。 10％DGS NTA-Ni系を搭載したのSLBで作業する場合、この現象は見られません。
我々はDGS NTA-Niを含むのSLBに試験したいずれのポリヒスチジンタグ融合タンパク質の非特異的結合を観察したことがないものの、初めてのタンパク質を導入する際に、この可能性をテストする必要があり、この目的のために、我々はDGS NTA-Ni系（タンパク質が結合してはならない）を欠いているのSLBの使用をお勧めします。 DGS NTA-Niを含むSLBを使用した場合第二に、タンパク質は、PBSを300 mMイミダゾールを含有するSLBを洗浄した後、完全にオフに来る必要があります。
SLBを採用する別の重要な利点は、一時的な相互作用およびシグナル伝達事象を高める時空間解像度17-19で監視することができるということです。三次元的な結合プロセスは、本質的に2つの撮像寸法に縮小されるので、これはノイズ弱毒TIRFモードで記録する場合は特に、少なくとも部分的にあります。 SLBを使用すると、単一分子信号検出、光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）または確率的光学再構築顕微鏡（STORM）の前提条件と、回折限界15,16以下の解像度を持つ、すなわち超解像顕微鏡と互換性があります。これらの特別なイメージングモダリティは、単一分子フェルスター共鳴エネルギートラを有効にシナプス環境20内の個々のタンパク質-タンパク質相互作用を可視化するために設計さnsfer実験。このアプローチは、21「FRETベースの顕微鏡アッセイを使用して結合TCR-のpMHCの測定」と呼ばれるJoveの出版にかなり詳細に説明されています。
SLBベースの実験を解釈すると1は常に生細胞の形質膜のないすべてのプロパティは、SLBのことで紹介されています心に留めておくべきであり、欠けている資質のいくつかは調査中の生理機能に影響を与える可能性があります。結局、SLB-埋め込 まれたタンパク質は、自由に拡散し、その細胞カウンターパートのほとんどは5,6,22であるため膜マイクロドメインに組織化されていません。ある程度の生細胞の細胞膜構造を節約する接着性細胞に由来する固定化された原形質膜シートは、正常Bリンパ球23によって膜に埋め込 まれた抗原の取り込みを研究するために使用されてきました。しかし、このような膜は、非常に動的な細胞骨格と相互作用し、それらは硬質ガラス面でサポートされているとして何の柔軟性を備えていません。これらの不一致を考慮して調整可能な柔軟性の面で、または局所的に適用される光パルスに応じてその剛性を変更する面でサポートされている定義された方法でタンパク質を区分するための手段を提供し、エンジニアリングのSLBの必要性が明らかに存在します。
Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利害関係を有していないことを宣言します。
Acknowledgments
MAは行財政支援のためのオーストリア科学基金（FWF、J3086-B11）と感謝のシュレーディンガーの交わりマックスプランク協会によってサポートされていました。 GSは、ウィーン科学技術基金（WWTF、LS13-030）によってサポートされていました。 JHは、ウィーン科学技術基金（WWTF、LS14-031）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 glass slides | VWR | 631-0853 | |
| 250ml round bottom flask | VWR | 201-1357 | |
| 50:50 beam splitter cubes | Thorlabs | BS013 | |
| Acousto-opitcal modulator C1205-2 | Isomet | - | only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used |
| Alexa Fluor 488-NHS | Life technologies | A-20000 | |
| Alexa Fluor 555-NHS | Life technologies | A-20009 | |
| Alexa Fluor 647-NHS | Life technologies | A-20006 | |
| autoclave tape | VWR | 489-1312 | or any other heat-stable sticky tabe |
| Avanti Mini-Extruder | Avanti Lipids | 610000 | alternative to the bath sonicator |
| bath sonicator QSONICA Q700 | QSONICA | Q700 | |
| beam splitter | Cairn | P280/210/MLS | |
| Büchi rotary evaporator | VWR | 531-0837 | |
| camera | Andor | iXon Ultra 897 | see manuscript text for alternatives |
| concentarted hydrogenperoxide | Roth | 9683.1 | |
| concentrated sulfuric acid | Roth | X944.2 | |
| epoxy glue | Uhu | 45705 | Uhu plus sofortfest 2min |
| filter wheel | Sutter instruments | Lambda 10-2 | |
| LabTek chambers | VWR | 734-2062 | |
| laser | Toptica | - | different variants (wavelengths 375 - 785 nm) are available |
| lens | Thorlabs, Newport | - | |
| DGS NTA-Ni (lipid) | Avanti Lipids | 790404C | already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended |
| POPC (lipid) | Avanti Lipids | 850457C | already in Choroform-solved delivered version is recommended |
| microscope Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | - | |
| mirrors | Thorlabs | BB1-E02 | |
| optical filters | AHF, Chroma, Semrock | - | filter sets are available for many different combinations of dyes |
| oscilloscope | BK Precision | 2120C | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | degas before usage |
| periscope | Thorlabs | RS99/M | |
| picodent twinsil 22 | Picodent | 13001000 | alternative to the epoxy glue |
| power meter Lasermate-Q | Coherent | - | any powermeter sensitive in the used spectral range will do |
| pulse generator | Stanford Research Systems | SRS DG535 | |
| spatial filter | Thorlabs | KT310/M | |
| syringe filter 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
| TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46 | Zeiss | 440782-9800-000 | |
| trichloromethane/chloroform | Roth | 3313.1 | |
| tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm | Thermo Fisher | 45237 | |
| Sorvall ultracentrifuge | Thermo Fisher | RC M150GX | |
| ultracentrifuge rotor | Thermo Fisher | S120-AT2 | |
| UV spectrophotometer Nanodrop 2000c | Thermo Fisher | - | |
| vacuum pump | VWR | 181-0248 |
References
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