Introduction
Forstå mekanismene som membran proteiner oppfyller deres cellular funksjon kan ofte være en utfordrende oppgave, fordi deres virkningsmekanismer er ofte definert av lave affinitetsinteraksjoner, som er vanskelig å oppdage og evaluere ved vanlige biokjemiske metoder. Membranproteinene kan dessuten være sterkt anriket på spesifikke membrandomener 5,6- eller danner dynamiske høyere ordens strukturer, som i prinsippet kan endre deres biologiske aktivitet 7.
Non-invasiv laser-assistert enkelt molekyl fluorescens mikroskopi har dermed blitt metodikken av valget for å studere protein atferd i komplekse cellulære miljøer. Dette er spesielt sant for biokjemiske prosesser som finner sted på plasmamembranen, ettersom disse kan i prinsippet bli overvåket i støyredusert Total Internal Reflection (TIRF) modus. Her prøven belysning er begrenset til en opp til 200 nm-tynn skive i umiddelbar nærhet til et glass surface, noe som resulterer i et betydelig tap i cellulær bakgrunn og, på grunn av egenskapene til det flyktige eksitasjonslyset, også i en betydelig økning i fluorescens signalintensitet 8,9. Begge deler er viktig når sikter for høyt posisjon og tidsmessig oppløsning i enkelt deteksjon molekyl.
Planar SLBs er ikke bare kompatibel med TIRF mikroskopi. Når funksjonalisert med egnede ligander de gir også direkte tilgang til å studere de molekylære dynamikken i celle-celle-gjenkjennelse som de forekommer i immunceller eller andre celler. De kan også bare benyttes til å posisjonere motile og ellers ikke-adherente celler nær nok til objektglasset, slik at slike celler kan avbildes i TIRF belysning, noe som er meget ønskelig når lednings forsøk med enkelt molekyl sporing eller enkelt molekyl-baserte superresolution. For dette formål proteiner må lastes på en svært mobile SLB. En iboende fordel av brukt li PIDs er at det ikke er uspesifikk binding av proteiner som i det hele tatt. Videre kan SLBs betraktes som to-dimensjonale væsker med en iboende evne til å helbrede seg selv; uregelmessigheter i glasset støtte kompenseres opp til en viss grad. En trinnvis protokollen er gitt for å generere svært mobile bilag belastet med proteiner av interesse. Dannelsen av plane SLBs er beskrevet, som inneholder 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glysero-3-fosfokolin (POPC) som hovedbestanddelen (90-99%), og de syntetiske og funksjonaliserte lipid 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3 - {[N (5-amino-1-karboksypentyl) iminodieddiksyre] succinyl} nikkelsalt (DGS NTA-Ni) i lav mengde (1-10%). POPC bærer en mettet fettsyre og en mono-umettet fettsyre og danner lipidbilag med høy flyteevne selv ved RT. DGS NTA-Ni binder seg med sin hodegruppe til poly-histidin haler og fungerer som anker for poly-histidin-merket proteiner av valg (figur 1).
"> Viktigere, må den mikros maskinvare inkluderer en rekke eksterne enheter som er beskrevet nedenfor. Med informasjonen og noen grunnleggende kunnskap i optikk og laserfysikk, bør enhver biolog kunne bygge et enkelt molekyl bildebehandling oppsett. Sample eksitasjon bør ideelt sett være utføres på et invertert mikroskop i Total Internal Reflection (TIRF) -modus som denne kuren reduseres falsk lys og sterk bakgrunn resulterer på annen måte mot cellulær auto-fluorescens 9. For dette, en spesiell TIRF-stand objektiv (se nedenfor) og laser belysning er nødvendig. Noen eksperimenter vil kreve belysnings ganger i løpet av millisekund rekkevidde og drives i rask rekkefølge. For å spare belysningstiden eller for å unngå unødvendig blekingen på grunn av repeterende belysning er det ofte nyttig å splitte det utsendte lys i to eller flere spektralkanaler. Dette gjør det mulig for samtidig utlesing av to eller flere utslippsprofiler, som kan bli en betydelig faktor når conducelle eksperimenter som involverer Förster Resonance Energy Transfer (FRET). Her utslipp som følge av enkelt eksitasjonslys puls kan tas opp både fra FRET donor og FRET akseptor (som sensitivisert utslipp). Kameraet skal fange nok fotoner med tilstrekkelig lav bakgrunnen for å visualisere enkelt fluorophores under belysning tid. Dataprogram må være opp til oppgaven å synkron eksitasjon stenge og image oppkjøpet. En omfattende oversikt er gitt nedenfor og i figur 2:TIRF-stand mål: For målbasert TIRF belysning numerisk apertur (NA) på objektivet må være lik eller større enn 1,4 ved hjelp av standard glass (n = 1,515) 9. Forstørrelse kan variere mellom 60x til 150x. Målet bør kromatisk korrigert for å tillate confocality når avbildning forskjellige fluorophores.
Lasere: Antallet tilgjengelige laser alternativer har økt betydelig de siste årene. Moderne elektronisk moduler kontinuerlig bølge diode lasere er kostnadseffektive og kan betjenes med enestående frekvens og hastighet. Dyrere gass ion lasere utmerke seg i laserstrålen kvalitet, men krever ekstern stenge (se nedenfor) og ofte omfattende (vann-) kjøling.
Eksitasjon skodder: Acousto-optiske modulatorer (AOM) tillater rask stenge i rask rekkefølge 10. For stramt stenge kombinasjonen av en AOM med mekaniske skodder anbefales. Denne måten omfattende oppvarming av AOM på grunn av eksponering kontinuerlig lys unngås og lys lekker fra AOM i av-stillingen er kansellert ut.
Linser brukes til å utvide laserstråler, og å fokusere dem inn på baksiden fokalplanet til objektivet. På denne måten lar det eksitasjonslys objektivet som en parallellstråle (figur 3), som er nødvendig for belysning av TIRFprøven. Flytting av navet i ryggen fokalplan fra sentrum til periferien av mål vil endre vinkelen på hvilken strålen forlater målet, men ikke plasseringen av laserpunktet på prøven (figur 3), som er en funksjon av den samlede stråle geometri. TIRF belysning oppstår i en kritisk vinkel, som kan justeres ved hjelp av et sett med speil fungerer som et periskop å oversette det sentrale punktet i laseren innenfor fokusplanet på objektivet. Linsene skal være kromatisk korrigert og kan anvendes i et sett av to eller tre linser. En tre-linsesystemet består av to linser som virker som et teleskop for å utvide laserstrålen (og dermed belysningen sted i prøven), og en tredje linse for å fokusere den utvidede strålen inn på baksiden fokalplan for objektiv (figur 4). Begge funksjonene (teleskop og fokus) kan også oppnås ved en kombinasjon av to objektiver bare (se figur 4).
"jove_content"> Speil bør være minst 95% reflekterende for å unngå tap av laserlys. For hver bjelke justering et sett av to speil er vanligvis brukt som sådan anordning er tilstrekkelig til å nøyaktig justere en hvilken som helst vinkel og posisjon av en laserstråle.
Dikroiske overlegg reflekterer og slippe gjennom lys med forskjellige bølgelengder som er spesifisert, og blir brukt til å overlagre eller dele bjelkene av to lasere.
Polychroic filtre er mer kompleks enn dikroiske filtre, og for å reflektere innkommende eksitatorisk lys og overfører lys som kommer ut emisjon fra prøven. De er plassert i filter kuben mellom objektiv og mikroskopet røret linsen.
Rydd opp filtre: Avhengig av hvilken type laser employe d laser rydde opp filtre med en smal overføring båndbredde bør plasseres inn i laserstrålen rett etter at den forlater laser.
Notch filtreer konstruert for effektivt å absorbere laserlyset med en smal båndbredde og overfører alle andre lys. De er plassert i emisjonsbanen for å filtrere ut uønsket laser eksitasjonslys. Men hakk filtre fungerer bare ved 0 ° innkommende vinkel. Hvis båndbredden av kamfilteret er meget skarp, kan de forskjellige innkommende vinkler ikke reflekteres noe mer. Blokkering av kollimert laser laserlys er ikke berørt, men tilbakespredte lyset kanskje ikke effektivt hindret fra å nå kameraet.
Motoriserte filter hjul utstyrt med passende filtre hjul lett kan plasseres i eksitasjon og emisjon sti og tillater enkel veksling mellom ulike lysintensiteter (når utstyrt med ND filter) eller fluoriserende kanaler (når den plasseres foran en xenon eller kvikksølv arc lampe for ratiometrisk kalsium avbildning eller foran kameraet til å velge for emitting fluorophore).
50:50 kube stråledeler cen benyttes for å splitte laserstrålene i to separate eksitasjon stråleveier, og også for å kombinere dem foran periskop.
Strålesplitter (emisjon bane): For rask bildeoverføring uten behov for fysiske filterskift, er utslipp strålen delt inn i en blå-skiftet og rød-skiftet kanal. I prinsippet kan stråledelere bygges ved å benytte en dikroisk kile eller et sett av speil og et dikroisk speil for å skille utslippsstråle i et bølgelengdeavhengig måte. To emisjonsfiltre for å rydde opp i de utsendte kanaler.
Romfilter: Romlig filtrering av magnetisering strålen er noen ganger nødvendig for å fjerne ikke-parallelle lysstråler som sendes ut fra lavkvalitets laserstråler. En romlig filter består av en to-linse teleskop med et lite hull plassert nøyaktig på det sentrale punktet i begge objektivene. På denne måten falsk lys som følge av ikke-parallelle partier av laserstrålen blir effektivt blokkeres. Such betingelser må være oppfylt ved etablering TIRF basert mikroskopi. Romlig filtrering øker med mindre hull, som er vanskeligere å plassere inn i navet, og med mindre brennvidder på den første linse. For å redusere effekter på grunn av objektiv avvik det er fordelaktig å benytte i stedet for enkle objektiver med høy kvalitet og uendelig-korrigert mikroskop mål med lav forstørrelse (10x eller 20x).
Periskop: Et periskop oppsett er nødvendig for å oversette den fokuserte laserstrålen innenfor den tilbake fokalplan for objektiv, en forutsetning for TIRF avbildning. Det kan lett bygges av to to-tommers speil, et translasjonelt scene for å justere den første speil, og en post for posisjonering av andre speil for å reflektere det utvidede og fokusert magnetisering stråle inn i mikroskopet (figur 5).
Kamera: Back-belyst Electron-multiplisere Charge Coupled Devices (EMCCD) blir rutinemessig brukt foropptak av enkelt molekyl signaler. Dette er på grunn av deres høye kvantumutbytte (opptil 95%), høy anskaffelses hastighet (opp til 30 MHz) og forholdsvis lite støy. Avkjøling til -80 ° C reduserer termisk støy, og er støttet av en rekke tilgjengelige EMCCD kameraer. En begrensning av den EMCCD teknologien er at kamerastøy øker lineært med både kamera og forsterkning til signalet som blir tatt. Dette er ikke tilfelle med vitenskapelige CMOS (sCMOS) kameraer, som er betydelig mindre kostbare og drive på grunn av den spesielle arkitekturen av sCMOS brikken også mye raskere enn EMCCD kameraer. Men et problem i forbindelse med CMOS-teknologi er at bildeinnsamling mangler fortsatt en viss grad av en kvantitativ avlesning på et enkelt molekyl nivå, fordi hver pixel har forskjellig følsomhet. I prinsippet kan dette kompenseres gjennom pixel normalisering, men denne fremgangsmåten er på ingen måte trivielle 11. Dette er grunnen til at vi fortsatt nøler med å reberømmer sCMOS kameraer for enkelt molekyl mikroskopi, men i lys av den raske utviklingen av denne teknologien, kan sCMOS kameraer snart bli kameraet av valget. Slow scan CCD-kameraer kameraer unngå forsterkning relatert støy og piksel varians alle sammen og støtte raskest oppkjøps priser hvis de kan brukes i en såkalt "kinetic" -modus. I denne modusen hele kamerabrikke med unntak av en region av interesse (ROI) er maskert, som gjør det mulig å benytte selve brikken som en lagringsenhet. Etter ROI er eksponert for første gang, blir de resulterende avgifter forskjøvet inn i det maskerte område på brikken piksel for piksel linje linje, der bildet er beskyttet fra videre eksponering lys. Når forskyvningen av alle linjer i ROI inn i det maskerte område er fullført (i sub-millisekund-området), er ROI seg klar for neste eksponering. Denne syklusen gjentas inntil samtlige bildeelement linjer av CCD-brikken belastes. Brikken leses deretter langsomt ut med markert reduced avlesning støy. For eksempel på en 1000 x 1300 pixel chip, kan 20 Rois av 50x50 pikslers tas opp i rask rekkefølge. Fordi bildene forblir på brikken for en betydelig tid før den blir lest ut, er det avgjørende for å sikre høy kvalitet på maskering og til å kjøle kamera (for eksempel med flytende nitrogen) som et middel for å redusere overdreven termisk støy. Noen EMCCD kameraer støtter også den kinetiske modus.
Programvare: Timing av lasere, skodder, AOMS og kameraeksponering samt riktig bildelagring er integrert i enhver vellykket bildebehandling eksperiment. I prinsippet mange definerte operasjoner kan programmeres med tilgjengelige programvarepakker som følger med kameraet. Kommersielle programvarepakker støtte et stort antall hardware enheter, som kan gjennomføres med litt teknisk kompetanse.
Pulsgenerator, Data Acquisition (DAQ) brett (med analoge og digitale utgangskanaler) og oscilloskop: En pulsgenerator er enutmerket valg for å konvertere triggerpulser inn pulser av definert tid og spenning. På denne måten lasere kan kontrolleres nøyaktig for utgangseffekt og tidsbestemt i millisekund for å undermillisekund rekkevidde. DAQ boards med analoge utganger oppnå det samme og er lett integreres i hovedkortet på datamaskinen via PCI-spor. Puls varighet, amplitude og frekvens er verifisert med et oscilloskop.
Inngjerding av hele eksitasjon strålebanen: For å unngå svingninger i eksitasjon profilen grunn til luft convections hele eksitasjon strålebanen bør inntas fra sin lab miljø. Dette tiltaket er spesielt viktig når du utfører TIRF mikroskopi. Optiske komponenter er også beskyttet mot støv og det menneskelige øye ved eksponering laserlys. Vedlegg kan være enkelt å bygge fra svart kort styret, som kan kjøpes i kunst forsyne butikkene.
For å bestemme flyten av SLB Fluorescens Recovery Etter PhotobleacHing (FRAP) målinger 12 er utført. For FRAP eksistensen av to eksitasjon stråleveier er tilrådelig (se figur 3). Den første strålebane er utformet for å avbilde fluorescens av bilaget. Dette kan gjøres i TIRF konfigurasjon og med lav lysintensitet. Den andre strålebane bør tillate en kort, men intens puls blekemiddel, og bør være konfigurert i ikke-TIRF modus, slik at den forlater målet langs den optiske aksen. En rund åpning kan plasseres inn i den eksitasjon strålegangen (se figur 8) for å projisere en perfekt runde blekemiddel profil med definerte kanter. For å avbilde denne åpning på objektplan, ville dens optimale stilling være i fokalplanet for linsen 3 (se figur 3). Men på grunn av den lange brennvidde av denne linse, en åpning bilde av tilstrekkelig kvalitet kan også genereres, når åpningen er plassert på litt forskjøvet posisjoner.
Etter å ha utført than bildebehandling eksperiment rådata må analyseres på riktig måte. Flere trinn-for-trinn-protokoller er tilbudt, som dekker justering av hovedinnstillingene (f.eks belysning strøm og tid, TIRF vinkel), anskaffe og analysere dataene.
Protocol
1. generasjon og funksjon av Planar SLBs
- Blandings av lipidene
- For å komme frem til en 10% NTA DGS-Ni / 90% POPC lipidsammensetning oppløse 45 mg POPC og 6,9 mg DGS NTA-Ni i kloroform i en 250 ml rundbunnet kolbe. Holde volumet av kloroform lavt (bare flere ml) for å fordampe den i det neste trinn. For en 1% DGS NTA-Ni / 99% POPC lipidsammensetning bruke 49,5 mg POPC og 0,69 mg DGS NTA-Ni.
- Fjern kloroformen ved anvendelse av en rotasjonsfordamper langsomt - en økning over omgivelsestemperaturen er ikke nødvendig. Alternativt kan blåse det ut inne i en kjemisk hette i en strøm av inert gass slik som nitrogen eller argon. Mens de gjør dette stadig slår kolben for å tillate lik avsetning av tørke lipid på den nedre halvdelen av rundbunnet kolbe.
- Når mesteparten av kloroformen blir avdampet, feste kolben til vakuum-O / N for å fjerne kloroform kvantitativt.
MERK: Dette trinnet er avgjørende for å unngå forurensningav proteiner og celler med giftige kloroform ved senere trinn, og for å sikre lipid bilaget fluiditet.
- Generasjon av små unilamellære vesikler (SUV) fra tørkede lipider
NOTE: Små unilamellære vesikler (SUV) er mellom 20 nm og 100 nm i diameter, og kan lett fremstilles ved ultralydbehandling bad. Lipid ekstrudering, en alternativ metode, kan gi opphav til SUVer og, avhengig av størrelsen på filteret for ekstrudering pore, også store unilamellære vesikler (LUV'er), som er 100 nm til 1000 nm i størrelse. Men SUVer er best egnet for å danne SLBs.- SUV gjennom bad lydbehandling (vist i videoen):
- Degass PBS. Suspendere den tørkede lipidblandingen med 250 ml rundbunnet kolbe i 10 ml avgasset PBS.
- Fylle kolben med inert gass slik som nitrogen eller argon, lukke den med en propp og forsegle kolben med autoklav tape.
- Plasser den forseglede kolbe i et bad sonikator og sonikere lipid suspensjonen ent 120-170 W før den har slått klart. Dette tar mellom 30 og 60 min.
- Overvåke fremdriften av vesikkeldannelse spektro-fotometrisk: passes på at absorpsjon av ufortynnet emulsjon sammenlignet med PBS forblir konstant ved 234 nm (i et omtrentlig indikator for lipid-konsentrasjon), men bør falle betydelig ved 550 nm (på grunn av redusert lysspredning via større partikler).
- Å pelletere tunge ikke-unilamellære vesikler, som interfererer med dannelsen av en sammenhengende SLB, pelletere vesikkelsuspensjon ved sentrifugering ved 150 000 xg i 1 time ved 25 ° C og deretter i 8 timer ved 288 000 xg, 4 ° C.
- Filtrer supernatanten gjennom et sprøytefilter med en porediameter på 0,2 pm.
- Måle OD ved 234 nm og 550 nm for å overvåke klarhet i vesikel-fremstillingen, og mengden av lipid venstre.
- Oppbevar vesiklene ved 4 ° C under argon eller nitrogen. Eventuelt bruke vesikkelsuspensjon for bilaget forberedelsei flere måneder.
- SUV gjennom lipid profiler:
- I korte trekk, passerer lipid suspensjonen flere ganger gjennom et filter med en porestørrelse på 0,1 um. Uavhengig av fremstillingsmetoden, sentrifuger vesikkelsuspensjon to ganger (1H, 150.000G, 25 ° C, deretter 8 timer, 4 ° C, 288000 g) for å pelletere ikke-unilamellære vesikler som er tyngre.
MERK: Når lagret ved 4 ° C under inert gass, kan vesikler brukes til dobbeltlaget forberedelse til flere måneder.
- I korte trekk, passerer lipid suspensjonen flere ganger gjennom et filter med en porestørrelse på 0,1 um. Uavhengig av fremstillingsmetoden, sentrifuger vesikkelsuspensjon to ganger (1H, 150.000G, 25 ° C, deretter 8 timer, 4 ° C, 288000 g) for å pelletere ikke-unilamellære vesikler som er tyngre.
- SUV gjennom bad lydbehandling (vist i videoen):
- Dannelsen av en SLB og lading med protein
- Behandle 24 x 50 mm 1,5 # glassplater med en 3: 1 blanding av konsentrert svovelsyre og 30% hydrogenperoksid i 30 minutter.
MERK: På grunn av den aggressive natur blandingen ta ekstra hensyn, dvs. bære en frakk og vernebriller som vist i videoen! - Skyll glassplater under en strøm av DDH 2 O ut av en skvett flaske. Legg dem på en Teflon stativ og la dem tørkei 10 til 30 min.
- Ta av bunnen glass lysbilde av 8 eller 16 vel kamre, fylle bunnen med epoxy lim og nøye plassere et rent og tørt glass lysbilde på lim-dekket kammer bunnen. La limet herde i ca 10 min. Fjern overflødig lim fra bunnen.
MERK: En tett tetning mellom glass-slide, og kammeret kan også enkelt oppnås ved bruk av et tann to-komponent silikonmodelleringspasta, som herder i løpet av 10 til 30 min. Denne forseglingen er ikke så fast som epoxy lim, men tåler regelmessig fysisk belastning. Etter eksperimentet det lett kan fjernes fra kammeret, som deretter brukes på nytt i fremtidige eksperimenter. - Pipetter 120 ul (60μl) av en 10-ganger fortynnet PBS-lipid suspensjon i hver brønn av en 8 (16) - vel kammer (fremstilt som beskrevet ovenfor), og den to-lagsform for 20 min. Skyll nøye bilaget to ganger med 15 ml PBS. Når bilaget er dannet, må det alltid være nedsenket i buffer og aldri bli utsatt for luft. Fyll hver brønn hele veien med PBS, deretter ta av 330μl (8-brønn kammer) eller 165μl (16-brønn kammer). Det er 350μl (175μl) igjen i brønnen. Legg 50 ul (25 ul) av cocktail inneholdende His-merkede proteiner fortynnet i PBS til hver brønn (400 eller 200 pl endelig) og inkuber ved romtemperatur i 60 min i mørket. Overflateproteinet Tettheten kan justeres ved å variere proteinkonsentrasjonen i løpet av denne inkubasjonen trinnet.
- Skyll hver brønn to ganger med 15 ml PBS.
MERK: Vanligvis bør SLBs bli brukt i forsøk ikke lenger enn 6 timer etter deres lading med protein. I løpet av denne perioden, fluoroforen restitusjon etter fotobleking forblir opp til 95% og noe tap i dobbeltlag-assosiert protein kan detekteres. Proteinet tetthet bør bestemmes før forsøket (se nedenfor). - Valgfritt trinn: For å teste for ikke-spesifikk binding av proteinet til DGS NTA-Ni-innehold SLB SLB vaskes en gang med PBS inneholdende 300 mM imidazol. Den protein bør komme helt av.
- Behandle 24 x 50 mm 1,5 # glassplater med en 3: 1 blanding av konsentrert svovelsyre og 30% hydrogenperoksid i 30 minutter.
2. Microscope Setup
- For å bygge et mikroskopi-system er i stand til å detektere fluorescensen av enkelt fluorokromer referere til de anbefalinger som er angitt i innledningen.
3. Strøm Målinger
MERK: fluoroforene kan lett mettet med overflødig eksitasjonslyset. Dette akselererer fotobleking uten noen ytterligere gevinst i utslipp, og bør derfor unngås. For å optimalisere prøven belysning eksitasjon effekttettheten måles direkte på prøven. Slike målinger kan også tjene som en referanse for fremtidige eksperimenter. Videre vet forholdet mellom input og output laser makt er nyttig når man vurderer hvor lyset er tapt i imaging system.
- Flytt eksitasjon strålen i oppreist stilling, slik at den forlater målet i en 90 ° vinkel.
- Plasser hodet av strømmåleren på toppen of strålen og måle kraften av bjelken (= P). Dokumentere resultatet.
- Bruke periskop, slår strålen inn i TIRF posisjon og image en intakt homogen fluorescerende bilaget. For å unngå bleking og CCD signal metning sted en nøytral tetthet (ND) filter med en optisk tetthet (OD) på 2 til 3 inn eksitasjon lysbanen.
- Mål integrerte tellinger av hele opplyste feltet (= jeg totalt). Også måle størrelsen av det belyste området (A = total). Mål integrerte teller (= I Center) av maksimalt opplyst midtpunktet samt størrelsen på stedet (= Et senter).
- Måle bakgrunnssignalet per piksel (= B) enten utenfor det belyste området eller uten prøve belysning.
- Trekk fra bakgrunnssignalet fra resultatene målt i 3.). Gjør dette ved å multiplisere antall piksler i det aktuelle området (hele opplyst område eller sentrum spot) med bakgrunnentellinger per piksel. (= Jeg totalt - En total .B og jeg sentrere - Et senter .B).
- Fordel den integrerte og bakgrunn korrigert signal fra midtpunktet av den integrerte og bakgrunnskorrigert signal for hele feltet av belysning.
MERK: Resultatet indikerer brøkdel av det totale strøm ligger innenfor midtpunktet (= (I sentrum - Et senter .B) / (jeg totalt - Totalt .B)). Multiplikasjon av dette resultatet med kraften P målt i 2.) resulterer i kraft av lyset belyser midtpunktet. - Bestemme størrelsen på spot Et senter i μm². For dette dele kameraet pikselstørrelse i mikrometer ved forstørrelse av objektiv, ta kvadratet av resultatet som μm² per piksel.
- Alternativt kan måle pikselstørrelsen i bildet ved bruk av et mikrometer glide plassert på mikroskopet og ta kvadratet av resultatet som området per piksel. Multiply denne verdi med antall bildeelementer som befinner seg i midtpunktet for å komme frem til det belyste punktet området.
- Dele makten P belyse midtpunktet av størrelsen på midtpunktet Et senter, μm² å beregne lysintensiteten per mikrometer to. Et eksempel er gitt i figur 6.
- Strømtetthetsverdier målt i ikke-TIRF belysning er vanligvis lavere enn dem som er tilstede i TIRF belysning 13, som også er avhengig av den eksakte vinkel som laserlys fullstendig reflektert. For å komme frem til effekttetthet stede henhold TIRF belysning, image kalibrert fluoriserende perler av 0,1fim diameter både i ikke-TIRF og TIRF. Forholdet mellom kule fluorescensintensiteter målt i TIRF og ikke-TIRF modus utgjør konverteringsfaktoren C, som tillater omdannelse av målte strømtetthetsverdier til de som er effektive i henhold til TIRF belysning (ligning 1).
effekttetthet TIRF = C • effekttetthet ikke-TIRF (ligning 1)
med C = perle intensitet T IRF / perle intensitet ikke-TIRF
4. tetthetsmålinger
- Bestemme den gjennomsnittlige signal av individuelle fluoroforer befinner seg på et bilag. Bilag-MHC-molekyler festet lastet med fluorescerende peptider er ideelle for dette formål, siden proteinet: label støkiometrien er nøyaktig en. Om nødvendig bleike alle etikettene på bilaget i synsfeltet og la fluorescens gjenopprette å visualisere enkelt fluorophores.
- Ta opp bilder i rask rekkefølge (f.eks bruke en streaming oppkjøp protokoll) og overvåke enkle molekyler mobilitet over flere rammer. For mer informasjon se Figur 7.
- Bestem enkelt molekyl og bulk fluorescens bare innenfor denne avkastningen. Integrere signalet fra en ROI, som er stor nok til å fange opp 99% eller mer av en enkelt emitter er punktspredefunksjonen. Når ansette et kamera med en pikselstørrelse 16-20 mikrometer (oppgitt i produsentens kameraspesifikasjoner), en objektiv med 100 ganger forstørrelse og en numerisk aperture lik eller større enn 1,45, ta en region av 7 av 7 piksler med intensitet peak ligger i sentrum av plassen.
- For å bestemme bakgrunnssignalet, integrere tellinger av en nabo 7 av 7 piksel torget, som ikke inneholder en fluorescens signal. Trekk fra bakgrunnen fra enkelt molekyl signalet for å bestemme den korrigerte verdi for enkelt molekyl fluorescence. Velg bare signaler, som fortsatt er synlig i det følgende ramme.
5. Teste Integrity av bilaget
- Forbered en fluoriserende bilags og plassere den på mikroskopet scenen som beskrevet ovenfor.
- Juster fokus og ta et bilde av bilaget i TIRF modus. Påfør en kort, men intens bleike puls i ikke-TIRF modus til ablate fluorescens innenfor et lite disk-formet ROI.
- Ta et bilde av bilaget i lav intensitet TIRF modus umiddelbart etter bleking og deretter hver fem til ti sekunder for å overvåke hastigheten av fluorescens utvinning.
- Move til et annet område på bilaget og følg trinn 2 og 3. Ta et bilde i lav intensitet TIRF modus 5 min etter at blekemiddel puls. Bestem intensiteten jeg legger blekemiddel i blekemiddel området og sammenligne den med intensiteten før bleking jeg 0 i begynnelsen av forsøket (ingen bleking bør ha skjedd) for å beregne immobile fraksjonen (IF) som følger:
Immobile Fraksjon IF (%) = (jeg 0 - jeg legger blekemiddel) / (jeg 0 - bakgrunnen) x 100,
med bakgrunn = målt intensitet innenfor ROI uten eksitasjonslys søkt
IF bør være mindre enn 10% (helst mindre enn 5%).
Representative Results
Arkitekturen av enkelt molekyl fluorescensmikroskopi system er beskrevet i betydelig detalj i figur 2. Individuelle deler som optiske komponenter og andre maskinvarekomponentene er forklart i innledningen. De optiske eksitasjon strålebaner, som gir opphav på en definert måte for å TIRF og ikke-TIRF belysning, er vist og beskrevet i figurene 3 til 5. Legg merke til at plasseringen av 50:50 strålesplitteren foran det første periskop anbrakt på speilet en mikrometer oversett scenen (figur 5). Denne strålesplitteren lagret TIRF trålen som brukes for avbildning (angitt i grønt), og den ikke-TIRF bjelke (angitt i rødt) som brukes for bleking eller lokal åpning definert light-mediert aktivering prøven (som beskrevet i figur 3). De kombinerte lette stier (Figur 5, angitt i oransje) reflekteres via andre periskop speilet inn bak porten på invertert microscope. Som forklart i figur 4 og vist i figur 2, gjennomføringen av to eller tre konvekse linser utvider laserstrålen profilene og fokuserer laserstrålene på den bakre fokalplan for objektiv å gi opphav til to kollimerte stråler belyse prøven i TIRF og henholdsvis i ikke-TIRF.
Et eksempel på målte intensitetsverdier som er nødvendige for beregning av strømtettheten på prøven er vist i figur 6. Den gjennomsnittlige bakgrunnssignalet som skal subtraheres fra intensiteter målt i det opplyste og sentrale området (som brukes for avbildning), blir bestemt i et område innenfor synsfelt, som ikke er opplyst av laserstrålen (her 7089 teller). Bakgrunnskorrigert gjennomsnittsintensitetene for de belyste (1684 tellinger) og det sentrale området (4830 tellinger) blir deretter multiplisert med de tilsvarende regionen størrelser for å gi opphav til integrerte intensiteter (1,471x 10 8 teller det belyste området og 3.424 x 10 7 teller for det sentrale området). Forholdet mellom de integrerte intensitetene innenfor det sentrale og opplyste områder gir den fraksjon av den samlede strømmen belyse det sentrale området (0,23 eller 23%). Som vist i filmen, har det overordnede makt til å være bestemt på målet med bruk av en kraftmåler i ikke-TIRF belysning modus. I vårt eksempel er det justert til 5 mW, og dermed gi opphav til en kraft på 5 mW x 0,23 = 1,15 mW innenfor det sentrale området. Siden 41.5 piksler beløp i vårt eksempel til 1 mikrometer 2, har det sentrale området en størrelse på 7089 piksler /41.5 piksler x mikrometer 2 = 170,8 mikrometer 2. Oppdeling kraften av lyset belyser det sentrale området (1,15 mW) av dette område (170,8 mikrometer 2) gir en gjennomsnittlig strømtetthet på 0,7 kW / cm 2 i det sentrale området.
Figur 7 har bilder og tilsvarende intensitet resultatene av enkelt fluoroforene ervervet i rask rekkefølge (100 bilder per sekund, det vil si med en tidsramme på 10 millisekunder). For intensitet kvantifisering det gjennomsnittlige signal fra et rektangulært område på syv av syv (= 49) piksler, som dekker den fluorescens-signalet, blir bestemt. Videre er det gjennomsnittlige signal av bakgrunnen blir bestemt innen et rektangulært område av syv av syv bildeelementer i nærheten av det enkelt molekyl signal. Bakgrunnen-korrigerte gjennomsnittlige signal multipliseres med antallet av bildeelementer innenfor den region (= 49) for å gi opphav til enkelt molekyl signal (uthevet).
En representativ FRAP eksperiment utformet for å vurdere bevegeligheten av SLB-assosierte fluorescens-merkede proteiner er vist i figur 8. Legg merke til i figur 8A den repetitive bruk av en utvidet lav intensitet avbildning bjelken og enkel bruk av en andre smalere og åpning definert høy intensitet stråle for hurtig fluorokrom ablasjon på null andre tidspunkt. Bakgrunn korrigert gjennomsnitts intensiteter innenfor gul sirkel, som har blitt normalisert av den opprinnelige gjennomsnittlige intensitetsverdien før blekemiddel puls, er plottet i figur 8B mot tiden for å registrere hastigheten og i hvilken grad fluorescens er gjenopprettet. Som vist, har mer enn 90% (angitt med grønn linje) av den opprinnelige bilaget intensitet reverseres innen 75 sek etter fluorokrom ablasjon. Som følge av mindre enn 10% av proteinene innebygd i den viste SLB er immobile.
Figur 1. Skjematisk skisse av en SLB system. (A) SLBs er laget av POPC (90-99%), og det syntetiske lipid DGS NTA-Ni (1-10%). De danner spontant når rene glassflater belastes med SUVer som består av de tilsvarende lipider. (B) Når dannet, disse SLBs kan enkelt dekorert med løselige proteiner utvidet enten med ett C- eller N-terminal tag inneholder tolv histidiner (12H, for Eksempel kostimulerende molekyl B7-1 og adhesjonsmolekylet ICAM-1) eller protein dimerene utvidet med to tags inneholder seks histidiner hver (2x6H, for eksempel en αβMHC klasse II dimer). Klikk her for å se en større versjon av denne figur.
Figur 2. Oversikt over eksitasjon og emisjonsstrålebanene. Gass-ion-lasere (for eksempel Ar + eller + Kr) kan opereres for å stenge hurtig med bruk av akusto optisk mo dulators. Lasere dioder er i dag tilgjengelig i mange bølgelengder og representerer et utmerket alternativ som de kan være elektronisk modulert i mikrosekund-raseri. Vær oppmerksom på at laserstråler kan enkelt justeres med to (dichroic) speil og splitt og kombinert med bruk av enkle stråledelere for å gi opphav til to eller flere bjelkeveier. I dette eksempelet en TIRF avbildning bjelke (for å overvåke hendelser) og et blekemiddel bjelke (til enten bleke fluorophores eller foto aktivere bur molekyler i en blender definerte måte) brukes. Begge eksitasjon baner kan betjenes uavhengig av hverandre ved bruk av ytterligere skodder. Periskop gir mulighet for å oversette de fokuserte laserstråler i ryggen fokalplan for objektiv å generere TIRF belysning av prøven. Den fluoriserende bilde kan spektralt splittes ved anvendelse av en emisjonsstrålesplitter forut for anskaffelse med bruk av en ultra-sensitive kamera (for eksempel EM-CCD eller CMOS kamera vitenskapelig)..com / filer / ftp_upload / 53158 / 53158fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Innstilling TIRF belysning ved å oversette den fokuserte strålen innenfor den tilbake fokalplan for objektiv. Som vist i brennpunktet for laserstrålen er forskjøvet i ryggen fokalplan for objektiv fra sentrum til periferien via translokasjon av bjelken (ved hjelp av et periskop speil ordning). Som et resultat av en parallell stråle forlater mål i en skrå belysning inntil en kritisk vinkel er nådd ved hvilken total indre refleksjon skjer. Det flyktige feltet blir generert i glass-media grensesnitt der total refleksjon oppstår. Klikk her for å se en større versjon av denne fi gure.
Figur 4. Enkle optiske system for å fokusere laserstrålen på baksiden fokalplan for objektiv. Enten tre eller to objektiver er nødvendig for å utvide laserstrålen og for å fokusere den på baksiden fokalplanet TIRF målet. To linsesystemer inneholder færre linserelatert feil enn tre-linsesystemer og kan være bedre egnet for å generere TIRF avbildning strålen. Tre objektiver kan være å foretrekke når sikter til definert stråle utvidelse og en belysning sted med skarpe kanter, som ville være nødvendig for studier ansette foto-aktivering eller -bleaching. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
/53158fig5.jpg "/>
Figur 5. Kommenterte bilde av strålingsbanen på baksiden av fluorescens mikroskop. Som det allerede er skissert i figur 2 en stokk enkelt implementere to eksitasjon bjelker, en i TIRF (angitt i grønt) den andre i ikke-TIRF modus (indikert i rød). Disse blir overlappet med bruk av en 50:50 strålesplitter (BS). Konvekse linser (L1 og L2) er plassert inn i de respektive stråler til å fokusere dem inn på baksiden fokalplanet til målet (ikke vist). Et periskop som består av to speil (M1 og M2) guider både bjelker gjennom porten trer i mikroskopet. Den første speil (M1) kan beveges ved bruk av en oversettelsestrinn (TS) (ved å dreie en mikrometer skrue som vist) for å bevege en av bjelkene i TIRF stilling. Når TIRF har blitt etablert, kan den andre strålen (brukt for foto-bleking eller -activation, her antydet med rødt) reguleres uavhengig av TIRF strålen til å forlate formålet i ikke-TIRFmodus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Måling av kraften i det sentrale området av belysnings sted. Som det er antydet egnede valgte regioner av interesse, noe som reflekterer bakgrunnen hele belyste området (IA) og det sentrale området (CA), hvor arrangementer vil senere bli registrert. Trekk bakgrunnsverdier fra de som er registrert for IA og CA og integrere de intensiteter ved å multiplisere korrigert gjennomsnittlig intensitet med antall piksler stede innenfor hvert område (= integrerte intensiteter). Fordel den integrerte intensiteten av CA ved at av IA for å komme frem til den del av stråleenergien belyse CA (i dette eksemplet: 23%). Bestem kraften i lyset belyser CA ved å multiplisere den totale stråleenergien (her: 5 mW) med andelen belyse CA (her: 0,23). For å bestemme størrelsen av det sentrale området multiplisere området (her: 7089 pixel) med en piksel-for-størrelse på konverteringsfaktoren (her: 1 / 41,5 mikrometer 2 pixel -1). For å komme frem til den gjennomsnittlige effekttetthet eksitasjonslyset belyse CA, dele makt (her: 1,15 mW) etter størrelsen på CA. (Her: 170,8 mikrometer 2) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Kvantifisering av enkelt molekyl signaler. (A) Tid løpet av single fluoroforene på en SLB. En 7 x 7 pixel størrelse region av interesse (ROI, gul) er plassert rundt signal for kvantifisering. Bakgrunn bestemmes fra en nabo 7 x 7 pixelROI (grønn). (B) kvantifiserte gjennomsnittlig pikselintensitet er oppført. For å bestemme enkelt molekyl signal, er bakgrunnsverdier (grønn ROI) trekkes fra signalverdier (gul ROI) og multiplisert med 49. (C) enkelt molekyl intensiteter av én fluorophore er plottet mot tiden. Legg merke til at 90 msek tidspunkt er utelatt som Fluoroforen er i ferd med bleking. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8. Fluorescens utvinning etter fotobleking (FRAP) analyse for å bestemme integriteten til SLB. (A) FRAP ble utført på en to-lags bære IEK / MCC-Alexa Fluor 647. Hver tiende bilde av forsøket er vist. (B) FRAP kvantitering av forsøket er vist i (A). Verdier indikerer gjennomsnittsintensitet (I) innenfor den gule ROI vist i (A) dividert med den opprinnelige intensitet (I o) før bleking. Røde datapunkter vises i (A), betegner 0,9 utvinning av originale intensiteter den grønne linjen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Enkelt molekyl mikros gir en unik mulighet til å studere atferden til proteiner i sitt eget mobilmiljø. Molekylær avbildning blir derfor stadig mer attraktiv for en bred faglig samfunn, men mange livs forskerne fortsatt viker unna den opprinnelige investeringen i teknologi og kompetanse. Den største fordelen som oppstår ved montering av en egen bildedannende system, er at det lett kan justeres til noen spesifikke behov.
Som antydet heri et ikke-TIRF eksitasjon stråle kan lett implementeres i tillegg til en eksisterende TIRF lysbanen, hvis rask og definert foto-bleking (eller -activation) av fluoroforer og ligander er ønskelig, for eksempel når det utføres FRAP eller ligand uncaging eksperimenter 14 . Innføringen av en emisjonsstrålesplitteren gjør det mulig for samtidig opptak av minst to og i enkelte tilfeller opp til fire fluorescerende kanaler. Listen over utvidelser er i hovedsak kun begrenset avens egen fantasi.
For eksempel, implementere en motorisert utslipp filter hjul i utslippsbanen gir mulighet for rask veksling mellom opptil ti ulike fluorescerende kanaler. Når man kombinerer to motoriserte utslipp filter hjul (hver utstyrt med 10 filterslissene) i serien, opp til 18 fluorescerende kanaler kan leses ut. TIRF-baserte bilde kan kompletteres med kalsium mobiliserings målinger og Interference Reflection Mikros (IRM) etter integrering av en Xenon eller Mercury eksitasjon lampe banen. IRM er metoden for valg for å visualisere i hvilken grad cellene er festet til glassoverflaten eller en SLB og kan dermed tilveiebringe kritisk informasjon når man tolker TIRF basert bildedata. Etablering av en utvidet eksitering stråle ved bruk av et dikroisk speil enkel og ytterligere laser på 405 nm gjør det mulig å gjennomføre fotoaktivering lokalisering mikroskopi (PALM) eller stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM), dvs. to superresolution metoder med en posisjonsnøyaktighet under diffraksjonsgrensen av synlig lys 15,16.
Det er imidlertid eksperimentelt suksess ikke bare et spørsmål om passende maskinvare. For å dra full nytte av støyredusert TIRF-baserte bildediagnostikk, bør cellene ta kontakt til en overflate på en måte som ikke setter begrensninger på celleoverflaten eller som forstyrrer fysiologi av sine plasmamembran. SLBs funksjonalisert med egnede proteiner for celleadhesjon har overstiger godt egnet for dette formål, fordi alle SLB-innvevde ligander er sideveis mobile og justere deres sideveis stilling i bilaget i respons til reseptorbinding og segregering dynamikk.
Å produsere SLBs i en reproduserbar måte, er det best å starte med SUV med høy renhet. Som beskrevet heri, er det derfor viktig å fjerne multilamellære vesikler, som også dannes ved ultralydbehandling, i to ultra-sentrifugeringstrinn som i dissenterfere med dannelse av sammenhengende SLBs med høy flyt. SLBs av høy kvalitet skjemaet bare på rene glassflater. Når renset glass bør brukes umiddelbart eller oppbevares i vakuum. Viktigere, SLBs må aldri utsettes for luft, da dette ville føre til deres avbrudd. SLB vasking omfatter, som vist, buffer skylling med bruk av en serologisk pipette, da dette ikke bare er en, men sparer også tidsbesparende fremgangsmåte.
Under høsting og rensing av SLB-resident proteiner ved bruk av vaskemidler bør unngås. Dette er fordi vaskemiddel vil redusere protein mobilitet betraktelig, selv når de er tilstede i spormengder. For å omgå behovet for vaskemiddel sammen, er oppløselig ekspresjon av utskilt polyhistidin tag utstyrt ligander anbefalt i pattedyr eller insektceller. Hvis refoldingen fra E.coli inkludering organer er nødvendig, må forsiktighet brukes til å fjerne vaskemidler effektivt fra inklusjonslegemer før de un- og refoldingen.
En stor fordel med å anvende SLBs resultater fra deres modulære og reconstitutive natur, noe som gjør det mulig å spesifikt dissekere rollen av en gitt reseptor-ligand interaksjonen for celleaktivering og celleadhesjon. I denne forbindelse er det viktig å nevne at DGS NTA-Ni bør være tilstede på 10% innen de SLB for å hindre at proteiner som konkurrerer om NTA-NI bindingssteder. Ved ansettelse SLBs huser kun 1% eller 2% DGS NTA-Ni, en reduksjon i foreningen av en gitt polyhistidin-merket protein arter kan bli lagt merke til, spesielt når co-inkubasjon økende mengder av et sekund polyhistidin-tagget protein arter (upublisert observasjon). Dette fenomenet er ikke observert under arbeid med SLBs med 10% DGS NTA-Ni.
Selv om vi ikke har observert ikke-spesifikk binding av enhver polyhistidin-merket protein testet for å SLBs inneholder DGS NTA-Ni, bør denne muligheten testes ved å innføre et protein som for første gang,For å oppnå dette anbefaler vi bruk av SLBs blottet for DGS NTA-Ni (proteinet bør ikke binde). For det andre, når du bruker en SLB inneholder DGS NTA-Ni, bør protein komme seg helt etter vask SLB med PBS som inneholder 300 mm -imidazol.
En annen viktig fordel med å ansette SLBs er at forbigående samhandling og signal hendelser kan overvåkes med forbedret spatiotemporal oppløsning 17-19. Dette er i det minste delvis fordi en tredimensjonal binding prosessen er i det vesentlige redusert til to avbildnings dimensjoner, særlig ved opptak i støy dempes TIRF modus. Bruken av SLBs er kompatibel med enkelt molekyl signal deteksjon, en forutsetning for foto-aktivert lokalisering mikroskopi (PALM) eller stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM), dvs. superresolution mikroskopi med en oppløsning under diffraksjonsgrensen 15,16. Disse spesielle bildediagnostikk enable enkelt molekyl Förster Resonance Energy Transfer eksperimenter designet for å visualisere individuelle protein-protein interaksjoner i en synaptisk miljø 20. Denne tilnærmingen er forklart i stor detalj i en Jove publikasjon kalt "Measuring TCR-pMHC bindende bruker en FRET basert mikros analysen" 21.
Ved tolkning SLB-baserte eksperimenter man bør alltid huske på at ikke alle egenskapene til en plasma membran av en levende celle er kjennetegnet ved SLBs, og at noen av de manglende kvaliteter kan påvirke fysiologi under etterforskning. Tross alt, er SLB-integrerte proteiner fritt spre og ikke organisert i membranmikroområder som de fleste av sine cellulære kolleger er 5,6,22. Immobilisert plasma-membraner avledet fra adherente celler som bevarer plasmamembranen arkitekturen av levende celler til en viss grad, er med hell anvendt for å studere opptak fra membran innleiret antigener av B-lymfocytter 23. Men selv et sliktmembraner har ikke samvirke med et høyt dynamisk cytoskjelett og har ingen fleksibilitet som de er understøttet av en stiv glassflaten. I lys av disse avvikene er det helt klart et behov for prosjektering SLBs, som tilbyr hjelp til fordeler proteiner i en definert måte, og som støttes av overflater av justerbar fleksibilitet eller flater som endrer deres stivhet i respons til lokalt anvendt lyspulser.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen å konkurrere økonomisk interesse.
Acknowledgments
MA ble støttet av en Schrödinger fellesskap av den østerrikske Science Fund (FWF, J3086-B11) og takker Max-Planck-Society for økonomisk og administrativ støtte. GS ble støttet av Wien Science and Technology Fund (WWTF, LS13-030). JH ble støttet av Wien Science and Technology Fund (WWTF, LS14-031).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 glass slides | VWR | 631-0853 | |
| 250ml round bottom flask | VWR | 201-1357 | |
| 50:50 beam splitter cubes | Thorlabs | BS013 | |
| Acousto-opitcal modulator C1205-2 | Isomet | - | only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used |
| Alexa Fluor 488-NHS | Life technologies | A-20000 | |
| Alexa Fluor 555-NHS | Life technologies | A-20009 | |
| Alexa Fluor 647-NHS | Life technologies | A-20006 | |
| autoclave tape | VWR | 489-1312 | or any other heat-stable sticky tabe |
| Avanti Mini-Extruder | Avanti Lipids | 610000 | alternative to the bath sonicator |
| bath sonicator QSONICA Q700 | QSONICA | Q700 | |
| beam splitter | Cairn | P280/210/MLS | |
| Büchi rotary evaporator | VWR | 531-0837 | |
| camera | Andor | iXon Ultra 897 | see manuscript text for alternatives |
| concentarted hydrogenperoxide | Roth | 9683.1 | |
| concentrated sulfuric acid | Roth | X944.2 | |
| epoxy glue | Uhu | 45705 | Uhu plus sofortfest 2min |
| filter wheel | Sutter instruments | Lambda 10-2 | |
| LabTek chambers | VWR | 734-2062 | |
| laser | Toptica | - | different variants (wavelengths 375 - 785 nm) are available |
| lens | Thorlabs, Newport | - | |
| DGS NTA-Ni (lipid) | Avanti Lipids | 790404C | already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended |
| POPC (lipid) | Avanti Lipids | 850457C | already in Choroform-solved delivered version is recommended |
| microscope Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | - | |
| mirrors | Thorlabs | BB1-E02 | |
| optical filters | AHF, Chroma, Semrock | - | filter sets are available for many different combinations of dyes |
| oscilloscope | BK Precision | 2120C | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | degas before usage |
| periscope | Thorlabs | RS99/M | |
| picodent twinsil 22 | Picodent | 13001000 | alternative to the epoxy glue |
| power meter Lasermate-Q | Coherent | - | any powermeter sensitive in the used spectral range will do |
| pulse generator | Stanford Research Systems | SRS DG535 | |
| spatial filter | Thorlabs | KT310/M | |
| syringe filter 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
| TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46 | Zeiss | 440782-9800-000 | |
| trichloromethane/chloroform | Roth | 3313.1 | |
| tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm | Thermo Fisher | 45237 | |
| Sorvall ultracentrifuge | Thermo Fisher | RC M150GX | |
| ultracentrifuge rotor | Thermo Fisher | S120-AT2 | |
| UV spectrophotometer Nanodrop 2000c | Thermo Fisher | - | |
| vacuum pump | VWR | 181-0248 |
References
- Walter, N. G., Huang, C. Y., Manzo, A. J., Sobhy, M. A. Do-it-yourself guide: how to use the modern single-molecule toolkit. Nat Methods. 5, 475-489 (2008).
- Sahl, S. J., Moerner, W. E. Super-resolution fluorescence imaging with single molecules. Current opinion in structural biology. 23, 778-787 (2013).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster. Immunity. 25, 117-127 (2006).
- Kaizuka, Y., Douglass, A. D., Varma, R., Dustin, M. L., Vale, R. D. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci U.S.A.. 104, 20296-20301 (2007).
- Wilson, B. S., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Gaudet, E. A., Oliver, J. M. High resolution mapping of mast cell membranes reveals primary and secondary domains of Fc(epsilon)RI and LAT. The Journal of cell biology. 154, 645-658 (2001).
- Lillemeier, B. F. TCR and Lat are expressed on separate protein islands on T cell membranes and concatenate during activation. Nat Immunol. 11, 90-96 (2010).
- Woof, J. M., Burton, D. R. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nature reviews. Immunology. 4, 89-99 (2004).
- Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of cell biology. 89, 141-145 (1981).
- Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in cell biology. 89, 169-221 (2008).
- Wieser, S., Moertelmaier, M., Fuertbauer, E., Stockinger, H., Schutz, G. J. (Un)confined diffusion of CD59 in the plasma membrane determined by high-resolution single molecule microscopy. Biophys J. 92, 3719-3728 (2007).
- Huang, F. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
- Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys J. 16, 1055-1069 (1976).
- Axelrod, D., Burghardt, T. P., Thompson, N. L.
- Huse, M., Quann, E. J., Shouts Davis, M. M. Whispers and the kiss of death: directional secretion in T cells. Nat Immunol. 9, 1105-1111 (2008).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Bunnell, S. C. T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies. J Cell Biol. 158, 1263-1275 (2002).
- Sherman, E. Functional nanoscale organization of signaling molecules downstream of the T cell antigen receptor. Immunity. 35, 705-720 (2011).
- Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463, 963-967 (2010).
- Axmann, M., Schuetz, G. J., Huppa, J. B. Measuring TCR-pMHC binding using a FRET-based microscopy assay. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Lillemeier, B. F., Schuetz, G. J., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Wilson, B. S., Davis, M. M. Plasma membrane-associated proteins are clustered into islands attached to the cytoskeleton. Proc Natl Acad Sci U.S.A.. 103, 18992-18997 (2006).
- Natkanski, E., et al. B cells use mechanical energy to discriminate antigen affinities. Science. 340, 1587-1590 (2013).
