Introduction
Понимание механизмов, с помощью которых мембранные белки выполнению их функции клетки часто может быть сложной задачей, потому что их способы действия часто определяется низким сродством взаимодействия, которые трудно обнаружить и оценить с помощью традиционных биохимических методик. Мембранные белки, кроме того, может быть сильно обогащены специфическими мембранными доменами или 5,6 образующих динамические высокие структуры порядка, которые, в принципе, изменяют свою биологическую активность 7.
Неинвазивная помощью лазера флуоресценция одна молекула микроскопии, таким образом, стать методология выбора для изучения поведения белка в сложных клеточных средах. Это, в частности, справедливо для биохимических процессов, происходящих в плазматической мембране, так как они могут быть в принципе контролироваться в уменьшенным шумом полного внутреннего отражения (TIRF режиме). Вот образец освещение ограничено до до 200 нм тонкий ломтик в непосредственной близости к стеклу суrface, что приводит к значительной потере в сотовой фоне и из-за характеристик затухающих возбуждающего света, а также к существенному увеличению интенсивности флуоресценции 8,9 сигнала. Оба аспекта важны, когда стремится к высокой позиционной и временным разрешением в обнаружении одной молекулы.
Плоские SLBS не только совместимы с TIRF микроскопии. Когда функционализирован соответствующими лигандами они также обеспечивают прямой доступ к изучению молекулярной динамики признания клетка-клетка, как они происходят в иммунных клетках или других клетках. Они также могут быть просто использованы в положение подвижных и иным, не прилипшие клетки достаточно близко к стеклу, так что такие клетки могут быть отображены в TIRF освещения, что весьма желательно при эксперименты проводимости, включающие отслеживание одной молекулы или сверхразрешения одной молекулы на основе. Для этого белки должны быть загружены в очень мобильном SLB. Неотъемлемым преимуществом используемого Li PIDs в том, что нет неспецифического связывания белков вообще. Кроме того, SLBS можно рассматривать как двумерные жидкостей с присущей ему способностью исцелять себя; неровности в пределах стеклянной подложки компенсируются до определенной степени. Шаг за шагом протокол при условии, чтобы произвести очень мобильные бислои заряженные с белками интерес. Образование плоских SLBS описано, которые содержат 1-пальмитоил-2-олеоил-Sn-глицеро-3-фосфохолин (POPC) в качестве основного ингредиента (90-99%) и синтетических и функционализированный липидного 1,2-dioleoyl- SN-глицеро-3 - {[Н (5-амино-1-карбоксипентил) иминодиуксусной кислоты] сукцинил} никелевую соль (АРД НТА-Ni) в низкой численности (1-10%). POPC несет один насыщенной жирной кислоты и одну моно-ненасыщенной жирной кислотой и образует бислоев высокой текучестью даже при комнатной температуре. DGS НТА-Ni связывается с его головной группы на полигистидиновый хвостами и служит якорем для поли-гистидин-меченных белков выбора (рисунок 1).
"> Важно отметить, что микроскопии оборудование должно включать в себя ряд периферийных устройств, которые описаны ниже. С информацией, предоставленной и некоторые базовые знания в области оптики и лазерной физики, любой биолог должен быть в состоянии создать единую установку изображения молекулы. Образец возбуждение должно быть в идеале осуществляется на инвертированный микроскоп в полное внутреннее отражение режиме (TIRF), как этот режим уменьшает паразитные свет и чрезмерное фона, возникающего в противном случае из ячеистого автофлуоресценции 9. Для этого, специальная TIRF-способных цель (см ниже) и лазерная подсветка не требуется. Некоторые эксперименты требуют раз освещение в пределах миллисекунд и работать в быстрой последовательности. Чтобы сэкономить время освещения, или чтобы избежать ненужных отбеливание вызванного повторяющимся освещения, часто бывает полезно разделить излучаемого света в двух или более спектральных каналов. Это позволяет одновременно считывания из двух или более профилей выбросов, которые могут стать важным фактором, когда ПОВЕДЕНИЯTing эксперименты с Ферстер резонанс переноса энергии (FRET). Здесь выбросов в результате однократного импульса возбуждающего света может быть записан как от донора рвать и FRET акцептором (как сенсибилизированной излучения). Камера должна захватить достаточное количество фотонов, с достаточно низким фоне визуализировать отдельные флуорофоры во время освещения. Компьютерное программное обеспечение должны быть до задачи синхронизации закрывание возбуждения и получения изображения. Исчерпывающий обзор приведен ниже и на рисунке 2:TIRF-способным Цель: Для объективной основе TIRF освещения числовая апертура (NA) объектива должна быть равна или больше, чем 1,4 с использованием стандартных стеклянных слайдов (N = 1,515) 9. Увеличение может составлять от 60x до 150x. Цель должна быть исправлена хроматически для обеспечения confocality при визуализации различных флуорофоры.
Лазеры: Число имеющихся ЛасеВарианты г значительно увеличилось за последние годы. Современные электронном модулируемого непрерывного излучения диодных лазеров являются экономически эффективными и могут эксплуатироваться с беспрецедентной частотой и скоростью. Более дорогие газа ионные лазеры превосходят по качеству лазерного луча, но требуют внешнего закрывание (см ниже) и часто обширный (водных) охлаждения.
Возбуждение жалюзи: акустооптического модулятора (АОМ) позволяют быстро закрывание в быстрой последовательности 10. Для жесткой закрывая комбинацию ОСО с механическими жалюзи рекомендуется. Таким образом обширные нагрев ОСО из-за непрерывного освещенности избежать утечки света и от отита в выключенном положении компенсируется.
Линзы используются, чтобы расширить лазерные лучи и фокусировать их на задней фокальной плоскости объектива. Таким образом, свет возбуждения покидает цели в качестве параллельного пучка (рис 3), который требуется для TIRF освещенияобразец. Перемещение координационным центром в задней фокальной плоскости от центра в периферии цели будет изменить угол, под которым луч покидает цели, но не местоположение лазерного пятна на образце (фиг.3), которая является функцией от общего геометрии луча. TIRF освещение наступает в критический угол, который можно регулировать с помощью набора, функционирующих как перископ, чтобы перевести фокус лазера в фокальной плоскости объектива зеркал. Линзы должны быть исправлены хроматической и может быть использован в наборе двух или трех линз. Система трех линз состоит из двух линз, действующих, как телескоп, чтобы расширить лазерный луч (и, следовательно, освещение пятна на образце) и третий объектив, чтобы сосредоточиться на расширенную луч в задней фокальной плоскости объектива (рисунок 4). Обе функции (телескоп и фокусировки), также может быть достигнуто с помощью комбинации только двух линз (рисунок 4).
Зеркала должно быть не менее 95% отражательной чтобы избежать потери лазерного света. Для каждой регулировки пучка набор из двух зеркал обычно применяется в качестве такого расположения является достаточно точно настроить любой угол и положение лазерного луча.
Дихроичных накладки отражать и пропускать свет разных длин волн, указанных и используются для наложения или разделить пучки из двух лазеров.
Polychroic фильтры более сложны, чем дихроичных фильтров и нужно, чтобы отразить входящий возбуждающий свет и передавать выхода светового излучения от образца. Они размещены в кубе фильтра между объективом и микроскоп трубки объектива.
Очистка фильтров: в зависимости от типа лазера служащий д лазера очистить фильтры с узкой полосы пропускания должны быть помещены на лазерный луч прямо после выхода из лазера.
Notch фильтрыпредназначены для эффективно поглощать лазерное излучение с узкой полосой пропускания и передавать все другие легкие. Они размещены в пути излучения, чтобы отфильтровать любые ложные свет лазерного возбуждения. Тем не менее, режекторные фильтры работают только при 0 ° входящего угла. Если ширина полосы режекторного фильтра очень острые, разные углы входящие не могут быть отражены больше. Блокирование Коллимированный лазерного лазерного излучения не влияет, но обратно-рассеянного света не может быть эффективно препятствовало достижению камеру.
Моторные колеса фильтр оснащен соответствующими фильтрами колес может быть легко помещается в возбуждения и испускания пути и позволяют простой переключение между различной интенсивности света (при ношении ND фильтров) или люминесцентных каналов (при размещении в передней части дуги ксеноновой лампы или ртутной для Логометрический визуализации кальция или перед камерой, чтобы выбрать для излучающей флюорофора).
50:50 куб светоделитель сап используется для разделения лазерные лучи на два отдельных пучка возбуждения путей, а также объединить их в передней части перископа.
Светоделитель (путь выбросов): Для быстрого получения изображения без каких-либо необходимости внесения изменений физических фильтров, луч излучение разделяется на сине-смещается и красное смещение канала. В принципе, светоделители могут быть построены с использованием дихроичное клин или набор зеркал и дихроичное зеркало, чтобы отделить луч излучения в длине волны-зависимым способом. Два фильтра выбросов необходимы для очистки испускаемых каналов.
Пространственный фильтр Пространственная фильтрация пучка возбуждения иногда требуется удалить непараллельных световые лучи, испускаемые лазерными лучами низкого качества. Пространственный фильтр состоит из двух линз телескопа с небольшим отверстием расположен точно в фокусе обоих объективов. Таким образом ложные света в результате непараллельных участках лазерного луча становится эффективно заблокирован. СуCH условия должны быть выполнены при установлении TIRF основе микроскопии. Пространственной фильтрации возрастает с меньшими отверстий, которые более трудно позиционировать в фокальной точке, и с меньшими фокусными расстояниями первой линзы. Чтобы уменьшить эффекты, вызванные аберраций линзы целесообразно использовать вместо простых линз высокого качества и бесконечности коррекцией микрообъективов с небольшим увеличением (10x или 20x).
Перископ: а настройка перископ необходимо перевести сфокусированного лазерного пучка в задней фокальной плоскости объектива, необходимое условие для визуализации TIRF. Это может быть легко построена из двух двух-дюймовый зеркал, поступательного стадии для регулировки первое зеркало и пост для размещения второго зеркала, чтобы отразить расширенную и сфокусированный луч возбуждения в микроскоп (рисунок 5).
Которые обычно используются с задней подсветкой электронного умножения Зарядка соединенные устройства (EMCCD) для: камеразапись одиночных сигналов молекулы. Это из-за их высокой квантовой эффективностью (до 95%), с высокой скоростью сбора (до 30 МГц) и сравнительно низкий уровень шума. Охлаждение до -80 ° С уменьшает тепловой шум и поддерживается ряда имеющихся в настоящее время EMCCD камер. Ограничением технологии EMCCD, что шум камеры линейно возрастает с обоих усиления камеры и сигнал захвата. Это не тот случай с научными КМОП (sCMOS) камер, которые значительно дешевле и работают благодаря специальной архитектуре чипа sCMOS также гораздо быстрее, чем камер EMCCD. Однако проблема, связанная с КМОП-технологии является то, что получение изображений до сих пор нет какой-то степени количественного считывания на одном уровне молекулы, потому что каждый пиксель имеет разную чувствительность обнаружения. В принципе это может быть компенсировано за счет нормализации пиксельного, но эта процедура не тривиально 11. Вот почему мы все еще колеблетесь повторнооцениваем sCMOS камеры для микроскопии одной молекулы, но в связи с быстрым развитием этой технологии, камеры sCMOS может вскоре стать камера выбора. Медленные сканирования CCD камеры камеры избежать усиления шума, связанные с и пиксель дисперсию все вместе и поддерживать высокие темпы приобретения, если они могут работать в так называемом режиме «кинетического». В этом режиме вся чип камеры для области процентных (ROI), за исключением маскируется, что позволяет использовать сам чип в качестве устройства хранения данных. После того, как ROI подвергается впервые, в результате заряды смещаются в маскированной области чипа пикселей строке пикселей линии, где изображение защищено от дальнейшего воздействия света. После того, как смещение всех линий ROI в маске области завершена (в диапазоне суб-миллисекундного), сам ROI готова к следующей экспозиции. Этот цикл повторяется, пока все пиксельные строки ПЗС-матрицы не заряжается. Чип затем зачитал медленно заметно РедуCED шум считывания. Например, на пиксель чипа 1000 х 1300, 20 трансформирования из 50х50 пиксела могут быть записаны в быстрой последовательности. Поскольку изображения остаются на чипе в течение значительного времени, прежде чем зачитать, это имеет решающее значение для обеспечения высокого качества маскировки и охладить камеру (например, с помощью жидкого азота) в качестве средства для снижения избыточной тепловой шум. Некоторые EMCCD камеры также поддерживают режим кинетическую.
Программное обеспечение: Сроки лазеров, жалюзи, АОМ и экспозиции камеры, а также надлежащее хранение изображений, являются неотъемлемой любого успешного эксперимента изображений. В принципе многие определенные операции могут быть запрограммированы с имеющимися программными пакетами, которые приходят с камерой. Коммерческие пакеты программного обеспечения поддерживает большое количество периферийных устройств, которые могут быть реализованы с небольшим техническим ноу-хау.
Генератор импульсов, сбора данных (DAQ) плата (с аналоговыми и цифровыми выходными каналами) и осциллограф: Импульсный генератор являетсяотличный выбор для преобразования импульсов запуска в импульсы определенного времени и напряжения. Это способ лазеры можно точно контролировать для выходной мощности и приурочен миллисекунды в диапазоне суб-миллисекунд. DAQ платы с аналоговыми выходами достичь того же и легко интегрируются в материнскую плату компьютера с помощью слотов PCI. Длительность импульса, амплитуда и частота проверяются с помощью осциллографа.
Вложение всего пути луча возбуждения: Чтобы избежать колебания в профиле возбуждения из-за воздушных конвекции весь путь луча возбуждения должен быть закрытых от его лабораторной среде. Эта мера особенно важна при проведении TIRF микроскопии. Оптические компоненты также защищены от пыли и человеческого глаза от лазерного воздействия света. Корпуса могут быть легко строить из черной доске карты, которые можно купить в магазинах искусств.
Для определения текучести Recovery SLB флуоресценции После PhotobleacХин (FRAP) измерения 12 выполняются. Для FRAP существование двух путей пучка возбуждения целесообразно (рисунок 3). Первый путь луча предназначен для изображения флуоресценцию бислой. Это может быть сделано в конфигурации TIRF и с низким интенсивности света. Второй путь луча должна обеспечивать короткий, но интенсивный импульс отбеливатель и должны быть настроены в не-TIRF режиме, так что она покидает цели вдоль оптической оси. Круглый диафрагмы могут быть помещены в пути луча возбуждения (рисунок 8), чтобы проецировать совершенно круглый профиль отбеливателя с четкими краями. Для того, чтобы изображение это отверстие на плоскости объекта, его оптимальное положение будет в фокальной плоскости объектива 3 (смотри рисунок 3). Тем не менее, из-за большого фокусного расстояния этой линзы, отверстие изображение достаточно высокого качества может также быть получены, когда апертура находится в слегка сдвинуты позиций.
После выполнения тон визуализации эксперимент исходные данные должны быть проанализированы надлежащим образом. Несколько шаг за шагом протоколы предложил, которые охватывают регулировку основных настроек (например, силовых освещение и время, угол TIRF), сбора и анализа данных.
Protocol
1. Формирование и Функционализация Planar SLBS
- Смешивание липидов
- Чтобы получить 10% АРД NTA-Ni / 90% POPC липидного состава в растворяются 45 мг РОРС и 6,9 мг АРД NTA-Ni в хлороформе в 250 мл круглодонную колбу. Держите объем хлороформа минимума (всего несколько мл), чтобы испарить его в следующем шаге. Для 1% DGS НТА-Ni / 99% POPC липидного состава в использовании 49,5 мг POPC и 0,69 мг DGS-Ni НТА.
- Удалить хлороформ, используя роторный испаритель медленно - увеличение выше температуры окружающей среды не является необходимым. Кроме того, удар его внутри химической капотом в потоке инертного газа, такого как азот или аргон. Делая это постоянно обращать колбу, чтобы позволить одинаковое отложение липида сушки на нижней половине круглодонную колбу.
- После того, как большинство хлороформа упаривают, приложить колбу для вакуумной O / N, чтобы удалить хлороформ количественно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг важен, чтобы избежать загрязнениябелков и клеток с токсичного хлороформа на более поздних стадиях и обеспечить липидный бислой текучесть.
- Генерация небольших однослойных везикул (внедорожник) от высушенных липидов
Примечание: небольшие однослойные пузырьки (SUV) находятся между 20 нм и 100 нм в диаметре и могут быть легко получены обработкой ультразвуком ванны. Липидный экструзии, альтернативный метод, может привести к внедорожников и, в зависимости от размера пор фильтра, применяемого для экструзии, а также крупные однослойные везикулы (БУВ), которые 100 нм до 1000 нм по размеру. Тем не менее, внедорожники лучше подходят для формирования SLBS.- Внедорожники через ванны ультразвуком (показаны в видео):
- Degass PBS. Подвешивание высушенного липида смеси с 250 мл круглодонную колбу в 10 мл PBS дегазации.
- Заполните колбу инертного газа, такого как азот или аргон, закрыть его пробкой и запечатывают колбу в автоклаве ленты.
- Поместите запечатанный сосуд в ванне ультразвуком и разрушать ультразвуком липидов суспензиит 120 до 170 Вт, пока он не превратился ясно. Это займет от 30 до 60 мин.
- Контроль за ходом везикул формирования Spectro-фотометрически: последует, что поглощение неразбавленной эмульсии по сравнению с PBS остается постоянным при 234 нм (в качестве приближенного показателя концентрации липидов), но должна значительно падать при 550 нм (из-за снижения рассеяния света через Более крупные частицы).
- Для осаждения тяжелых без однослойные везикулы, которые препятствуют образованию непрерывной SLB, осаждени суспензии везикул центрифугированием при 150000 х г в течение 1 ч при 25 ° С и затем в течение 8 ч при 288,000 мкг, 4 ° С.
- Фильтры супернатанта через фильтр в шприце с размером пор 0,2 мкм.
- Измерить ОП при 234 нм и 550 нм для контроля четкость подготовке везикул и количество липидов слева.
- Хранить везикул при 4 ° С в атмосфере аргона или азота. При желании, использовать суспензии везикул для приготовления двухслойнойв течение нескольких месяцев.
- Внедорожники через липидный экструзии:
- Вкратце, проходят липидного подвеску несколько раз через фильтр с размером пор 0,1 мкм. Независимо от способа получения, центрифуги суспензии везикул в два раза (1H, 150,000g, 25 ° С, а затем 8 ч, 4 ° C, 288000 г), чтобы осадить без однослойные везикулы, которые тяжелее.
Примечание: При хранении при 4 ° С в атмосфере инертного газа, пузырьки могут быть использованы для приготовления двухслойной в течение нескольких месяцев.
- Вкратце, проходят липидного подвеску несколько раз через фильтр с размером пор 0,1 мкм. Независимо от способа получения, центрифуги суспензии везикул в два раза (1H, 150,000g, 25 ° С, а затем 8 ч, 4 ° C, 288000 г), чтобы осадить без однослойные везикулы, которые тяжелее.
- Внедорожники через ванны ультразвуком (показаны в видео):
- Формирование SLB и зарядки с белком
- Treat 24 х 50 мм # 1,5 стеклянные слайды с 3: 1 смеси концентрированной серной кислоты и 30% -ной перекиси водорода в течение 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за агрессивной природы смеси проявлять особую осторожность, то есть носить халат и защитные очки, как показано на видео! - Промыть стекла слайды в потоке DDh 2 O из бутылки шприца. Поместите их на тефлоновой подставке и дайте им высохнутьот 10 до 30 мин.
- Снимите нижнюю стеклянную слайд 8 или 16 камер также, заполнить дно с эпоксидным клеем и аккуратно чистую и сухую стеклянную слайд на клей покрытые основания камеры. Пусть клей затвердевает в течение примерно 10 мин. Удалить излишки клея снизу.
Примечание: герметичное уплотнение между стекло и камеры также могут быть легко достигнуты с использованием зубной двухкомпонентной силиконовой моделирования пасты, которая затвердевает в течение 10 30 мин. Эта печать не так твердо, как клей, но эпоксидная выдерживает регулярную физическую нагрузку. После эксперимента она может быть легко удалена из камеры, который затем многоразовые в будущих экспериментов. - Внесите 120 мкл (60 мкл) из 10-кратного PBS разбавленной суспензии в липидной каждую лунку 8 (16) - камера хорошо (полученного, как описано выше), и пусть виде двухслойной в течение 20 мин. Тщательно промыть бислой дважды 15 мл PBS. После того, как сформирован бислой имеет, он всегда должен быть погружен в буфере и не подвергается воздействию воздуха. Заполните каждую лунку весь путь с PBS и затем снять 330μl (камера 8-а) или (165μl 16-а камеры). Есть 350 мкл (175μl) оставил в скважине. Добавить 50 мкл 25 мкл () коктейля, содержащего His-меченных белков разводили в PBS в каждую лунку (400 мкл или 200 окончательного) и инкубируют при комнатной температуре в течение 60 мин в темноте. Плотность поверхностного белка может регулироваться изменением концентрации белка в течение этого инкубационного шага.
- Промыть каждую лунку дважды 15 мл PBS.
Примечание: Как правило, SLBS не должны быть использованы в экспериментах не более 6 ч после их зарядки с белком. В течение этого периода восстановления после фотообесцвечивания флуорофора остается до 95%, и никакой потери в двухслойной-ассоциированный белок не может быть обнаружен. Плотность белка должно быть определено до эксперимента (см. Ниже) - Необязательный шаг: Чтобы проверить неспецифическое связывание белка СГУ НТА-Ni, содержащей SLB, мыть SLB раз ФБР, содержащим 300 мМ имидазола. ПроТейн должен прийти полностью.
- Treat 24 х 50 мм # 1,5 стеклянные слайды с 3: 1 смеси концентрированной серной кислоты и 30% -ной перекиси водорода в течение 30 мин.
2. Микроскоп Настройка
- Для построения системы, способной микроскопии обнаруживать флуоресценция одиночных флуорохромами относятся к рекомендациям, изложенным в введении.
3. Силовые Измерения
Примечание: Флуорофоры могут быть легко насыщают избытком света возбуждения. Это ускоряет фотообесцвечиванию без дальнейшей усиления выброса и, таким образом, должен избегать. Для оптимизации освещения образца плотность мощности возбуждения должен быть измерен непосредственно на образце. Такие измерения могут служить в качестве основы для будущих экспериментов. Кроме того, зная соотношение между входным и выходной мощности лазера полезно при оценке, где свет теряется в системе формирования изображения.
- Перемещение луча возбуждения в вертикальном положении так, чтобы она покидает цели в угол 90 °.
- Поместите головку измерителя мощности на верхнем Oе пучка и измерения мощности пучка (= P). Документ результат.
- Использование перископ, включите луч в положение TIRF и изображения нетронутыми однородной люминесцентные двухслойной. Чтобы избежать отбеливания и насыщения сигнала ПЗС место нейтральной плотности (ND) фильтр с оптической плотностью (OD) от 2 до 3 в пути возбуждающего света.
- Измерьте интегрированные пунктам всей освещенной области (= я всего). Кроме того, измерить размер освещенной области (= В общей). Измеряют интегрированные счетчики (= I Центр) в максимально освещенной центральной точке, а также размер пятна (= центр).
- Измерьте фоновый сигнал на пиксель (= B), либо за пределами освещенной области или без освещения образца.
- Вычтите фонового сигнала из результатов измерений в 3). Сделайте это путем умножения числа пикселей области в целом вопрос (освещенной области или центральной точке) на фонерассчитывает на пиксель. (= Я всего - всего .B и я Center - центр .B).
- Разделите интегрированы и фон исправлены сигнал центральной точке по комплексному и фона исправлены сигнала всей области освещения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Результат показывает долю полной мощности находится в центральном месте (= (я в центре - центр .B) / (я всего - Всего .B)). Умножение этого результата с мощностью Р измеряется в 2.) результатов в силе света, освещающий центр место. - Определить размер пятна в центре μm². Для этого разделите размер пикселя камера в мкм на увеличении объектива, взять квадрат результате как μm² на пиксель.
- В качестве альтернативы измерить размер пикселя в пределах изображения с использованием микрометра слайда, размещенной на микроскоп и взять квадрат результате как области на пиксель. Несколькоiply это значение на количество пикселей, расположенных в центральной точке, чтобы прибыть на освещенной площади пятен.
- Разделить мощность Р осветительное центральной точке по размеру центральной точке центра, μm² для расчета интенсивности освещения на мкм 2. Приведен пример на рисунке 6.
- Значения плотности мощности, измеренные в не-TIRF освещения, как правило, ниже, чем присутствует в TIRF освещения 13, который также зависит от точного угла, под которым лазерный луч полностью отражается. Чтобы прийти к власти нынешних плотности под TIRF освещения, изображение откалиброван люминесцентные бусины диаметром 0,1 мкм на как в не-TIRF TIRF и. Отношение борта интенсивности флуоресценции измеряется в TIRF и не-TIRF режиме составляет коэффициент преобразования С, который позволяет конвертировать измеренные значения плотности мощности в тех эффективен в TIRF освещения (уравнение 1).
удельная мощность TIRF = С • плотность мощности без TIRF (уравнение 1)
с С = интенсивность шарик Т МАФ / интенсивность шарик без TIRF
4. Плотность Измерения
- Определить средний сигнал отдельных флуорофоров, расположенных на бислой. Двухслойные подключением молекулы MHC загруженные с люминесцентными пептидов идеально подходят для этой цели, так как белка: этикетка стехиометрии ровно один. При необходимости отбеливатель все этикетки на бислоя в поле зрения, и пусть флуоресценция восстановить визуализировать отдельные флуорофоры.
- Запись изображения в быстрой последовательности (например, применять протокол в приобретении потокового) и контролировать отдельные молекулы мобильности на протяжении нескольких кадров. Для получения более подробной информации обратитесь к рисунку 7.
- Определите одну молекулу и объемной флуоресценции только в этой ROI. Интеграция сигнал от ROI, который является достаточно большим, чтобы захватить 99% или более функции рассеяния точки курса единой излучателя. При использовании камеры с размером пикселя 16-20 мкм (указано в спецификации камеры изготовителя), цель с увеличением в 100 раз и числовой апертурой, равной или большей, чем 1,45, взять область 7 на 7 пикселов с пик интенсивности расположен в центре площади.
- Для определения фонового сигнала, интегрировать пунктам соседней 7 на 7 пикселей площади, которая не содержит флуоресцентный сигнал. Вычтите фон из сигнала одной молекулы для определения скорректированного значения для фтора одной молекулыценции. Выберите только сигналы, которые до сих пор видны в следующем кадре.
5. Тестирование целостности бислоя
- Подготовьте флуоресцентную бислой и поместить его на столике микроскопа, как описано выше.
- Отрегулируйте фокус и сделать снимок бислоя в режиме TIRF. Применить короткий, но интенсивный импульс отбеливателя в не-TIRF режиме абляции флуоресценции в течение небольшого дискообразной ROI.
- Возьмите образ бислоя в режиме низкой интенсивности TIRF сразу после отбеливания, а затем каждые пять-десять секунд, чтобы контролировать скорость восстановления флуоресценции.
- Мове в другую область на бислоя и выполните шаг 2 и 3. Возьмите другое изображение в режиме низкой интенсивности TIRF 5 мин после отбеливания импульса. Определите интенсивность я отправляю отбеливатель в области отбеливания и сравнить его с интенсивностью до отбеливания I 0 в начале эксперимента (не отбеливание не должно иметь место) для расчета неподвижный фракции (ИФ) следующим образом:
Неподвижный Фракция ЕСЛИ (%) = (I 0 - я отправляю отбеливатель) / (I 0 - фон) х 100,
с фоном = измеренная интенсивность в ROI без света возбуждения применяется
ПЧ должен быть меньше, чем 10% (в идеале менее 5%).
Representative Results
Архитектура единой системы молекул флуоресцентной микроскопии изложена достаточно подробно на рисунке 2. Отдельные детали, такие как оптические компоненты и других аппаратных компонентов объясняется во введении. Пути оптический луч возбуждения, которые приводят в определенной манере к TIRF и не-TIRF освещения, показаны и объяснены на рисунках 3 до 5. Обратите внимание на расположение разделителя 50:50 луча перед первой перископа зеркало, расположенной на микрометр переводимые этап (Рисунок 5). Это Светоделитель накладывает TIRF луч, используемый для визуализации (указанный в зеленый) и луч без TIRF (обозначается красным), используемого для отбеливания или активации местного диафрагмы определенные света опосредованной образца (как указано на рисунке 3). Объединенные пути прохождения света (Рисунок 5, указанные в оранжевый) отражаются по второму перископа зеркало в задней порту перевернутой MICRoscope. Как пояснил на рисунке 4 и указаны на рисунке 2, реализация двух или трех выпуклых линз расширяет профили лазерного луча и фокусируется лазерные лучи на задней фокальной плоскости объектива, чтобы дать начало двум коллимированных лучей освещения образца в TIRF и соответственно, в не-TIRF.
Пример измеренных значений интенсивности, необходимых для расчета плотности мощности на образце показано на фиг.6. В среднем фоновый сигнал, чтобы вычесть из света, измеренными в освещенной и центральной области (используемый для получения изображений), определяется в области в пределах Поле зрения, которая не освещена лазерным лучом (здесь 7089 отсчетов). Фоновые исправлены средние интенсивности освещение (1684) и пунктам центральная площадь (4830 единицы), затем умножается на соответствующие размеры области, чтобы привести к интегральных интенсивностей (1.471х 10 8 рассчитывает на освещенной области и 3,424 х 10 7 рассчитывает на центральной площади). Отношение интегральных интенсивностей в пределах центральной и освещенных областей дает фракцию общей мощности осветительного центральную область (0,23 или 23%). Как показано в фильме, общая мощность должна быть определена на цель с использованием измерителя мощности в режиме без освещения TIRF. В нашем примере это доводят до 5 мВт, таким образом, что приводит к власти 5 мВт х 0,23 = 1,15 мВт в пределах центральной области. Так 41,5 пикселей количестве в нашем примере 1 мкм 2, центральная область имеет размер 7089 пикселей /41.5 пикселей х мкм 2 = 170,8 мкм 2. Разделив власть света, освещающего центральную зону (1.15 мВт) по этой области (170,8 мкм 2) дает среднюю мощностьПлотность 0,7 кВт / см 2 в центральной области.
Рисунок 7 показывает изображения и соответствующие результаты интенсивности одиночных флуорофорами приобретенных в быстрой последовательности (100 кадров в секунду, то есть с времени 10 мс). Для количественного интенсивности в среднем сигнал прямоугольной области семь семь (= 49) пикселей, которая охватывает сигнала флуоресценции определяется. Кроме того, среднее значение сигнала фона определяется в прямоугольной области семи семь пикселей в непосредственной близости от сигнала единственного молекулы. Фон исправлены среднем сигнал умножается на количество пикселей в регионе (= 49), чтобы привести к единой молекулы сигнала (выделены жирным шрифтом).
Представитель FRAP эксперимент разработан для оценки подвижности SLB-связанных флуоресценции-меченных белков показано на рисунке 8. Обратите внимание, на рисунке 8A repetiный использование расширенной визуализации луча низкой интенсивности и одноразового использования секунды более узком и диафрагмы определенные высокую интенсивность пучка для быстрого флуорохрома абляции на втором нуля времени. Фон вычитается средние интенсивности в пределах желтого круга, которые были нормированной начальной средней интенсивности значения до отбеливателя импульса, показаны на рис 8B против времени, чтобы записать скорость и степень, в которой флуоресценция выздоровел. Как показано более 90% (указывается зеленой линии) исходной интенсивности двухслойной восстановился в 75 сек после флуорохрома абляции. Как следствие менее 10% белков, встроенных в показанном SLB неподвижны.
Рисунок 1. Схема контур системы SLB. (A) SLBS изготовлены из РОРС (90-99%) и синтетический липид АРД НТА-NI (1-10%). Они образуют спонтанно, когда чистые стеклянные поверхности взимается с внедорожников, состоящих из соответствующих липидов. (Б) После того, как формируется, эти SLBS может быть легко украшены растворимых белков расширенных либо с одной С- или N-концевой метки с двенадцати гистидины (12H, для пример костимулирующих молекулы В7-1 и адгезии ICAM-1) или белковые димеры продлен с двумя теги, содержащий шесть гистидины каждый (2x6H, например димера αβMHC класс II). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого фигура.
Рисунок 2. Обзор путей возбуждения и излучения пучка. Газ ионные лазеры (например, Ar + или Кг +) может работать для быстрой закрыванием с использованием акустооптического оптического мес dulators. Лазеры диоды в настоящее время доступны во многих длинах волн и представляют собой отличную альтернативу, поскольку они могут быть в электронном виде модулированного в микросекунды гнева. Обратите внимание, что лазерные лучи могут быть легко регулируется с двух (дихроичными) зеркал и раскола и в сочетании с использованием простых светоделителей дать начало двум или более траекторий лучей. В этом примере изображения TIRF луч (чтобы контролировать события) и отбеливатель луч (либо к отбеливающих флуорофорами или фото активировать в клетках молекул в порядке диафрагмы определены) используются. Оба пути возбуждения можно управлять независимо друг от друга за счет использования дополнительных жалюзи. Перископ позволяет переводить сфокусированные лазерные лучи внутри задней фокальной плоскости объектива, чтобы произвести TIRF освещение образца. Люминесцентная изображение может быть спектрально разделить с использованием пучка излучения сплиттер до приобретения с использованием ультра-чувствительной камеры (например, ЭМ-CCD или CMOS научно камеры)..com / файлы / ftp_upload / 53158 / 53158fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Установка TIRF освещение, переводя сфокусированного пучка в задней фокальной плоскости объектива. Как показано фокальную точку лазерного луча смещается в задней фокальной плоскости объектива от центра к периферии через транслокации пучка (с помощью зеркала расположение перископ). В результате параллельный пучок листьев цель в наклоненном освещения до тех пор, критический угол не будет достигнут, на котором полное внутреннее отражение происходит. Мимолетной поле генерируется на поверхности стекла-медиа, где полное отражение происходит. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное Fi фигура.
Рисунок 4. Простые оптические системы для фокусировки лазерного луча в задней фокальной плоскости объектива. Либо три или две линзы нужно расширить лазерный луч и сфокусировать его на задней фокальной плоскости объектива TIRF. Две системы линз объектива содержат меньше связанного с ошибок, чем системы трех линз и, возможно, лучше подходит для генерации луча изображений TIRF. Три линзы может быть предпочтительным, когда стремятся к определенной расширения луча и осветительного месте с острыми краями, как можно было бы необходимо для исследований, использующих фото-активацию или -bleaching. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
/53158fig5.jpg "/>
Рисунок 5. Аннотированный фотографию на пути луча в задней части флуоресцентного микроскопа. Как уже указано на рисунке 2 один тростника легко реализовать два пучка возбуждения, один в TIRF (обозначается зеленым) другой в режиме не-TIRF (указано в красный). Они стали покрыт с использованием разветвителя 50:50 луча (BS). Выпуклые линзы (L1 и L2) расположены в соответствующих лучей фокусировать их на задней фокальной плоскости объектива (не показан). Перископ, состоящий из двух зеркал (М1 и М2) направляет оба луча через порт вступления в микроскоп. Первое зеркало (М1) может быть перемещен с использованием стадии перевода (TS) (поворотом микрометрического винта, как показано), чтобы переместить одну из пучков в TIRF положении. После того, как TIRF было установлено, второй пучок (используется для фото-отбеливание или активация ИС, здесь, указанной в красный) можно регулировать независимо от TIRF луча, чтобы оставить цель в не-TIRFРежим. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. Измерение мощности в пределах центральной области освещения месте. Как указано выбрал соответствующие регионы интерес, которые отражают фона, весь освещается площадь (IA) и центральная область (CA), где впоследствии будут записаны события. Вычитание значений из фоновых тех, которые записаны на IA и СА и интегрировать интенсивности путем умножения скорректированных средних интенсивностей с количеством пикселей, присутствующих в каждой области (= интегральных интенсивностей). Разделите интегральной интенсивности CA тем, что ИА прибыть в пропорции мощности пучка, освещающего CA (в данном примере 23%). Определить силу света, освещающего CA путем умножения общей мощности пучка (здесь: 5 мВт) с долей освещающего CA (здесь: 0,23). Чтобы определить размер центральной области умножить площадь (здесь: 7089 пикселей) с коэффициентом пиксель в области преобразования размер (здесь: 1 / 41,5 мкм 2 пикселя -1). Чтобы прийти к средней плотности мощности возбуждающего света, освещающего CA, поделить власть (здесь: 1,15 мВт) по размеру CA. (Здесь: 170,8 мкм 2) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7. Количественный одиночных сигналов молекул. (А) Время, конечно одиночных флуорофорами На SLB. Заданного размера область 7 х 7 пикселей интерес (ROI), желтый, расположенных вокруг сигнала для количественного определения. Предпосылки определяется из соседней 7 х 7 пикселяROI (зеленый). (Б) количественные средние интенсивности пикселей в списке. Для определения сигнала одной молекулы, фоновые значения (зеленый ROI) вычитаются из значений сигнала (желтый ROI) и умножается на 49. (C) Одиночные молекулы интенсивности одного флуорофора которые в зависимости от времени. Отметим, что 90 мс момент времени опускается, как флуорофор находится в процессе отбеливания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8. флуоресценции восстановления после фотообесцвечивания (FRAP анализ) для определения целостности SLB. (А) FRAP проводили на бислой несущей IEK / MCC-Alexa Fluor 647. Каждый 10-й образ эксперимента. (Б) FRAP количественного эксперимента, показанного на (А), Значения указывают средние интенсивности (I) в пределах желтой ROI, показанной на (А), разделенная на начальный интенсивности (I O) до обесцвечивания. Красные точки данных отображаются в (А), зеленая линия обозначает 0,9 восстановление оригинальных интенсивности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Одноместный микроскопии молекулы обеспечивает уникальную возможность для изучения поведения белков в родном клеточной среде. Молекулярная визуализация, поэтому все более привлекательными для широкого научного сообщества, однако многие ученые до сих пор жизнь уклоняться от первоначальных инвестиций в технологии и опыт. Основное преимущество, возникающие от сборки собственной системы визуализации является то, что можно легко регулировать, чтобы конкретные потребности никто.
Как предложено здесь не-TIRF луч возбуждения может быть легко реализованы в дополнение к существующей пути TIRF света, если быстрый и определяется фото-отбеливание (или: активация) флуорофоров и лигандов, например, желаемые при выполнении FRAP или лиганд uncaging эксперименты 14 , Введение из пучка излучения разветвитель позволяет одновременной записи по меньшей мере двух, а в некоторых случаях до четырех люминесцентных каналов. Список расширений в сущности, ограниченной толькосвое собственное воображение.
Например, реализация моторизованный фильтра выбросов колесо в пути излучения позволяет для быстрого переключения между до десяти различных флуоресцентных каналов. При объединении двух моторизованных фильтром твердых колес (каждый из которых оснащен слотами 10 фильтра), соединенных последовательно, до 18 флуоресцентных каналов могут быть считаны. Изображений TIRF основе могут быть дополнены с измерениями мобилизации кальция и помех Отражение микроскопии (IRM) после интеграции пути лампы возбуждения ксеноновой или ртутной. IRM является методом выбора для визуализации степень, в которой клетки прикрепляются к поверхности стекла или SLB и, следовательно, может обеспечить критическую информацию при интерпретации данных визуализации TIRF основе. Установление луч расширенную возбуждения с использованием простого дихроичного зеркала и дополнительного лазера 405 нм позволяет проводить локализации фотоактивация микроскопии (Palm) или стохастической микроскопии оптической реконструкции (грозовых), то есть два superresolutионные методологий с позиционной точностью ниже дифракционного предела видимого света 15,16.
Тем не менее, экспериментальное успех не только вопрос соответствующего оборудования. Для того, чтобы в полной мере воспользоваться TIRF основе изображений с уменьшенным шумом, клетки должны сделать контакт с поверхностью в моде, что не накладывает ограничений на клеточной поверхности или, что мешает физиологии их плазматической мембране. SLBS функционализирован соответствующие белки для клеточной адгезии превышают хорошо подходит для этой цели, потому что все SLB-встроенные лиганды с боков мобильного и настроить их боковую позицию в бислой в ответ на связывание с рецептором и сегрегации динамику.
Для изготовления SLBS воспроизводимым образом, лучше всего начать с внедорожников высокой чистоты. Как описано здесь, это, таким образом, важно, чтобы удалить пузырьки, многослойные которые также произведенные во ультразвуком, в два этапа, поскольку эти ультрацентрифугирования Interfere с образованием смежных SLBS, показывающих высокую текучесть. SLBS из формы высокого качества только на чистых стеклянных поверхностей. После очистки предметные стекла следует использовать немедленно или хранить в вакууме. Важно отметить, что SLBS никогда не должны подвергаться воздействию воздуха, так как это приведет к их разрушению. SLB стиральная включает, как показано, буфер промывки с использованием серологического пипетки, так как это не только сохранить, но процедура также экономия времени.
В процессе уборки и очистки SLB-резидентов белков применение моющих средств следует избегать. Это потому, что моющее средство снизит мобильность белка значительно, даже когда они присутствуют в следовых количествах. Чтобы обойти потребность в моющем средстве вместе, растворимый секретируемый выражение полигистидиновой метки оборудованный лигандов рекомендуется в клетках млекопитающих или насекомых. Если рефолдинга из телец включения E.coli требуется осторожность должна применяться для удаления моющих средств эффективно из телец включения до их непредставленных и повторной укладки,
Основным преимуществом использования SLBS результаты от своей модульной и преобразовываю- природы, которая позволяет специально препарировать роль данного рецептора-лиганд взаимодействия для активации клеток и клеточной адгезии. В связи с этим важно, чтобы отметить, что АРД НТА-Ni должен присутствовать в 10% в пределах SLB, чтобы предотвратить белков, конкурирующих за НТА-Ni сайтов связывания. При использовании SLBS укрывательство только 1% или 2% DGS НТА-Ni, снижение объединения данной полигистидиновые-тегами видов белка можно заметить, особенно при совместном инкубации увеличивается количество секунды полигистидиновые метками видов белка (не опубликовано наблюдение). Это явление не наблюдается при работе с SLBS, показывающих 10% DGS NTA-Ni.
В то время как мы никогда не наблюдали неспецифическое связывание любого полигистидиновая-меченого белка в тестируемой SLBS содержащих АРД NTA-Ni, эта возможность должна быть проверена при введении белка в первый раз,Для этого мы рекомендуем использовать SLBS лишенных DGS-NTA Ni (белок не должен связывать). Во-вторых, при использовании SLB, содержащий DGS NTA-Ni, белок должен оторваться полностью после мытья SLB с PBS, содержащего 300 мМ имидазола.
Еще одним важным преимуществом использования SLBS, что переходные взаимодействия и сигнализации события могут быть проверены с повышенной пространственно-временной резолюции 17-19. Это, по крайней мере отчасти потому, что трехмерный процесс скрепления по существу сводится к двум измерениям изображений, особенно при записи в шума ослабленный режим TIRF. Использование SLBS совместим с обнаружением сигнала одна молекула, предпосылки для фото-активированный локализации микроскопии (PALM) или стохастической оптической микроскопии реконструкции (STORM), т.е. сверхразрешения микроскопии с разрешением ниже дифракционного предела 15,16. Эти специальные условия возможности позволяют одной молекулы Форстер резонансной энергии Transfer эксперименты предназначены для визуализации отдельных белок-белковых взаимодействий в синаптическую среды 20. Этот подход объясняется довольно подробно в Jove публикации называется "Измерение ТКР ПКИКЖ связывания с использованием FRET основе микроскопии анализа" 21.
При интерпретации экспериментов SLB-основанные всегда должны иметь в виду, что не все свойства плазматической мембраны живой клетки являются признакам по SLBS, и что некоторые из пропавших без вести качеств может повлиять на физиологию под следствием. Ведь, SLB-встроенные белки свободно диффундирующих и не организованы в мембранных микродоменов, как большинство их коллег сотовых являются 5,6,22. Прикол в плазме листы мембраны, полученные из адгезивных клеток, которые сохраняют плазмы мембраны архитектуру живых клеток в какой-то степени, были успешно использованы для изучения поглощения с мембраной встроены антигенов В-лимфоцитов 23. Тем не менее, даже такоймембраны не взаимодействуют с динамичной цитоскелета и не имеют никакой гибкости, поскольку они поддерживаются жесткой поверхности стекла. Ввиду этих расхождений, очевидно, существует потребность в инженерных SLBS, которые предлагают средства для полочкам белки в определенном моды и которые поддерживаются поверхностей регулируемым гибкости или поверхностей, которые меняют свою жесткость в ответ на локально применяемых световых импульсов.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
М. была поддержана Шредингера общении Австрийским научным фондом (FWF, J3086-B11) и благодарит Макса Планка общества на финансовую и административную поддержку. С. была поддержана Венской науки и техники (КОС фонда, LS13-030). JH при поддержке Венской науки и техники (КОС фонда, LS14-031).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 glass slides | VWR | 631-0853 | |
| 250ml round bottom flask | VWR | 201-1357 | |
| 50:50 beam splitter cubes | Thorlabs | BS013 | |
| Acousto-opitcal modulator C1205-2 | Isomet | - | only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used |
| Alexa Fluor 488-NHS | Life technologies | A-20000 | |
| Alexa Fluor 555-NHS | Life technologies | A-20009 | |
| Alexa Fluor 647-NHS | Life technologies | A-20006 | |
| autoclave tape | VWR | 489-1312 | or any other heat-stable sticky tabe |
| Avanti Mini-Extruder | Avanti Lipids | 610000 | alternative to the bath sonicator |
| bath sonicator QSONICA Q700 | QSONICA | Q700 | |
| beam splitter | Cairn | P280/210/MLS | |
| Büchi rotary evaporator | VWR | 531-0837 | |
| camera | Andor | iXon Ultra 897 | see manuscript text for alternatives |
| concentarted hydrogenperoxide | Roth | 9683.1 | |
| concentrated sulfuric acid | Roth | X944.2 | |
| epoxy glue | Uhu | 45705 | Uhu plus sofortfest 2min |
| filter wheel | Sutter instruments | Lambda 10-2 | |
| LabTek chambers | VWR | 734-2062 | |
| laser | Toptica | - | different variants (wavelengths 375 - 785 nm) are available |
| lens | Thorlabs, Newport | - | |
| DGS NTA-Ni (lipid) | Avanti Lipids | 790404C | already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended |
| POPC (lipid) | Avanti Lipids | 850457C | already in Choroform-solved delivered version is recommended |
| microscope Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | - | |
| mirrors | Thorlabs | BB1-E02 | |
| optical filters | AHF, Chroma, Semrock | - | filter sets are available for many different combinations of dyes |
| oscilloscope | BK Precision | 2120C | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | degas before usage |
| periscope | Thorlabs | RS99/M | |
| picodent twinsil 22 | Picodent | 13001000 | alternative to the epoxy glue |
| power meter Lasermate-Q | Coherent | - | any powermeter sensitive in the used spectral range will do |
| pulse generator | Stanford Research Systems | SRS DG535 | |
| spatial filter | Thorlabs | KT310/M | |
| syringe filter 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
| TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46 | Zeiss | 440782-9800-000 | |
| trichloromethane/chloroform | Roth | 3313.1 | |
| tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm | Thermo Fisher | 45237 | |
| Sorvall ultracentrifuge | Thermo Fisher | RC M150GX | |
| ultracentrifuge rotor | Thermo Fisher | S120-AT2 | |
| UV spectrophotometer Nanodrop 2000c | Thermo Fisher | - | |
| vacuum pump | VWR | 181-0248 |
References
- Walter, N. G., Huang, C. Y., Manzo, A. J., Sobhy, M. A. Do-it-yourself guide: how to use the modern single-molecule toolkit. Nat Methods. 5, 475-489 (2008).
- Sahl, S. J., Moerner, W. E. Super-resolution fluorescence imaging with single molecules. Current opinion in structural biology. 23, 778-787 (2013).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster. Immunity. 25, 117-127 (2006).
- Kaizuka, Y., Douglass, A. D., Varma, R., Dustin, M. L., Vale, R. D. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci U.S.A.. 104, 20296-20301 (2007).
- Wilson, B. S., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Gaudet, E. A., Oliver, J. M. High resolution mapping of mast cell membranes reveals primary and secondary domains of Fc(epsilon)RI and LAT. The Journal of cell biology. 154, 645-658 (2001).
- Lillemeier, B. F. TCR and Lat are expressed on separate protein islands on T cell membranes and concatenate during activation. Nat Immunol. 11, 90-96 (2010).
- Woof, J. M., Burton, D. R. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nature reviews. Immunology. 4, 89-99 (2004).
- Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of cell biology. 89, 141-145 (1981).
- Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in cell biology. 89, 169-221 (2008).
- Wieser, S., Moertelmaier, M., Fuertbauer, E., Stockinger, H., Schutz, G. J. (Un)confined diffusion of CD59 in the plasma membrane determined by high-resolution single molecule microscopy. Biophys J. 92, 3719-3728 (2007).
- Huang, F. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
- Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys J. 16, 1055-1069 (1976).
- Axelrod, D., Burghardt, T. P., Thompson, N. L.
- Huse, M., Quann, E. J., Shouts Davis, M. M. Whispers and the kiss of death: directional secretion in T cells. Nat Immunol. 9, 1105-1111 (2008).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Bunnell, S. C. T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies. J Cell Biol. 158, 1263-1275 (2002).
- Sherman, E. Functional nanoscale organization of signaling molecules downstream of the T cell antigen receptor. Immunity. 35, 705-720 (2011).
- Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463, 963-967 (2010).
- Axmann, M., Schuetz, G. J., Huppa, J. B. Measuring TCR-pMHC binding using a FRET-based microscopy assay. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Lillemeier, B. F., Schuetz, G. J., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Wilson, B. S., Davis, M. M. Plasma membrane-associated proteins are clustered into islands attached to the cytoskeleton. Proc Natl Acad Sci U.S.A.. 103, 18992-18997 (2006).
- Natkanski, E., et al. B cells use mechanical energy to discriminate antigen affinities. Science. 340, 1587-1590 (2013).
