Introduction
Förstå de mekanismer genom vilka membranproteiner uppfyller deras cellulära funktion kan ofta vara en utmanande uppgift, eftersom deras verkningsmekanismer är ofta definieras av låg affinitet interaktioner, som är svåra att upptäcka och utvärdera med konventionella biokemiska metoder. Membranproteiner kan vidare höganrikat i specifika membrandomäner 5,6 eller bildar dynamiska högre ordning strukturer, vilket kan i princip ändra deras biologiska aktivitet 7.
Icke-invasiv laser-assisted enda molekyl fluorescensmikroskopi har därmed blivit den metod val att studera protein beteende i komplexa cellulära miljöer. Detta gäller i synnerhet för biokemiska processer som äger rum vid plasmamembranet, eftersom dessa kan i princip övervakas i bullerreducerade total inre reflektion (TIRF) läget. Här provbelysning är begränsad till en upp till 200 nm-tunn skiva i omedelbar närhet av ett glas SUrface, vilket resulterar i en signifikant förlust i cellulär bakgrund och, på grund av egenskaperna hos det evanescenta excitationsljus, också i en väsentlig ökning i fluorescens signalintensiteten 8,9. Båda aspekterna är viktiga när siktar på hög positions och temporal upplösning i en enda molekyl upptäckt.
Planar SLBs är inte bara kompatibel med TIRF mikroskopi. När funktion med lämpliga ligander de ger också direkt tillgång till studera de molekylära dynamiken i cell-celligenkänning som förekommer i immunceller eller andra celler. De kan också enkelt användas för att positionera rörliga och i övrigt icke-vidhäftande celler nära nog till objektglaset så att sådana celler kan avbildas i TIRF belysning, vilket är mycket önskvärt när lednings försök med enda molekyl spårning eller enda molekyl baserad Superresolution. För detta ändamål proteiner måste lastas på en mycket rörlig SLB. En inneboende fördel med den använda li PID är att det inte finns någon ospecifik bindning av proteiner på alla. Dessutom kan SLBs betraktas som tvådimensionella vätskor med en inneboende förmåga att läka sig själva; oegentligheter inom glas stöd kompenseras upp till en viss grad. Ett steg för steg-protokollet är anordnad för att generera mycket rörliga bilayers laddade med proteiner av intresse. Bildningen av plana SLBs beskrivs, vilka innehåller en-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (POPC) som huvudingrediens (90-99%) och den syntetiska och funktionaliserad lipid 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3 - {[N- (5-amino-1-karboxipentyl) iminodiättiksyra] -succinyl} nickelsalt (DGS NTA-Ni) i låg förekomst (1-10%). POPC uppbär en mättad fettsyra och en enkelomättad fettsyra och bildar lipiddubbelskikt med hög fluiditet även vid RT. DGS NTA-Ni binder med dess huvudgrupp till poly-histidin svansar och fungerar som ankare för poly-histidin-taggade proteiner av val (Figur 1).
"> Viktigt måste mikroskopi hårdvara innefatta ett antal kringutrustning som beskrivs nedan. Med de uppgifter som lämnats och vissa grundläggande kunskaper i optik och laserfysik, bör varje biolog kunna bygga en enda molekyl avbildning setup. Sample excitation bör helst vara utförs på ett inverterat mikroskop i total inre reflektion (TIRF) läge som denna regim minskar falskt ljus och överdriven bakgrund som uppstår annars Cell auto-fluorescens 9. För detta, en särskild TIRF-kapabla mål (se nedan) och laserbelysning behövs. Vissa experiment kräver belysnings gånger inom millisekundintervall och drivs i snabb följd. Om du vill spara brinntid eller för att undvika onödig blekning orsakad av upprepad belysning är det ofta bra att dela det emitterade ljuset i två eller flera spektrala kanaler. Detta gör det möjligt för samtidig avläsning av två eller flera utsläppsprofiler, som kan bli en viktig faktor när conducting experiment med Förster Resonance Energy Transfer (FRET). Här kan spelas in emissionen efter enstaka exciteringsljuspuls både från FRET-givare och FRET-acceptor (såsom sensibiliserade emission). Kameran ska fånga tillräckligt fotoner med tillräckligt låg bakgrund för att visualisera enstaka fluoroforer under brinntid. Dator program måste vara upp till uppgiften att synkronisera excitation stängning och bildtagning. En omfattande översikt ges nedan och i figur 2:TIRF-kapabla mål: För målbaserad TIRF belysning den numeriska bländaröppningen (NA) i målet måste vara lika med eller större än 1,4 med användning av standardglas (n = 1,515) 9. Förstoring kan variera mellan 60x till 150x. Målet bör vara kromatiskt korrigeras för att möjliggöra konfokalitet när avbildning olika fluoroforer.
Lasrar: Antalet tillgängliga lasrarr optioner har ökat väsentligt under de senaste åren. Moderna elektroniskt modulerbar kontinuerlig våg diodlasrar är kostnadseffektiv och kan drivas med oöverträffad frekvens och hastighet. Dyrare gas jon lasrar utmärka sig i laserstrålen kvalitet, men kräver extern stängning (se nedan) och ofta omfattande (vatten-) kylning.
Exciteringsluckor: Akusto-optiska modulatorer (AOM) tillåter snabb stängning i snabb följd 10. För tät stänga kombinationen av en AOM med mekaniska slutare rekommenderas. På detta sätt omfattande uppvärmning av AOM på grund av kontinuerlig ljusexponering undviks och ljus läcker från AOM i off-läget avbryts ut.
Linser används för att vidga laserstrålar och för att fokusera dem på det bakre fokalplanet av målet. På så sätt lämnar excitationsljuset målet som en parallell stråle (fig 3), som krävs för TIRF belysning avprovet. Moving fokalpunkten inom det bakre fokalplanet från centrum till periferin av målet kommer att ändra vinkeln vid vilken strålen lämnar målet, men inte placeringen av laserpunkten på provet (figur 3), som är en funktion av den totala strålen geometri. TIRF belysning följer vid en kritisk vinkel, som kan justeras med hjälp av en uppsättning av speglar fungerar som ett periskop att översätta brännpunkt lasern inom fokalplan målet. Linser bör kromatiskt korrigeras och kan användas i en uppsättning av två eller tre linser. En tre-linssystemet består av två linser som fungerar som ett teleskop för att vidga laserstrålen (och följaktligen belysnings fläck vid provet) och en tredje lins för att fokusera den breddade strålen i det bakre fokalplanet av målet (Figur 4). Båda funktionerna (teleskop och fokus) kan också uppnås genom en kombination av endast två linser (se Figur 4).
Speglar bör vara minst 95% reflekterande för att undvika förlust av laserljus. För varje stråle justering en uppsättning av två speglar brukar tillämpas som sådant arrangemang är tillräcklig för att exakt justera valfri vinkel och position för en laserstråle.
Dikroiska över reflektera och sända ljus av olika våglängder specificerade och används för att överlagra eller dela balkarna av två lasrar.
Polychroic filter är mer komplicerade än bikromatfilter och behövs för att reflektera inkommande excitationsljus och överföra utgående emissionsljus från provet. De är placerade i filter kuben mellan målet och mikroskopet tublinsen.
Städa upp filter: Beroende på vilken typ av laser employe d laser städa upp filter med en smal överföringsbandbredd ska placeras in i laserstrålen direkt efter det lämnar lasern.
Notchfilterär utformade för att på ett effektivt sätt absorbera laserljus med en smal bandbredd och överföra alla andra ljus. De är placerade i banan utsläpps att filtrera bort alla falska laser excitation ljus. Men notch filter fungerar endast vid 0 ° inkommande vinkel. Om bandbredd av notchfiltret är mycket skarp, kan de olika inkommande vinklar inte återspeglas längre. Blockering av kollimerade laserlaserljus påverkas inte, men återspridda ljuset kanske inte effektivt hindras från att nå kameran.
Motoriserade filterhjul utrustade med lämpliga filter hjul kan lätt placeras i excitation och emissions vägen och tillåta enkel växling mellan olika ljusstyrkor (när den är utrustad med ND-filter) eller fluorescerande kanaler (när den placeras framför en xenon eller kvicksilverbåglampa för ratiometrisk kalcium avbildning eller framför kameran för att välja för den emitterande fluoroforen).
50:50 kub stråldelaren cett användas för att dela laserstrålarna i två separata excitation strålgångar och även att kombinera dem framför periskop.
Stråldelaren (sökväg emission): För snabb bildtagning utan behov av fysiska filterbyte, strålen utsläpps delas upp i en blå-skiftat och rödskiftade kanal. I princip kan stråldelare byggas genom användning av en dikroisk kil eller en uppsättning speglar och en dikroisk spegel för att separera strålen emission i ett våglängdsberoende sätt. Två emissionsfilter behövs för att rensa upp de utsända kanaler.
Rymdfilter: Fysisk filtrering av excitationsstrålen krävs ibland för att avlägsna icke-parallella ljusstrålar emitterade från låg kvalitet laserstrålar. En spatialt filter består av ett två-linsteleskop med ett litet hål placeras exakt vid fokalpunkten för båda linserna. På detta sätt oäkta ljus till följd av icke-parallella delar av laserstrålen blir effektivt blockerat. Such villkor måste uppfyllas vid fastställandet TIRF-baserad mikroskopi. Rymdfiltrering ökar med mindre porer, som är svårare att placera in i brännpunkten, och med mindre brännvidder på den första linsen. För att minska effekter orsakade av linsaberration är det fördelaktigt att använda i stället för enkla linser av hög kvalitet och oändlighet-korrigerade mål mikroskop med låg förstoring (10x eller 20x).
Periskop: ett periskop setup är nödvändigt att översätta den fokuserade laserstrålen i det bakre fokalplanet av målet, en förutsättning för TIRF avbildning. Det kan lätt byggas från två två-tums speglar, en translationssteget för justering av första spegel och ett inlägg för att positionera den andra spegeln för att reflektera den vidgade och fokuserade exciteringsstråle in i mikroskop (fig 5).
Kamera: Back-belysta Electron-Multiplying Charge Coupled Devices (EMCCD) används rutinmässigt förinspelning av enstaka molekyl signaler. Detta är på grund av deras höga kvantverkningsgrad (upp till 95%), hög upptagningshastighet (upp till 30 MHz) och jämförelsevis lågt brus. Nedkylning till -80 ° C minskar termiskt brus och stöds av ett antal annonser EMCCD kameror. En begränsning av EMCCD tekniken är att kameran brus ökar linjärt med både kameran förstärkningen och signalen tas. Detta är inte fallet med vetenskapliga CMOS (sCMOS) kameror, som är betydligt billigare och driva på grund av den speciella arkitektur sCMOS chip också mycket snabbare än EMCCD kameror. Men ett problem i samband med CMOS-tekniken är att bilden förvärvet fortfarande saknar en viss grad av en kvantitativ avläsning på en enda molekyl nivå, eftersom varje pixel har olika detektionskänslighet. I princip kan detta kompenseras genom bildelementet normalisering, men detta förfarande är inte på något sätt trivial 11. Detta är anledningen till att vi fortfarande tvekar att reberömma sCMOS kameror för enda molekyl mikroskopi, men med tanke på den snabba utvecklingen av denna teknik kan sCMOS kameror snart bli kameran val. Långsam scan CCD-kameror kameror undvika förstärkning relaterade buller och pixel varians alla tillsammans och stödja snabbaste förvärvs priser om de kan användas i en så kallad "kinetiska" -läge. I detta läge är hela kamerachip med undantag för ett område av intresse (ROI) är maskerad, vilket gör det möjligt att använda själva chippet som en lagringsenhet. Efter ROI exponeras för första gången, är de resulterande laddningar skiftas in i maskerade området av chipset pixellinjen för pixel linje, där bilden skyddas från ytterligare ljusexponering. När skiftningen av alla linjer i ROI i den maskerade regionen är avslutad (i sub-millisekund-området), är ROI sig redo för nästa exponering. Denna cykel upprepas tills alla pixellinjer CCD-chipet är laddade. Chipet är sedan läsa ut långsamt med markant reduced avläsning buller. Till exempel på en 1000 x 1300 pixel chip, kan 20 ROI med 50x50 pixel registreras i snabb följd. Eftersom bilderna kvar på chipet under en avsevärd tid innan den utläses, är det viktigt att säkerställa hög kvalitet maskering och att kyla kameran (t.ex. med flytande kväve) som ett sätt att minska överdriven termiskt brus. Vissa EMCCD kameror stöder också den kinetiska läget.
Programvara: Tidpunkt för lasrarna, fönsterluckor, AOMs och kamerans exponering liksom lämplig bildlagring är en integrerad del av en framgångsrik avbildning experiment. I princip många definierade operationer kan programmeras med tillgängliga mjukvarupaket som följer med kameran. Kommersiella mjukvarupaket stödja ett stort antal hårdvara kringutrustning, som kan genomföras med lite tekniska kunnande.
Pulsgenerator, Data Acquisition (DAQ) styrelse (med analoga och digitala utgångskanaler) och oscilloskop: En pulsgenerator är ettutmärkt val för att konvertera triggpulser till pulser med definierad tid och spänning. Detta sätt lasrar kan kontrolleras exakt för uteffekt och tids i millisekund till sub-millisekund sortiment. DAQ kort med analoga utgångar uppnå samma och är lätta att integrera i datorns moderkort via PCI-platser. Pulslängd, amplitud och frekvens verifieras med ett oscilloskop.
Inneslutning av hela excitationsstrålen väg: att undvika svängningar i exciteringsprofilen på grund av luft convections hela exciteringsstrålens väg ska bifogas från sin labbmiljö. Denna åtgärd är särskilt viktigt när de utför TIRF mikroskopi. Optiska komponenter också skyddas från damm och det mänskliga ögat från laserljusexponering. Inhägnader kan enkelt bygga från svart kartong, som kan köpas i konst leverans butiker.
För att bestämma rörligheten på SLB fluorescens återhämtning efter PhotobleacHing (FRAP) mätningar 12 utförs. För FRAP förekomsten av två exciterings strålgångar är lämpligt (se figur 3). Den första strålgången är utformad för att avbilda fluorescensen av dubbelskiktet. Detta kan göras i TIRF konfiguration och med låg ljusintensitet. Den andra strålens väg bör möjliggöra en kort men intensiv blekmedel puls och bör konfigureras i icke-TIRF-läge, så att den lämnar målet längs den optiska axeln. En rund öppning kan placeras i excitationsstrålen vägen (se figur 8) för att projicera en helt rund blekmedel Profilen med definierade kanter. För att avbilda denna öppning på objektplanet, skulle dess optimala läget vara i fokalplanet för linsen 3 (se figur 3). Men på grund av den långa brännvidd denna lins kan också genereras en öppning bild av tillräcklig kvalitet, när öppningen är placerad på något skiftade positioner.
Efter att ha utfört tHan imaging experiment rådata måste analyseras på lämpligt sätt. Flera steg-för-steg-protokoll erbjuds, som täcker justering av huvudinställningarna (t.ex. belysning makt och tid, TIRF vinkel), insamling och analys av data.
Protocol
1. Alstring och Funktionalisering av Planar SLBs
- Blandning av lipiderna
- För att komma fram till en 10% DGS NTA-Ni / 90% POPC lipidkomposition upplösa 45 mg POPC och 6,9 mg DGS NTA-Ni i kloroform i en 250 ml rundbottnad kolv. Håll volymen kloroform låg (bara flera ml) för att avdunsta det i nästa steg. För en 1% DGS NTA-Ni / 99% POPC lipidsammansättning använda 49,5 mg POPC och 0,69 mg DGS NTA-Ni.
- Avlägsna kloroform med användning av en rotationsindunstare långsamt - en ökning över omgivningstemperaturen är inte nödvändigt. Alternativt, blås bort inuti en kemisk huv i en ström av inert gas, såsom kväve eller argon. Samtidigt gör detta ständigt vända kolven för att medge lika avsättning av tork lipid på den nedre halvan av den rundbottnade kolven.
- När större delen av kloroformen avdunstas, fästa kolven till vakuum O / N för att avlägsna kloroform kvantitativt.
OBS: Detta steg är avgörande för att undvika kontamineringav proteiner och celler med giftiga kloroform i senare skeden och för att säkerställa lipidbilager fluiditet.
- Generering av små unilamellära vesiklar (SUV: s) från torkade lipiderna
OBS: Små unilamellära vesiklar (SUV) är mellan 20 nm och 100 nm i diameter och kan lätt produceras genom bad sonikering. Lipid extrudering, en alternativ metod, kan ge upphov till SUVs och, beroende på porstorleken hos filtret tillämpas för extrudering, även stora unilamellära vesiklar (LUV), som är 100 nm till 1000 nm i storlek. Men stadsjeepar är bäst lämpade för att bilda SLBs.- SUV genom bad ultraljudsbehandling (visas i videon):
- Avgasa PBS. Suspendera den torkade lipidblandningen med de 250 ml rundbottnad kolv i 10 ml avgasad PBS.
- Fyll kolven med inert gas, såsom kväve eller argon, stänga den med en propp och kolven med autoklav tejp.
- Placera den förseglade kolven i ett badsonikator och sonikera lipidsuspensionen ent 120-170 W tills det har blivit klart. Detta tar mellan 30 och 60 min.
- Övervaka utvecklingen av vesikelbildning Spectro-fotometriskt: följden att absorptionen av outspädd emulsion i jämförelse med PBS konstant på 234 nm (som en ungefärlig indikator för lipidkoncentrationen) Ännu skulle sjunka kraftigt vid 550 nm (på grund av minskad ljusspridning via större partiklar).
- För att pelletera tunga icke unilamellära vesikler, som stör bildandet av en sammanhängande SLB, pelle vesikeln suspensionen genom centrifugering, vid 150000 xg under 1 h vid 25 ° C och därefter under 8 timmar vid 288 tusen xg, 4 ° C.
- Filtrera supernatanten genom ett sprutfilter med en pordiameter av 0,2 | j, m.
- Mät OD vid 234 nm och 550 nm, för att övervaka tydligheten i vesikelberedning och mängden lipid vänster.
- Förvara vesiklarna vid 4 ° C under argon eller kväve. Du kan också använda vesikelsuspensionen för tvåskikts beredningi flera månader.
- SUV genom lipid-extrudering:
- I korthet, passera lipidsuspensionen flera gånger genom ett filter med en porstorlek av 0,1 | am. Oberoende av tillverkningsmetoden, centrifugera vesikelsuspensionen två gånger (1h, 150,000g, 25 ° C; därefter 8h, 4 ° C, 288 tusen g) för att pelletera icke-unilamellära vesiklar som är tyngre.
OBS: Vid förvaring vid 4 ° C under inert gas, kan vesiklarna användas för tvåskikts framställning i flera månader.
- I korthet, passera lipidsuspensionen flera gånger genom ett filter med en porstorlek av 0,1 | am. Oberoende av tillverkningsmetoden, centrifugera vesikelsuspensionen två gånger (1h, 150,000g, 25 ° C; därefter 8h, 4 ° C, 288 tusen g) för att pelletera icke-unilamellära vesiklar som är tyngre.
- SUV genom bad ultraljudsbehandling (visas i videon):
- Bildning av en SLB och laddning med protein
- Behandla 24 x 50 mm # 1.5 glasskivor med en 3: 1 blandning av koncentrerad svavelsyra och 30% väteperoxid under 30 minuter.
OBS: På grund av den aggressiva typen av blandningen ta särskild vård, det vill säga ha en labbrock och skyddsglasögon som visas i videon! - Skölj objektglas under en ström av DDH 2 O av en sprutflaska. Placera dem på en Teflon stå och låt dem torkaför 10 till 30 minuter.
- Ta bort botten glasskiva på 8 eller 16 och kammare, fyll botten med epoxilim och försiktigt placera en ren och torr glasskiva på limmet täckta kammarbotten. Låt limmet härda i ca 10 minuter. Ta bort överflödigt lim från botten.
OBS: En tätning mellan glasskivan och kammaren kan också lätt uppnås med användning av en dental tvåkomponents silikon modellering pasta, som härdar inom tio till 30 minuter. Denna tätning är inte lika fast som epoxilim men tål regelbunden fysisk ansträngning. Efter experimentet den lätt kan avlägsnas från kammaren, som sedan kan återanvändas i framtida experiment. - Pipettera 120 | il (60 pl) av en 10-faldigt PBS-utspätt lipidsuspension i varje brunn i en 8 (16) - väl kammare (framställd såsom beskrivits ovan) och låt tvåskiktsmembran form för 20 minuter. Skölj noga dubbelskiktet två gånger med 15 ml PBS. När dubbelskiktet har bildats, måste det alltid vara nedsänkt i buffert och aldrig utsättas för luft. Fyll varje brunn hela vägen med PBS, sedan ta bort 330μl (8 brunnar kammare) eller 165μl (16 brunnar kammare). Det finns 350μl (175μl) kvar i brunnen. Lägg 50 pl (25 pl) av cocktail innehållande His-märkta proteiner utspädda i PBS till varje brunn (400 eller 200 ^ slutlig) och inkubera vid rumstemperatur under 60 minuter i mörker. Ytproteinet densiteten kan justeras genom att variera proteinkoncentrationen under denna inkubationssteg.
- Skölj varje brunn två gånger med 15 ml PBS.
OBS: Normalt bör SLBs användas i experiment inte längre än 6 h efter deras laddning med protein. Under denna period förblir upp fluoroforen återhämtning efter fotoblekning till 95% och ingen förlust i tvåskiktsmembran-associerat protein kan detekteras. Proteintätheten bör bestämmas före försöket (se nedan). - Valfritt steg: För att testa för icke-specifik bindning av proteinet DGS NTA-Ni innehållande SLB, tvätta SLB gång med PBS innehållande 300 mM imidazol. Proffsettein ska lossna helt.
- Behandla 24 x 50 mm # 1.5 glasskivor med en 3: 1 blandning av koncentrerad svavelsyra och 30% väteperoxid under 30 minuter.
2. Mikroskop Setup
- För att bygga en mikroskopi system som kan detektera fluorescens av enstaka fluorokromer hänvisar till de rekommendationer som anges i inledningen.
3. Ström Mätningar
OBS: Fluoroforer kan lätt mättas med överskott excitation ljus. Detta accelererar fotoblekning utan ytterligare förstärkning av utsläppen och bör därför undvikas. För att optimera prov belysning excitation effekttäthet bör mätas direkt på provet. Sådana mätningar kan också fungera som en referens för framtida experiment. Dessutom vet förhållandet mellan ingångs- och utgångslasereffekt är till hjälp vid bedömningen där ljus går förlorat i avbildningssystemet.
- Flytta excitationsstrålen till upprätt position så att den lämnar målet i en 90 ° vinkel.
- Placera huvudet på energimätaren på topp of balken och mäta effekten hos strålen (= P). Dokumentera resultatet.
- Med hjälp av periskop vrida balken i TIRF position och image en intakt homogen fluorescerande dubbelskikt. För att undvika blekning och CCD-signalmättnad plats en neutral densitet (ND) -filter med en optisk densitet (OD) på två till tre in i exciteringsljusstrålen.
- Mät integrerade räknas i hela upplysta fältet (= jag totalt). Också mäta storleken på det belysta området (= Totalt). Mät integrerade räknas (= I Center) i maximalt upplysta mittpunkt samt storleken på platsen (= Ett centrum).
- Mät bakgrundssignalen per pixel (= B) antingen utanför det belysta området eller utan provbelysning.
- Subtrahera bakgrundssignalen från mätresultaten i 3). Gör detta genom att multiplicera antalet pixlar i det aktuella området (hela belysta området eller mittpunkt) med bakgrundenräkningar per bildpunkt. (= Jag totalt - Totalt .B och jag centrera - Ett centrum .B).
- Fördela integrerade och bakgrundskorrigerade signalen från mittpunkten av den integrerade och background-korrigerad signal för hela området belysning.
OBS: Resultatet visar andelen av den totala effekt som ligger i mittpunkten (= (I centrum - Ett centrum .B) / (I totalt - Totalt .B)). Multiplicering av detta resultat med effekt P mätt i 2.) resulterar i kraft av ljuset som belyser mittpunkten. - Bestäm storleken på den fläck A center i μm². För detta dela upp kameran pixelstorlek i fim med förstoringen av målet, ta kvadraten på resultatet som μm² per pixel.
- Alternativt mäter pixelstorleken i bilden med hjälp av en mikrometer bildspel placeras på mikroskop och ta kvadraten på resultatet som området per pixel. Multiplaiply detta värde med antalet bildpunkter som är belägna inom mittpunkten för att komma fram till den belysta fläcken området.
- Dela upp effekten P lysande mittpunkten av storleken av mitt fläck A centrum μm² att beräkna belysningsintensiteten per xm 2. Ett exempel ges i figur 6.
- Effektdensitetsvärden uppmätta i icke-TIRF belysning är vanligtvis lägre än de som är närvarande i TIRF belysning 13, som också är beroende av den exakta vinkel i vilken laserljuset reflekteras totalt. För att komma till effekttätheter närvarande enligt TIRF belysning, bild kalibreras fluorescerande pärlor av 0,1 pm diameter både i icke-TIRF och TIRF. Förhållandet mellan pärla fluorescens intensiteter mätt i TIRF och icke-TIRF läget uppgår till omräkningsfaktorn C, vilket möjliggör konvertering av uppmätta effekttäthet värden i de effektiv under TIRF belysning (ekvation 1).
effekttäthet TIRF = C • effekttäthet icke-TIRF (ekvation 1)
med C = pärla intensitet T IRF / pärla intensitet icke-TIRF
4. Densitetsmätningar
- Bestäm den genomsnittliga signalen enskilda fluoroforer ligger på ett dubbelskikt. Tvåskiktsmembran lösa MHC-molekyler laddade med fluorescerande peptider är idealiska för detta ändamål eftersom proteinet: etikett stökiometri är exakt ett. Om det är nödvändigt blekmedel alla etiketter på biskiktet i synfältet och låt fluorescens återhämta sig för att visualisera enstaka fluoroforer.
- Spela in bilder i snabb följd (t.ex. tillämpa en strömmande förvärvsprotokoll) och övervaka enstaka molekyler rörlighet över flera ramar. För mer information, se figur 7.
- Bestäm enda molekyl och bulk fluorescens endast inom denna ROI. Integrera signalen från en ROI, som är tillräckligt stor för att fånga 99% eller mer av den enda sändaren är punktspridningsfunktion. Vid användning av en kamera med en pixelstorlek på 16-20 pm (anges i tillverkarens kamera specifikationer), ett mål med 100 gångers förstoring och en numerisk öppning är lika med eller större än 1,45, ta en region av 7 av 7 pixlar med intensitetstopp som ligger i mitten av torget.
- För att bestämma bakgrundssignalen, integrera grevarna av en angränsande 7 av 7 pixel torg, som inte innehåller en fluorescenssignal. Subtrahera bakgrunden från enda molekyl signalen för att bestämma det korrigerade värdet för enda molekyl fluorescence. Välj bara signaler, som fortfarande är synliga i följande ram.
5. Testa integritet biskiktet
- Förbered en fluorescerande biskikt och placera den på mikroskop scenen som beskrivits ovan.
- Justera fokus och ta en bild av dubbelskiktet i TIRF läge. Applicera en kort men intensiv blekmedel puls i icke-TIRF läge för att avlägsna fluorescens inom ett litet skivformad ROI.
- Ta en bild av dubbelskiktet i låg intensitet TIRF läge omedelbart efter blekning och sedan varje fem till 10 sek för att övervaka hastigheten på fluorescens återhämtning.
- Move till ett annat område på dubbelskiktet och följ steg 2 och 3. Ta en annan bild i låg intensitet TIRF läge 5 min efter blekmedel pulsen. Bestämma intensiteten jag lägga blekmedel i blekningsområdet och jämför den med intensiteten före blekning jag 0 i början av experimentet (inget blekning skulle ha skett) för att beräkna den orörliga fraktionen (IF) enligt följande:
Orörliga fraktion IF (%) = (I 0 - jag lägger blekmedel) / (I 0 - bakgrund) x 100,
med bakgrund = uppmätt intensitet inom ROI utan excitation ljus tillämpas
IF bör vara mindre än 10% (helst mindre än 5%).
Representative Results
Arkitekturen i den enda molekyl fluorescensmikroskopi systemet beskrivs i detalj i figur 2. Enskilda delar såsom optiska komponenter och andra hårdvarukomponenter förklaras i inledningen. De optiska exciterings strålvägar, vilka ger upphov på ett definierat sätt till TIRF och icke-TIRF belysning, visas och förklaras i figurerna 3 till 5. Notera placeringen av 50:50 stråldelaren framför den första periskopet spegel placerad på en mikrometer översättas scen (Figur 5). Denna stråluppdelare lagrar TIRF stråle som används för avbildning (markeras med grönt) och den icke-TIRF balk (markerade med rött) som används för blekning eller lokal öppning definierad ljusmedierad prov aktivering (som beskrivs i figur 3). De kombinerade ljusbanor (Figur 5, som anges i orange) återspeglas via andra periskopet spegeln på baksidan porten på den inverterade microscope. Som förklaras i fig 4 och beskrivs i figur 2, vidgar genomförandet av två eller tre konvexa linser laserstrålen profilerna och fokuserar laserstrålarna på baksidan fokalplan målet att ge upphov till två kollimerade strålar belysa provet i TIRF och , respektive, i icke-TIRF.
Ett exempel på uppmätta intensitetsvärden som krävs för att beräkna effekttäthet på provet visas i figur 6. Den genomsnittliga bakgrundssignal som skall subtraheras från intensiteter som uppmätts i de upplysta och centralt område (används för avbildning), bestäms i en region inom synfält, som inte belyses av laserstrålen (här 7089 räknas). Bakgrundskorrigerade genomsnittliga intensiteten hos de upplysta (1684 räknar) och det centrala området (4830 räknas) multipliceras sedan med motsvarande storlekar regionen för att ge upphov till integrerade intensiteter (1.471x 10 8 räknas för det belysta området och 3.424 x 10 7 räknas för det centrala området). Förhållandet mellan de integrerade intensitet inom de centrala och belysta områden ger den del av den totala effekten lysande det centrala området (0,23 eller 23%). Som visas i filmen, har den totala effekten att bestämmas målet med hjälp av en kraftmätare i icke-TIRF belysning läge. I vårt exempel är det justerades till 5 mW, vilket ger upphov till en effekt på 5 mW x 0,23 = 1,15 mW inom det centrala området. Sedan 41,5 pixlar belopp i vårt exempel till 1 pm 2, har det centrala området en storlek på 7089 pixlar /41.5 pixlar x im 2 = 170,8 pm 2. Dividera kraften i ljuset belyser det centrala området (1,15 mW) med detta område (170,8 pm 2) ger en genomsnittlig effektdensitet av 0,7 kW / cm 2 inom det centrala området.
Figur 7 presenterar bilder och motsvarande intensitet resultaten av enskilda fluoroforer som förvärvats i snabb följd (100 bilder per sekund, det vill säga med en tidsram på 10 ms). För intensitets kvantifiering medelsignal av ett rektangulärt område av sju av sju (= 49) pixlar, vilket omfattar fluorescenssignalen, bestäms. Vidare medelsignal av bakgrunden bestäms inom ett rektangulärt område av sju av sju bildpunkter i närheten av den enda molekyl signalen. Bakgrunden-korrigerade medelvärdet signalen multipliceras med antalet bildelement inom regionen (= 49) för att ge upphov till enda molekyl signal (i fetstil).
Ett representativt FRAP experiment som syftar till att bedöma rörlighet SLB-associerade fluorescensmärkta proteiner visas i figur 8. Notera i figur 8A på repetitiv användning av ett vidgat låg intensitet avbildningsstråle och den enda användningen av en andra smalare och bländare definierade högintensitetsstråle för snabb fluorokrom ablation vid noll andra tidpunkten. Bakgrund korrigerad genomsnittliga intensiteter inom den gula cirkeln, som har normaliserats av den ursprungliga genomsnittliga intensitetsvärdet före blekmedel pulsen, är avsatta i figur 8B mot tiden för att registrera hastigheten och i vilken utsträckning fluorescens har återhämtat sig. Såsom visas, har mer än 90% (indikeras av den gröna linjen) av den initiala dubbelskiktet intensiteten återhämtade sig inom 75 sek efter fluorokrom ablation. Som en följd är mindre än 10% av proteinerna som är inbäddade i den visade SLB är orörliga.
Figur 1. Schematisk skiss av en SLB-system. (A) SLBs är tillverkade av POPC (90-99%) och den syntetiska lipiden DGS NTA-Ni (1-10%). De bildas spontant när rena glasytor debiteras med stadsjeepar som består av motsvarande lipider. (B) När bildas, dessa SLBs kan enkelt dekorerad med lösliga proteiner förlängda antingen med en C- eller N-terminal tag innehåller tolv histidiner (12H, för exempel co-stimulerande molekyler B7-1 och adhesionsmolekylen ICAM-1) eller protein dimerer utökas med två taggar som innehåller sex histidiner vardera (2x6H, till exempel en αβMHC klass II dimer). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Översikt över excitations- och emissions strålvägar. Gas jon lasrar (t.ex. Ar + eller Kr +) kan användas för snabb stängning med hjälp av akustisk optisk mo dulators. Laser dioder finns numera finns i många våglängder och utgör ett utmärkt alternativ eftersom de kan elektroniskt modul i mikrosekund-rage. Lägg märke till att laserstrålar kan justeras enkelt med två (dikroiska) speglar och split och kombineras med användning av enkla stråldelare för att ge upphov till två eller flera strålvägar. I detta exempel en TIRF avbildning balk (för att övervaka händelser) och blekmedel balk (antingen blekmedel eller fluoroforer foto aktivera bur molekyler i en öppning-definierat sätt) används. Båda excitation vägar kan användas oberoende av varandra med hjälp av ytterligare luckor. Periskopet kan för att översätta de fokuserade laserstrålarna i ryggen fokalplan målet att generera TIRF belysning av provet. Den fluorescerande bild kan spektralt dela med hjälp av en emissions stråldelare före förvärvet med hjälp av en ultrakänsliga kameran (t.ex. EM-CCD eller vetenskaplig CMOS-kamera)..com / filer / ftp_upload / 53158 / 53158fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3. Justera TIRF belysning genom att översätta den fokuserade strålen i det bakre fokalplanet av målet. Som visas i fokus för laserstrålen skiftas inom det bakre fokalplanet av målet från centrum till periferin genom translokation av strålen (med hjälp av ett periskop spegelarrangemang). Som ett resultat av en parallell stråle lämnar mål i en lutande belysning tills en kritisk vinkel nås vid vilken total inre reflektion händer. Det evanescenta fältet genereras vid glas media gränssnitt där total reflektion sker. Klicka här för att se en större version av denna fi gur.
Figur 4. Enkla optiska system för att fokusera laserstrålen i det bakre fokalplanet av målet. Antingen tre eller två linser behövs för att vidga laserstrålen och för att fokusera den på det bakre fokalplanet av TIRF målet. Två linssystem innehåller färre linsrelaterade fel än tre-linssystem och kan vara bättre lämpade för generering av TIRF avbildning trålen. Tre linser kan vara att föredra när siktar på avgränsad ljusbild breddning och en belysningspunkt med vassa kanter, som skulle behövas för studier som använder foto aktivering eller -bleaching. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
/53158fig5.jpg "/>
Figur 5. Annotated fotografi av strålgången på baksidan av fluorescensmikroskop. Såsom redan skisserats i fig 2 ett rörs enkelt genomföra två exciterings balkar, en i TIRF (anges i grönt) den andra i icke-TIRF-läge (indikeras i röd). Dessa blir överdras med användning av en 50:50 stråluppdelare (BS). Konvexa linser (L1 och L2) är placerade i de respektive strålarna för att fokusera dem på det bakre fokalplanet av målet (ej visat). En periskop bestående av två speglar (M1 och M2) styr de båda strålarna genom hamnen träder i mikroskopet. Den första spegeln (M1) kan förflyttas med användning av ett translationssteg (TS) (genom att vrida en mikrometerskruv såsom anges) för att flytta en av balkar till TIRF ståndpunkt. När TIRF har fastställts, kan den andra strålen (används för foto-blekning eller -activation, här markerade med rött) justeras oberoende av TIRF trålen att lämna målet i icke-TIRFläget. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Mätning av makten inom den centrala delen av belysningspunkten. Såsom indikeras valde lämpliga områden av intresse, som speglar bakgrund, hela belysta området (IA) och det centrala området (CA), där händelser senare kommer att spelas in. Subtrahera bakgrundsvärden från dem som registrerats för IA och CA och integrera intensiteten genom att multiplicera korrigerade genomsnittliga intensiteter med antalet bildpunkter som finns inom varje område (= integrerade intensiteter). Dividera den integrerade intensiteten av CA från den för lA för att komma fram till den andel av strålens effekt belysning av CA (i detta exempel: 23%). Bestäm effekten hos ljuset som belyser CA genom att multiplicera den totala stråleffekten (här: 5 mW) med den andel som belyser CA (här: 0,23). För att bestämma storleken på det centrala området multiplicera området (här: 7089 pixel) med en pixel-till-området storlek omräkningsfaktor (här: 1 / 41,5 pm 2 pixel -1). För att komma till den genomsnittliga effekttäthet excitationsljuset lysande CA, dela makten (här: 1,15 mW) av storleken på CA. (Här: 170,8 pm 2) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Kvantifiering av enstaka molekyl signaler. (A) Tidsförlopp för enskilda fluoroforer på en SLB. En 7 x 7 pixelstor region av intresse (ROI, gul) placeras runt signalen för kvantifiering. Bakgrund bestäms från en angränsande 7 x 7 bildpunkterroi (grön). (B) Kvantifierat genomsnittliga pixelintensiteter listas. För att bestämma enda molekyl signalen är bakgrundsvärden (grön ROI) subtraheras från signalvärden (gul ROI) och multipliceras med 49. (C) enda molekyl intensiteterna en fluorofor plottas mot tiden. Observera att 90 ms tidpunkt utelämnas som fluoroforen är i färd med att blekning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. Fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) analys för att bestämma integriteten hos SLB. (A) FRAP utfördes på ett dubbelskikt som bär IEK / MCC-Alexa Fluor 647. Varje 10:e bild av experimentet visas. (B) FRAP kvantifiering av det experiment som visas i (A). Värden anger genomsnittliga intensiteter (I) inom den gula ROI visas i (A) dividerat med den initiala intensiteten (I o) innan blekning. Red datapunkter visas i (A), den gröna linje markerar 0,9 återvinning av original intensiteter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Enda molekyl mikroskopi ger en unik möjlighet att studera beteendet hos proteiner i deras nativa cellulära miljö. Molecular imaging blir därför allt mer attraktivt för en bred forskarsamhället, men många liv forskarna fortfarande skygga den initiala investeringen i teknik och expertis. Den största fördelen till följd av montering en egen bildsystem är att det lätt kan anpassas till alla specifika behov.
Som föreslås häri en icke-TIRF excitationsstrålen kan enkelt implementeras förutom en befintlig TIRF ljusstrålen, om en snabb och definierade fotoblekning (eller -activation) av fluoroforer och ligander önskas, till exempel när du utför FRAP eller ligand uncaging experiment 14 . Införandet av en emissions stråldelare möjliggör samtidig inspelning av minst två och i vissa fall upp till fyra fluorescerande kanaler. Listan över tillägg är i huvudsak endast begränsas avens egen fantasi.
Till exempel, genomföra en motordriven emissionsfilterhjul i vägen utsläpps möjliggör snabb växling mellan upp till tio olika fluorescerande kanaler. När man kombinerar två motoriserade utsläpp filterhjul (alla är utrustade med 10 filterplatser) i serie, upp till 18 fluorescerande kanaler kan läsas ut. TIRF-baserad avbildning kan kompletteras med kalcium mobilisering mätningar och Interference Reflection Microscopy (IRM) efter integration av en Xenon eller Mercury excitation lampa väg. IRM är en lämplig metod för att visualisera vilken grad celler är fästa vid glasytan eller en SLB och kan därmed ge viktig information vid tolkningen TIRF-baserade bilddata. Att upprätta en vidgad exciteringsstråle med användning av en enkel dikroisk spegel och en ytterligare laser med 405 nm tillåter ledande fotoaktivering lokalisering mikroskopi (PALM) eller stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi (STORM), dvs två superresolution metoder med en positionsnoggrannhet under diffraktionsgränsen av synligt ljus 15,16.
Men är experimentell framgång inte bara en fråga om lämplig hårdvara. För att dra full nytta av buller reducerade TIRF-baserad avbildning, bör cellerna göra kontakt med en yta på ett sätt som inte införa begränsningar på cellytan eller som stör fysiologi deras plasmamembran. SLBs funktionaliserad med lämpliga proteiner för celladhesion överskrider väl lämpade för detta ändamål eftersom alla SLB-inbäddade ligander är lateralt mobil och justera deras sidoläge inuti dubbelskiktet som svar på receptorbindning och segregations dynamik.
För att tillverka SLBs på ett reproducerbart sätt, är det bäst att starta med SUVs med hög renhet. Såsom beskrivs häri, är det sålunda kritiskt att avlägsna multilamellära vesiklar, som också produceras under sonikering, i två ultracentrifugeringssteg som dessa interfere med bildandet av sammanhängande SLBs featuring hög fluiditet. SLBs av hög kvalitet utgör bara på rena glasytor. När rengöras glas bör användas omedelbart eller förvaras i vakuum. Allt måste SLBs aldrig utsättas för luft, eftersom detta skulle leda till att de störningar. SLB tvätt innebär, såsom visas, buffert sköljning med hjälp av en serologisk pipett, eftersom detta är inte bara rädda, men också tidsbesparande procedur.
Under skörd och rening av SLB-bosatta proteiner bör undvika att använda tvättmedel. Detta beror på att detergenten kommer att minska protein rörlighet avsevärt även då de är närvarande i spårmängder. För att kringgå behovet av rengöringsmedel tillsammans, är löslig uttryckning av utsöndrat polyhistidintagg utrustade ligander rekommenderas i däggdjurs- eller insektsceller. Om återveckning från E. coli inklusionskroppar krävs, måste försiktighet användas för att ta bort tvättmedel effektivt från inklusionskropparna innan de oför och återveckning.
En stor fördel med att använda SLBs resultat från deras modulära och reconstitutive natur, som gör det möjligt att specifikt dissekera rollen av en given receptor-ligand-interaktion för cellaktivering och celladhesion. I detta avseende är det viktigt att nämna att DGS NTA-Ni bör vara närvarande vid 10% inom SLB i syfte att förhindra proteiner konkurrerar om NTA-Ni-bindningsställen. Vid användning av SLBs hyser endast 1% eller 2% DGS NTA-Ni, en minskning i föreningen av en given polyhistidin-märkt proteinarter kan märkas, i synnerhet vid samtidig inkubation ökande mängder av en andra polyhistidin-märkta proteinarter (opublicerad observation). Detta fenomen observeras inte när man arbetar med SLBs presenterar 10% DGS NTA-Ni.
Samtidigt som vi aldrig har sett icke-specifik bindning av någon polyhistidin-märkta proteinet testas för att SLBs innehållande DGS NTA-Ni, bör denna möjlighet testas vid införandet av en protein för första gången,För detta ändamål rekommenderar vi användning av SLBs saknar DGS NTA-Ni (proteinet ska inte binda). För det andra, vid användning av en SLB innehållande DGS NTA-Ni bör proteinet lossna helt efter tvättning av SLB med PBS innehållande 300 mM imidazol.
En annan viktig fördel med att använda SLBs är att transienta interaktioner och signalering händelser kan övervakas med förbättrad Spatiotemporal upplösning 17-19. Detta är åtminstone delvis på grund av en tredimensionell bindande process i huvudsak reduceras till två avbildnings dimensioner, speciellt när du spelar in i buller försvagade TIRF läge. Användningen av SLBs är kompatibel med enda molekyl signaldetektering, en förutsättning för fotoaktiverad lokaliserings mikroskopi (PALM) eller stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi (STORM), dvs. Superresolution mikroskopi med en upplösning under diffraktionsgränsen 15,16. Dessa särskilda avbildningsmetoder gör det möjligt enda molekyl Förster Resonance Energy Transfer experiment utformade för att visualisera individuella protein-proteininteraktioner i en synaptisk miljö 20. Detta tillvägagångssätt förklaras i detalj i en JUPITER publikation kallas "Mätning TCR-pMHC bindning med hjälp av en FRET-baserad mikroskopi analys" 21.
Vid tolkning SLB-baserade experiment bör man alltid ha i åtanke att inte alla egenskaper hos ett plasmamembran av en levande cell presenteras av SLBs, och att en del av de saknade kvaliteterna kan påverka fysiologi under utredning. När allt kommer omkring, är SLB-inbäddade proteiner fritt spridande och inte organiserade i membranmikrodomäner som de flesta av deras cellulära motsvarigheter är 5,6,22. Immobiliserad plasma membranark härledda från vidhäftande celler, som bevarar den plasmamembran arkitekturen i levande celler i viss utsträckning, har framgångsrikt används för att studera upptagningen från membraninbäddade antigener genom B-lymfocyter 23. Men även sådanamembran inte interagera med en mycket dynamisk cytoskelettet och har ingen flexibilitet, eftersom de stöds av en stel glasytan. Med tanke på dessa skillnader finns det helt klart ett behov av engineering SLBs, som erbjuder medel för att compartmentalize proteiner i ett definierat sätt och som stöds av ytorna av justerbar flexibilitet eller genom ytor som ändrar sin styvhet som svar på lokalt tillämpade ljuspulser.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har någon konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
MA fick stöd av ett Schrödinger gemenskap i den österrikiska Science Fund (FWF, J3086-B11) och tackar Max-Planck-Society for ekonomiskt och administrativt stöd. GS stöddes av Wien Science and Technology Fund (WWTF, LS13-030). JH stöddes av Wien Science and Technology Fund (WWTF, LS14-031).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 glass slides | VWR | 631-0853 | |
| 250ml round bottom flask | VWR | 201-1357 | |
| 50:50 beam splitter cubes | Thorlabs | BS013 | |
| Acousto-opitcal modulator C1205-2 | Isomet | - | only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used |
| Alexa Fluor 488-NHS | Life technologies | A-20000 | |
| Alexa Fluor 555-NHS | Life technologies | A-20009 | |
| Alexa Fluor 647-NHS | Life technologies | A-20006 | |
| autoclave tape | VWR | 489-1312 | or any other heat-stable sticky tabe |
| Avanti Mini-Extruder | Avanti Lipids | 610000 | alternative to the bath sonicator |
| bath sonicator QSONICA Q700 | QSONICA | Q700 | |
| beam splitter | Cairn | P280/210/MLS | |
| Büchi rotary evaporator | VWR | 531-0837 | |
| camera | Andor | iXon Ultra 897 | see manuscript text for alternatives |
| concentarted hydrogenperoxide | Roth | 9683.1 | |
| concentrated sulfuric acid | Roth | X944.2 | |
| epoxy glue | Uhu | 45705 | Uhu plus sofortfest 2min |
| filter wheel | Sutter instruments | Lambda 10-2 | |
| LabTek chambers | VWR | 734-2062 | |
| laser | Toptica | - | different variants (wavelengths 375 - 785 nm) are available |
| lens | Thorlabs, Newport | - | |
| DGS NTA-Ni (lipid) | Avanti Lipids | 790404C | already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended |
| POPC (lipid) | Avanti Lipids | 850457C | already in Choroform-solved delivered version is recommended |
| microscope Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | - | |
| mirrors | Thorlabs | BB1-E02 | |
| optical filters | AHF, Chroma, Semrock | - | filter sets are available for many different combinations of dyes |
| oscilloscope | BK Precision | 2120C | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | degas before usage |
| periscope | Thorlabs | RS99/M | |
| picodent twinsil 22 | Picodent | 13001000 | alternative to the epoxy glue |
| power meter Lasermate-Q | Coherent | - | any powermeter sensitive in the used spectral range will do |
| pulse generator | Stanford Research Systems | SRS DG535 | |
| spatial filter | Thorlabs | KT310/M | |
| syringe filter 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
| TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46 | Zeiss | 440782-9800-000 | |
| trichloromethane/chloroform | Roth | 3313.1 | |
| tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm | Thermo Fisher | 45237 | |
| Sorvall ultracentrifuge | Thermo Fisher | RC M150GX | |
| ultracentrifuge rotor | Thermo Fisher | S120-AT2 | |
| UV spectrophotometer Nanodrop 2000c | Thermo Fisher | - | |
| vacuum pump | VWR | 181-0248 |
References
- Walter, N. G., Huang, C. Y., Manzo, A. J., Sobhy, M. A. Do-it-yourself guide: how to use the modern single-molecule toolkit. Nat Methods. 5, 475-489 (2008).
- Sahl, S. J., Moerner, W. E. Super-resolution fluorescence imaging with single molecules. Current opinion in structural biology. 23, 778-787 (2013).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster. Immunity. 25, 117-127 (2006).
- Kaizuka, Y., Douglass, A. D., Varma, R., Dustin, M. L., Vale, R. D. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci U.S.A.. 104, 20296-20301 (2007).
- Wilson, B. S., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Gaudet, E. A., Oliver, J. M. High resolution mapping of mast cell membranes reveals primary and secondary domains of Fc(epsilon)RI and LAT. The Journal of cell biology. 154, 645-658 (2001).
- Lillemeier, B. F. TCR and Lat are expressed on separate protein islands on T cell membranes and concatenate during activation. Nat Immunol. 11, 90-96 (2010).
- Woof, J. M., Burton, D. R. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nature reviews. Immunology. 4, 89-99 (2004).
- Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of cell biology. 89, 141-145 (1981).
- Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in cell biology. 89, 169-221 (2008).
- Wieser, S., Moertelmaier, M., Fuertbauer, E., Stockinger, H., Schutz, G. J. (Un)confined diffusion of CD59 in the plasma membrane determined by high-resolution single molecule microscopy. Biophys J. 92, 3719-3728 (2007).
- Huang, F. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
- Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys J. 16, 1055-1069 (1976).
- Axelrod, D., Burghardt, T. P., Thompson, N. L.
- Huse, M., Quann, E. J., Shouts Davis, M. M. Whispers and the kiss of death: directional secretion in T cells. Nat Immunol. 9, 1105-1111 (2008).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Bunnell, S. C. T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies. J Cell Biol. 158, 1263-1275 (2002).
- Sherman, E. Functional nanoscale organization of signaling molecules downstream of the T cell antigen receptor. Immunity. 35, 705-720 (2011).
- Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463, 963-967 (2010).
- Axmann, M., Schuetz, G. J., Huppa, J. B. Measuring TCR-pMHC binding using a FRET-based microscopy assay. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Lillemeier, B. F., Schuetz, G. J., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Wilson, B. S., Davis, M. M. Plasma membrane-associated proteins are clustered into islands attached to the cytoskeleton. Proc Natl Acad Sci U.S.A.. 103, 18992-18997 (2006).
- Natkanski, E., et al. B cells use mechanical energy to discriminate antigen affinities. Science. 340, 1587-1590 (2013).
