Summary
والهدف من هذا الفيديو هو إظهار كيفية تنفيذ استخراج الحمض النووي الآلي من (FFPE) إشارة خطوط الخلايا الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين القياسية وقطرة الرقمية PCR (ddPCR) تحليل للكشف عن الطفرات النادرة في عملية إعداد سريرية. الكشف عن الطفرات في عينات FFPE يوضح فائدة سريرية من ddPCR في عينات FFPE.
Introduction
تراكم الطفرات الوراثية في الجينات التنظيمية الرئيسية يغير برمجة الخلية الطبيعية مثل تكاثر الخلايا، والتمايز، والبقاء على قيد الحياة، مما يؤدي إلى السرطان 1. كيناز مسار RAS-RAF-MAP يتوسط الاستجابات الخلوية إلى إشارات النمو. يمكن أن الطفرات أنكجنيك BRAF تنجم عن طفرات في الجين سائق BRAF، والتي قد تتسبب في BRAF oncoprotein لتصبح مفرط 2. الطفرات في جين BRAF يؤدي أيضا إلى إشارات المصب فرط نشاط عن طريق منظمة مجاهدي خلق وERK 3، الذي، بدوره، يؤدي إلى نمو الخلايا المفرط والانتشار بشكل مستقل عن النمو بوساطة عامل التنظيم 4-6.
تتوفر لالتنميط تحور الحمض النووي، مثل الكمية في الوقت الحقيقي الطفرات BRAF V600E في، (FFPE) إشارة خطوط الخلايا الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين القياسية التي ddPCR العديد من الأدوات. ddPCR هو الأسلوب القائم على PCR لتقدير المطلقتقدم دقة أعلى بالمقارنة مع التقليدية الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QPCR) 7،8. يوفر ddPCR أيضا أعلى حل السلطة ودقة للكشف عن الطفرات النادرة في قوالب DNA، مما أبحاث السرطان أكثر إفادة والتشخيص 9. وتشمل مزايا إضافية من ddPCR على QPCR التقليدية حساسيتها تعزيز والدقة عند دراسة الأرقام نسخة قالب منخفض 10-12. هنا، يتجلى بروتوكول لاستخراج الحمض النووي من الخطوط المرجعية FFPE الخلية القياسية، تليها تحديد وجود أو عدم وجود الطفرات BRAF V600E التي كتبها ddPCR تلقائيا. وكما وصفت استخدام البرمجيات لتحليل البيانات وتمثيل رسومي للنتائج. الإجراء بأكمله هو بسيط نسبيا وتماما يعتمد على عدد من العينات المراد محة وعدد PCR وddPCR الآلات التقليدية المتاحة.
يصف بروتوكول فقا للإجراءات العادية لBR إشارة FFPE خطوط الخلايا القياسية AF V600E إيجابية (HD598، HD593، HD617، HD273 وwildtype (WT)) يتم تنفيذ في صك مؤتمتة بالكامل باستخدام بروتوكول الأنسجة نظام إعداد (TPS). وفي وقت لاحق، ويتم تحليل عينات من الحمض النووي معزولة عن وجود طفرات BRAF V600E باستخدام نظام ddPCR. يتم إجراء تحليل الطفرة المستهدفة بعد أن تم محة عن العينات وتم تحميل البيانات إلى برنامج تحليل البيانات. اعتمادا على عدد العينات / درس المجموعات، وتحليل البيانات قد تتطلب من واحد إلى عدة ساعات. العنصر التجريبي للمنهجية تتطلب دقة في التعامل مع DNA وrological الماصات وPipettors، شريط فيديو إن الرب علوم التربية شرح المزيد عن عن سياق pipetting ل"> pipetting لفي 96 لوحات جيدة، في حين أن تحليل البيانات تتم باستخدام البرمجيات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. استخراج الحمض النووي من خطوط الخلايا FFPE المعيار المرجعي
ملاحظة: للحصول على هذا الإجراء، تم إجراء استخراج الحمض النووي من الخطوط المرجعية FFPE الخلية القياسية (HD598، HD593، HD617، HD273 وwildtype (WT)) باستخدام FFPE DNA الأنسجة العزلة عدة كما هو موضح في البروتوكول أدناه. وقد تحقق استخراج الحمض النووي الآلي باتباع إرشادات الشركة المصنعة لمجموع عزل الحمض النووي.
- باستخدام مشراح وكتلة FFPE الأصلي، وإعداد يدويا أقسام جديدة قبل استخراج الحمض النووي وتحليل، وفقا للإجراءات المعمول بها. تأكد من أن عينة مدخلا للقسم الأنسجة (ق) تحليل لا يتجاوز سمك مجموعه 10 ميكرون وأن مساحة لا تتجاوز 600 مم 2 للمقطع واحد.
1.2 بروتوكول TPS
ملاحظة: وحدات التخزين هو مبين في الجدول رقم 1 تتوافق مع الحد الأدنى اللازم لتجهيز 48 العينات، وإجراءالمعروضة في فقا للمبادئ التوجيهية TPS. قبل بدء التجربة يستقر العينات FFPE في أنبوب الإلكترونية عن طريق الطرد المركزي في 600 x ج، لتجنب فقدان العينات خلال برنامج الآلية.
- بدوره على صك عزل الحمض النووي الآلي والكمبيوتر. فتح برنامج حاسوبي لمراقبة تشغيل وإدراج صينية حمولة السيارات في منطقة سطح التحميل TPS.
- الاستغناء الكواشف إلى أحواض يناظرها كما هو مبين في الشكل 1.
- ضع 4 عينات (BRAF WT، BRAF V600E 50٪ و 5٪ و 1٪) في رفوف الناقل العينة.
- وضع صناديق طرف في أحواض في الأعمدة 2 و 3 والتحقق من النصائح لوجود أكثر من مرشح واحد لكل طرف، والتي سيتم إحباط المدى.
- ضمان خلط الصحيح للتحلل العازلة وغسل العازلة التي كتبها قلب لهم 3-5 مرات، وتحميلها في أحواض ذات الصلة في العمود 4 (الشكل 1).
- بعد قلب لعدة مرات أو vort خفيفةexing، تحميل شطف العازلة، حبات مغناطيسية، وعازلة FFPE في أحواض صغيرة في العمود 5، وترك 1 فتحة فارغة حيث أشار (الشكل 1، الجدول 1).
- تحميل 2 مل لوحة الآبار العميقة (برنامج عمل الدوحة) على الناقل لوحة (الشكل 1).
- تنفيذ الخطوات النهائية التالية قبل البدء في المدى:
- إرفع قبعة جميع الأنابيب وأحواض كاشف. التأكد من أن قدرة كافية متاحة في زجاجة النفايات السائلة. تأكد من أن زجاجة النفايات الصلبة فارغة واصطف مع حقيبة واقية. تأكد من أن لوحة طرف إخراج تتركز في تجميع النفايات.
- إغلاق الغطاء الأمامي.
- بدء البرنامج. فتح ملف NA_Prep_Main_MLSTARlet.med.
- انقر على زر "ابدأ". وحالة أداة التحول من الخمول إلى تشغيل.
- أدخل عدد من العينات لهذا المدى. اختر الطريقة المطلوبة لهذا المدى (DNA = 0). أدخل موقف الأول المجلد عاليةأوميا طرف، واختيار "1" إذا كان كل صواني مليئة. أدخل موقف المجلد الأول غيض القياسية، واختيار "1" إذا كان كل صواني مليئة.
ملاحظة: والصك ثم تشغيل من خلال خطوات الآلي دون تدخل المستخدم. ويرد سير العمل التفصيلي في الشكل 2. بمجرد الانتهاء من التجربة، يتم حقن النفايات كاشف ونصائح في تجميع النفايات. - تحديد الحمض النووي الجيني النقي باستخدام طريقة فلوروميتريك.
تخضع عينات من الحمض النووي التي تحتوي على الحد الأدنى من تركيز 3.3 نانوغرام / ميكرولتر لتحليل ddPCR (القسم 2): مذكرة.
2. DNA الطفرة التنميط: بروتوكول ddPCR
ملاحظة: بروتوكول لتحديد ملامح الطفرة DNA يتكون من 3 خطوات رئيسية: 1) الجيل الحبرية، 2) التضخيم PCR التقليدية، 3) القطرة القراءة و4) التنميط تحور الحمض النووي.
2.1. الجيل القطيرات
ملاحظة: ddPCR supermix هوأوصت لddPCR، وهذا المزيج يحتوي على الكواشف اللازمة لتوليد الحبرية.
- لتجنب التلوث، اتبع الاحتياطات القياسية، مثل ارتداء قفازات، وذلك باستخدام PCR غطاء محرك السيارة نظيفة، pipets نظيفة، وأنابيب الربط منخفض البروتين.
- تأمين حد أدنى للتركيز عينة DNA الجينومية الإنسان هو 3.3 نانوغرام / ميكرولتر. ملاحظة: مقدار تنقية DNA تركيز العينة سوف تختلف استنادا إلى تحليل٪ طفرة الكشف عن التردد.
- تجميع مخاليط رد فعل في لوحات PCR 96-جيدا. ذوبان الجليد وتتوازن المكونات رد فعل على RT. إعداد ردود الفعل PCR من خلال الجمع بين 2X ddPCR supermix (10 ميكرولتر) و 20 الاشعال (إلى الأمام وعكس، 900 نانومتر) والتحقيق (250 نيوتن متر) مع كل عينة DNA النقاء (66ng / 2 ميكرولتر) أن تصل إلى 20 ميكرولتر مع الماء المقطر (كما في بروتوكول مولد قطرة)
- دوامة المزيج جيدا لضمان تجانس لفترة وجيزة الطرد المركزي لجمع محتويات في الجزء السفلي من الأنبوب قبل صرفها. تحميل 20 & #181؛ ل على خرطوشة لتشكيل الحبرية.
- تشغيل مولد الحبرية، في بروتوكول الموصى بها من المصنع
- أدخل الخرطوشة في حامل مع الشق في خرطوشة وضعه على الجانب الأيسر العلوي من حامل. إضافة 20 ميكرولتر من مزيج رد فعل تحتوي على عينات في الوسط و 70 ميكرولتر من النفط مولد في الآبار أسفل.
- إرفاق طوقا عبر الجزء العلوي من الخرطوشة. تأكد من أن طوقا هو مدمن مخدرات آمن على طرفي حامل. خلاف ذلك، لن يتحقق ما يكفي من الضغط لتوليد الحبرية.
- فتح مولد قطرات عن طريق الضغط على الزر الأخضر على الجزء العلوي من الجهاز وأدخل خرطوشة. عندما حامل في الموضع الصحيح، فإن كلا من السلطة (من اليسار إلى اليمين) وصاحب (يمين الوسط) أضواء مؤشر هي الخضراء.
- اضغط على الزر العلوي على الصك مرة أخرى لإغلاق الباب والشروع في الجيل الحبرية. ملاحظة: بعد الضغط على بutton، مواقف متعددة نفسه على الآبار مخرج، رسم النفط وعينات من خلال القنوات ميكروفلويديك، حيث يتم إنشاء قطرات. تدفق قطرات في قطرة جيدا، حيث تتراكم. وعلى ضوء مؤشر الحبرية (الى اليمين) ومضات الأخضر بعد 10 ثانية تشير إلى أن الجيل القطيرات في التقدم.
- عندما الجيل الحبرية كاملة، تغير كل أضواء مؤشر 3 إلى صلب الأخضر. فتح الباب عن طريق الضغط على زر، وإزالة حامل من وحدة. إزالة طوقا المتاح من صاحب وتخلص منه. ملاحظة: هذه الآبار العليا للخرطوشة تحتوي على قطرات، والآبار الوسطى والدنيا فارغة تقريبا، مع كمية صغيرة من النفط المتبقي.
2.2. استعدادا لPCR
- لكل عينة، الماصة من 40 ميكرولتر من محتويات قطرة من أعلى بكثير من خراطيش في بئر واحد من الموصى به لوحة 96-جيدا PCR كما هو مبين في بروتوكول أداة الشركة المصنعة. لاالشركة المصرية للاتصالات: استخدام ماصة متعدد القنوات مثالية لنقل المستحلبات قطرات. يوصى الطموح بطيئة ورقيقة من قطرات للحد من القص قطرة أثناء النقل.
- ختم لوحة PCR مع احباط مباشرة بعد نقل قطرات لتجنب التبخر. استخدام pierceable الأختام لوحة احباط التي تتوافق مع لوحة PCR سداده والإبر في القارئ الحبرية. اتبع الإرشادات في PCR لوحة دليل التعليمات سداده.
- ضبط درجة الحرارة لوحة سداده إلى 180 درجة مئوية، والوقت ل5 ثانية.
- المس السهم لفتح باب الدرج. وضع كتلة الدعم على صينية مع الجانب 96-جيدا مواجهة. وضع لوحة 96-جيدا على كتلة الدعم والتأكد من أن جميع الآبار لوحة تتماشى مع كتلة الدعم.
- تغطية لوحة 96-جيدا مع 1 ورقة من pierceable ختم احباط. مرة واحدة يتم تأمين لوحة 96-جيدا على الكتلة دعم ومغطاة ختم احباط pierceable، المس الزر الختم. سوف علبة إغلاقوختم الحرارة سيبدأ.
- عندما الحرارة الختم كاملة، يفتح الباب تلقائيا؛ إزالة لوحة من كتلة الحرارة لركوب الدراجات الحرارية ومن ثم إزالة كتلة الحرارة.
- التأكد من أن جميع الآبار في لوحة ومختومة من قبل التحقق من أن المنخفضات في احباط واضحة للعيان على كل بئر. مرة واحدة مختومة، لوحة مستعدة لركوب الدراجات الحرارية.
- حالما تتم إزالة قطرات، اضغط على المزالج على حامل خرطوشة لفتحه. إزالة خرطوشة فارغة وتخلص منه.
- أداء التقليدي PCR التضخيم باتباع المعايير المفصلة في الجدول 2.
2.3 القراءة الحبرية (حسب بروتوكول الموصى بها من المصنع)
ملاحظة: بعد PCR التضخيم من الهدف الحمض النووي في قطرات، وأداة قارئ قطرة يحلل كل قطرة فردي باستخدام نظام كشف 2 لون 13. وضعناها عادة للكشف عن FAM لد VIC fluorophores المراسل.
- انقر على "نظام تدفق" لرئيس القارئ قطرة وجعلها جاهزة للتحليل ddPCR.
- تحميل لوحة في القارئ قطرة وانقر على زر "البدء". القارئ قطرة شفاطات كل عينة، singulates قطرات، وتيارات لهم في ملف واحد الماضي كاشف 2-اللون. كاشف يقرأ قطرات تعداد العينات الإيجابية والسلبية.
- عندما القراءة الحبرية كاملة، وفتح الباب وإزالة حامل لوحة من الوحدة. إزالة 96-جيدا PCR لوحة من صاحب وتخلص منه.
- للصيانة المناسبة، تحل محل النفط القارئ قطرة وتفريغ وعاء النفايات حسب الحاجة. إضافة 50 مل من المبيض بنسبة 10٪ إلى زجاجة النفايات لمنع نمو الجراثيم.
2.4 DNA الطفرة التنميط (حسب بروتوكول الموصى بها من المصنع)
ملاحظة: يتم حساب قطرات PCR إيجابية وسلبية PCR لتوفير quantific المطلقأوجه الهدف الطفرات BRAF V600E DNA في شكل رقمي، وذلك باستخدام برمجيات تحليل البيانات.
- انقر فوق إعداد لإدخال المعلومات حول العينات، المقايسات، والتجارب.
- في إطار الإعداد تحميل لوحة (filename.qlp)، ثم انقر فوق تحليل لفتح وتحليل البيانات. يتم فصل واجهة تحليل البيانات إلى ثلاث نوافذ: جدول النتائج، حسنا محدد ومعالجة البيانات / الرسومية العرض.
- في إطار البيانات المعالجة، تظهر البيانات تركيز لكل هدف في الآبار في الخريطة وحة والواردة فى الجدول في جدول النتائج. انقر تركيز لتصور البيانات في مؤامرات التركيز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتحليل ddPCR لدينا، درسنا BRAF V600E إشارة طفرة FFPE خطوط الخلايا القياسية. القارئ قطرة يتصل برنامج كمبيوتر محمول تحليل بيانات الكمبيوتر على التوالي. ويعرف كل قطرة الفردية على أساس السعة الفلورسنت على أنها إما إيجابية أو سلبية. البرامج المقدمة من قبل الشركة المصنعة يسمح أيضا قطع المعرفة من قبل المستخدم إدخالها إلى تحديد عتبة بين قطرات الإيجابية والسلبية. يتم استخدام عدد من قطرات الإيجابية والسلبية في عينة لحساب تركيز الهدف من حيث النسخ / ميكرولتر.
تم الكشف عن مضان ومعالجتها لتصبح مبعثر ثنائي الأبعاد العرض المؤامرة، تم استخدام البرامج المخصصة لرسم بوابات المناسبة لكل مجموعة نقطة النهاية قطرة، وكان يحسب عدد قطرات في كل باب. كما هو مبين في الشكل 3A، قطيرات ممثلة النقاط الزرقاء (FAM مضان إشارة) فوق خط قطع لجميع sampl الدراسيكانت العناوين (الخط الوردي) إيجابية للتحور V600E BRAF. قطرات ممثلة النقاط الزرقاء في BRAF WT (NTC، لين 2) يمكن أن تكون العينة يرجع إلى إشارة غير محددة (إيجابية كاذبة). وتم تطبيع اشارات ايجابية كاذبة (BRAF WT) مع عينات طفرة أخرى. كما هو مبين في الشكل 3B، يتم تمثيل قطرات WT BRAF التي كتبها النقاط الخضراء (VIC إشارة مضان). في كل المؤامرات، وتعتبر النقاط الرمادية في الجزء السفلي كخلفية مضان. حسبت الترددات أليل متحولة الشاملة باستخدام البيانات هو مبين في الشكل 3C، على أساس النسب المئوية النسبية للWT BRAF والقوالب BRAF V600E الكشف عنها. النتائج ddPCR حصلت تحتوي على التهم الحدث قطرة وتحسب من النوع البري وجزيء DNA متحولة التهم لV600E BRAF (50٪، 10٪، 5٪، 1٪، 0.5٪، 0.1٪ و 0.05٪) عينة محسوبة باستخدام أدناه الصيغة المذكورة أعلاه.
٪ من المسخ التردد = (المسخنسخ / (Wildtype + نسخة متحولة)) × 100
وبناء على ذلك، تم تحديد الطفرات BRAF V600E والتحقق منها مع المعيار المرجعي (BRAF WT). واستخدمت تعريف BRAF طفرة V600E الترددات أليلية من 50٪، 10٪، 5٪، 1٪، 0.5٪، 0.1٪ و 0.05٪ لاختبار الحساسية واستنساخ للنظام ddPCR. من تحليلنا مع تركيزات عينة معروفة، أكدنا أن ddPCR غير قادرة على كشف ما يصل الى 0.05٪ من BRAF V600E الطفرة. كشف كاذبة عدد متحولة إيجابي في المجلس الوطني الانتقالي أو WT ربما قد يكون بسبب التحلل التحقيق غير محددة كما ذكرت في وقت سابق 14. وقد اعتبر الكشف عن أكثر من نسختين في عينة بأنها إيجابية في ورم الأنسجة 15.
الشكل 1. تمثيل تخطيطي واصفا كاشف وتحميل عينة استعدادا لAUT omated أداة استخراج الحمض النووي ضع العينات في رفوف الناقل والاستغناء الكواشف إلى أحواض المقابلة على النحو المذكور. توظيف الآلي بروتوكول TPS التي تدعم أنواع العينة متعددة، يسلم دقيقة، ونتائج يمكن الاعتماد عليها مع أقصى قدر من الإنتاجية. إعادة طبع بإذن من سيمنز للعناية الصحية التشخيص. (من باب المجاملة سيمنز للعناية الصحية التشخيص).
الشكل 2. تمثيل تخطيطي من الأنسجة إعداد نظام سير العمل لاستخراج الحمض النووي الآلي. إجراء العزل DNA مؤتمتة بالكامل لFFPE الأنسجة أقسام بما في ذلك الخطوات السلبية مختارة من البارافين، وإزالة الحطام الأنسجة وخطوات اختيار إيجابية ملزمة وشطف ترد. إعادة طبع بإذن من سيمنز للعناية الصحية التشخيص. (من باب المجاملة سيمنز للعناية الصحية التشخيص).
الرقم 3. استخدام نظام ddPCR لتقدير دقيق لBRAF V600E طفرة في عينات خط الخلية القياسية المرجعية FFPE. (A، B) تصور سعة مضان إيجابية في مؤامرات 1D (1dot -1droplet). النقاط الزرقاء (A، FAM إيجابي) تمثل BRAF-V600E إيجابي قطرات متحولة، في حين النقاط الخضراء (B، VIC إيجابي) تمثل WT BRAF قطرات -positive. هذا التصميم يمكن دقيق الكمي طفرة في خطوط الخلايا القياسية المرجعية FFPE. خط وردي هو عتبة التمييز بين الإشارات الإيجابية والسلبية للقطرات. (C) وتظهر المؤامرة وفرة كسور علامات زرقاء التي تشير إلى تركيز (نسخ / ميكرولتر) من BRAF V600E الطفرة، وعلامات خضراء تشير إلى تركيز (نسخ / ميكرولتر) من BRAF (WT). جميع الحانات الخطأ التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج تحليل البيانات تمثل فاصل الثقة 95٪.
| الكواشف | الحجم (مل) |
| تحلل العازلة | 106 مل |
| غسل العازلة 1 | 101 مل |
| غسل العازلة 2 | 72 مل |
| غسل العازلة 3 | 106 مل |
| شطف العازلة | 19 مل |
| حبات مغناطيسية | 8 مل |
| عازلة FFPE | 15 مل |
| بروتين K | 3.3 مل |
الجدول 1. مجموع حجم الكواشف (TPS عدة) المطلوبة لاستخراج الحمض النووي مع 48 عينات.
| درجة الحرارة | وقت | # دورات | |
| تنشيط انزيم | 95 درجة مئوية | 10 دقيقة | 1 |
| تمسخ | 94 درجة مئوية | 30 ثانية | 40 |
| الصلب / تمديد | 60 درجة مئوية | 1 دقيقة * | |
| عقد | 98 ° C | 10 دقيقة | 1 |
| عقد | 4 ° C | إلى الأبد | 1 |
| * ضبط إعدادات معدل الطريق المنحدر إلى 2-2،5 ° C / ثانية. استخدام غطاء ساخنة لتعيين 105 ° C وتعيين حجم العينة إلى 40 ميكرولتر | |||
الجدول 2. PCR التقليدية الظروف الحراري thermocycling
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، نسلط الضوء على تطبيق ddPCR وعزل الحمض النووي من الإشارة FFPE القياسية عينات خط الخلية لتقييم محدد تحور الجين. في هذه الدراسة، تم استخدام TPS الآلي DNA طريقة العزلة التي يمكن تكييفها بسهولة، الآلي، ويمكن أن تستوعب ما يصل إلى 48 عينات مختلفة في وقت واحد، مما يتيح للتجارب على نطاق أوسع وتقلب أقل. واحدة من القيود المفروضة على عزل الحمض النووي في العمل الحالي هو أن كل عينة FFPE هي فريدة من نوعها، وسوف تختلف بعضها البعض في الملوثات السطحية، الفلورا الميكروبية، و / أو الخلفيات الوراثية البشرية. بشكل عام، ونوعية الحمض النووي المستخرج والكمية ونجاح كله تضخيم الحمض النووي الجيني تعتمد على معايير مختلفة قبل وأثناء وبعد الاستخراج. وتشمل هذه ونوع وكمية من الأنسجة، ونوع من تثبيتي تستخدم لحفظ الأنسجة، ومدة التثبيت، عمر كتلة البارافين وظروف التخزين، فضلا عن طول الجزء DNA المراد تحليلها <سوب> 16. إزالة البارافين من الأنسجة هي الخطوة الأكثر أهمية لاستخراج ناجحة كما يؤدي البارافين غير منحل إلى سوء نوعية العينة. خلال جيل القطيرات، يجب توخي الحذر لمنع تشكيل فقاعة - وهذا هو خطوة حاسمة أخرى للكشف عن الطفرات ناجحة. النظر في عينة لعينة الاختلاف التي قد تنشأ بين السكان عينة، واستنادا إلى الدافع وراء التجربة، قد تكون هناك حاجة بعض التعديلات في الإجراء للحصول على النتيجة المرجوة.
ميزة أخرى هي أن عزل الحمض النووي وتجري ddPCR باستخدام النظم الآلية في هذا البروتوكول، وبالتالي هناك خطأ ضئيل وتدخل المستخدم المطلوب هو الحد الأدنى للغاية. عزل كامل الجينوم تضخيم DNA من جزءا لا يتجزأ من البارافين أنسجة / خاليا تم الحصول عليها عن طريق استخدام نظام TPS. واحدة من عيوب في استخدام النظام الآلي عزل الحمض النووي غير ذلك، فإنه ليست فعالة من حيث التكلفة لاستخدام عدد قليل من العينات. بدلا من هذا الظريف الآليويمكن أيضا أن يؤديها ص، وغيرها من الإجراءات المعتمدة عزل الحمض النووي لعينات محدودة
ذكرت دراسة حديثة أن استخدام قطرة PCR الرقمي (ddPCR) غير قادرة على تحديد عدد النسخ النسبي للمواضع الجيني محددة حتى في وجود من الأنسجة الطبيعية المختلطة التي تم الحصول عليها من الأنسجة FFPE. باستخدام سلسلة التخفيف السيطرة، Nadauld، L. آخرون تحديد حدود الكشف (اللد) لفحص ddPCR وذكرت تحسين حساسية على كميات ضئيلة من الحمض النووي مقارنة مع المعايير الوقت الحقيقي PCR 17. هنا، يتم استخدام خطوط الخلايا القياسية المرجعية FFPE لإثبات القدرة على الكشف عن الطفرات النظام ddPCR. أشارت النتائج إلى نظام ddPCR إمكانية كشف نادرة ترددات طفرة أليلية وصولا الى 0.05٪ الطفرة. بشكل جماعي، وهذه البيانات تشير إلى أن نظام ddPCR يمكن أيضا تحليل كمي لنسب مختلفة الأليلات الطافرة والاختلافات النسبية في متخالف عينة الورم السريريةالصورة. ويمكن تحليل عدد كبير من العينات FFPE لطفرات جينية معينة في وقت واحد وهذا هو أسلوب الأمثل للسكان الدراسات الجينية واسعة.
وأخيرا، ينبغي أن يؤخذ في الاعتبار أن الترددات طفرة الممثلة هنا هي الكمي المطلق، وينبغي ألا تعتبر القيمة النسبية لمعدل الطفرات أو تردد. توفر ddPCR قراءات الكمي المطلق للطفرة DNA الهدف. ويمكن استخدام هذه القيم للتحقق من صحة ترددات تحور العينات التي أعدت في إطار نفس الحالة، والتسلسل فوق المنطقة نفسها. ومع ذلك، هذه القيم المطلقة هي تكرار ويمكن استخدامها لمقارنة كمية التوزيع طفرة والتردد عندما يتم التحكم المعلمات المثلى. في الختام، وقد برزت في الآونة الأخيرة ddPCR كأداة قوية أن يعطي الكميات المطلقة من الأحماض النووية في عينات FFPE وخزعة، ويمكن أيضا أن duplexed مع فحوصات مرجعية لتحديد إما لاتركيزات نسخة rmalized أو عدد نسخ الحمض النووي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ميونغ Ryuri أوه، سي يون كيم، ويونغ كيم DEUG هم موظفون من ABION CRO.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث من قبل برنامج R & D للجمعية مؤسسة البحوث الوطنية (جبهة الخلاص الوطني)، بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي (منحة رقم 2013M3C8A1075908).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument | Siemens | 10701001 | Automated DNA isolation instrument |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment | 621BR17718 | ||
| PX1 PCR plate sealer | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| DNA isolation kit | |||
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632398 | |
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632399 | |
| CO-RE tips | Siemens | ||
| ddPCR mutation analysis | |||
| ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | 2X concentration |
| DG8 cartridge | Bio-Rad | BR186-4008 | |
| Droplet Generator oil | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| Gasket | Bio-Rad | BR186-3006 | |
| Droplet reader oil | Bio-Rad | BR-186-3004 |
References
- Vogelstein, B., et al. Genetic alterations during colorectal-tumor development. The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417, 949-954 (2002).
- Solit, D. B., et al. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition. Nature. 439, 358-362 (2006).
- Wong, K. K. Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway. Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).
- Brose, M. S., et al. BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma. Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).
- Wang, L., et al. BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair. Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).
- Hindson, B. J., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification. Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).
- Jones, M., et al. Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'. Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).
- Strain, M. C., et al. Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR. PloS one. 8, e55943 (2013).
- Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR. Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).
- Bizouarn, F. Clinical applications using digital PCR. Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).
- McDermott, G. P., et al. Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR. Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).
- Milbury, C. A., et al. Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations. Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).
- Zhu, G., et al. Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer. The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).
- Fan, H., Gulley, M. L. DNA extraction from paraffin-embedded tissues. Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).
- Nadauld, L., et al. Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR. Translational medicine. 2, (2012).
