Summary
Bu videonun amacı klinik ortamda nadir mutasyonları tespit etmek formalin ile fikse parafine gömülü (FFPE) referans standart hücre hatları ve dijital damlacık PCR (ddPCR) analizden otomatik DNA ekstraksiyon gerçekleştirmek için nasıl göstermektir. FFPE örneklerde mutasyonları tespit edilmesi FFPE örneklerinde ddPCR klinik faydasını ortaya koyar.
Introduction
Kilit düzenleyici genlerde genetik mutasyon birikimi kanseri 1 giden, hücre proliferasyonu, farklılaşması ve hayatta kalma gibi normal hücre programlamayı değiştirir. RAS-RAF-MAP kinaz yolu, büyüme sinyallerine hücresel tepkileri aracılık eder. Onkogenik BRAF mutasyonlar 2 aşırı aktif olma onkoprotein BRAF neden olabilir BRAF genindeki mutasyonlar sürücüsü, kaynaklanabilir. BRAF genindeki mutasyonlar da sırayla, büyüme faktörü aracılığında düzenlenmesinin 4-6 bağımsız aşırı hücre büyümesi ve çoğalmasına neden, MEK ve ERK 3 aracılığıyla aşırı akış aşağı sinyal ile sonuçlanır.
Bazı araçlar örneğin ddPCR tarafından formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) referans standardı hücre hatlarında kantitatif gerçek zamanlı BRAF V600E mutasyonlar gibi DNA mutasyonu profil mevcuttur. ddPCR mutlak ölçümü için bir PCR bazlı yöntemGeleneksel kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) 7,8 oranla daha yüksek doğruluk sunar. ddPCR aynı zamanda daha detaylı kanser araştırma ve tanı 9 sağlayan DNA şablonları nadir mutasyonların saptanması için güç ve doğruluk çözme daha içerir. Düşük şablon kopya sayıları 10-12 okuyan zaman geleneksel qPCR üzerinde ddPCR ek avantajları geliştirilmiş hassasiyet ve doğruluk içerir. Burada, otomatik ddPCR tarafından BRAF V600E mutasyonların varlığını veya yokluğunu tespit ederek, ardından FFPE referans standardı hücre çizgileri, DNA ekstre için bir protokol olduğunu göstermiştir. Veri analizi ve sonuçlarının grafik bir gösterimi için yazılım kullanımı da tarif edilmektedir. Tüm işlem nispeten basittir ve tamamen profilli numune sayısı ve mevcut klasik bir PCR ve ddPCR makineleri sayısına bağlıdır.
Aşağıdaki protokol BR standart prosedürleri açıklar AF V600E pozitif FFPE referans standardı hücre çizgileri (HD598, HD593, HD617, HD273 ve yabani tipteki (WT)) Doku Hazırlanması System (TPS) protokolü kullanılarak tam otomatik bir cihaz içinde gerçekleştirilir. Ardından, izole edilmiş DNA örnekleri ddPCR sistemi kullanılarak BRAF V600E mutasyonların varlığı için analiz edilir. Tüm örnekler profilli edildikten sonra hedeflenen mutasyon analizi yapılır ve veri veri analiz yazılımı içine yüklendi. Örneklerin sayısına bağlı olarak / grup çalışıldı, veri analizi bir ile birkaç saat gerekebilir. Metodolojinin deneysel bileşeni alınmasında doğruluk gerektirir DNA vesayısal hava Pipetler ve Pipet, pipetleme bağlamında ilgili daha fazla açıklayan bir jove Öğrenim Video "> 96 gözlü plakalara pipetleme veri analiz yazılımı kullanılarak yapılır ise.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
FFPE Referans Standart Hücre Hatları 1. DNA Ekstraksiyon
Not: Bu işlem için, DNA izolasyonu, aşağıdaki protokolde tarif edildiği gibi FFPE Doku DNA izolasyon kiti kullanılarak FFPE referans standardı hücre hatları (HD598, HD593, HD617, HD273 ve vahşi tip (WT)) için yapıldı. Otomatik DNA ekstraksiyon toplam DNA izolasyonu için üreticinin yönergelerini izleyerek elde edildi.
- Bir mikrotom ve orijinal FFPE bloğunu kullanan, elle prosedürlere göre, önce, DNA ekstraksiyon ve analiz taze kesitler hazırlamak. Doku bölümünde (ler) için örnek bir giriş 10 um arasında kombine bir toplam kalınlığını aşmaz analiz emin olun ve yüzey alanı, tek bir bölüm için 600 mm 2 aşmamasına dikkat.
1.2 TPS protokolü
Not: Tablo 1 'de gösterilen birimleri 48 numune işleme için gereken minimum karşılık gelir ve prosedür,gösterilen TPS kurallarına uygundur. Deneye başlamadan önce otomatik programı sırasında örneklerin kaybını önlemek için, 600 x g'de santrifüj e-tüp içinde FFPE örnekleri yerleşmek.
- Otomatik DNA izolasyonu enstrüman ve bilgisayarı açın. Run kontrol yazılımı açın ve TPS güverte yükleme alanı içine otomatik yük tepsi yerleştirin.
- Şekil 1 'de gösterildiği gibi, karşılık gelen olukları içine reaktifleri koyun.
- Numune taşıyıcı raflarına 4 örnekleri (BRAF WT BRAF V600E 50,% 5 ve% 1%) yerleştirin.
- Sütunları 2 ve 3 teknelerde uç kutuları yerleştirin ve çalıştırın iptal edecek, ucu başına birden fazla filtre varlığını ipuçlarına bakın.
- Onlara 3-5 kez ters yüz edilerek lizis tamponu ve yıkama tamponu uygun karışmasını sağlamak ve sütunda 4 (Şekil 1) ilgili olukları içine yerleştirin.
- Birkaç kez veya hafif Vort için tersini sonraexing, (Şekil 1, Tablo 1) belirtilen yerlerde 1 yuva boş bırakarak, sütunda 5 küçük teknelerde elüsyon tamponu, manyetik boncuk ve FFPE tampon yerleştirin.
- Plaka taşıyıcısı (Şekil 1) üzerine 2 ml derin kuyu plaka (DWP) yükleyin.
- Bir çalışma başlamadan önce aşağıdaki nihai adımları gerçekleştirin:
- Tüm tüpleri ve reaktif olukları şapkasını çıkarmak. Yeterli kapasite sıvı atık şişe mevcuttur onaylayın. Katı atık şişesi boş ve biyolojik tehlikeli bir çanta ile kaplı olduğunu doğrulayın. Ucu çıkarma plaka atık montaj merkezli olduğunu doğrulayın.
- Ön kapağı kapatın.
- Yazılımını başlatın. NA_Prep_Main_MLSTARlet.med dosyasını açın.
- Tıklayın "Başlat". Enstrüman durumu çalıştıran boşta geçiş olacaktır.
- Bu çalışma için örneklerin sayısını girin. Bu çalışma (DNA = 0) için istenen yöntemi seçin. İlk yüksek vol konumunu girinume ucu, tüm tepsiler doluysa "1" seçilmesi. Tüm tepsiler doluysa "1" seçilerek, ilk standart hacim ucunun konumunu girin.
Not: Cihaz sonra kullanıcı müdahalesi olmadan otomatik adımlarda çalışacaktır. Ayrıntılı iş akışı Şekil 2'de gösterilmiştir. Deney bittiğinde, reaktif atıklar ve ipuçları atık montaj enjekte edilir. - Florometrik bir yöntemi kullanarak saflaştırılmış genomik DNA ölçmek.
Not: 3,3 ng / ul'lik bir konsantrasyona az ihtiva eden DNA numuneleri ddPCR analizi (bölüm 2) tabi tutulur.
2. DNA Mutasyon profil: ddPCR Protokolü
Not: 1) Damlacık nesil 2) Konvansiyonel PCR büyütmesi, 3) Damlacık okuma ve 4), DNA mutasyonu profilleme: DNA mutasyonu profilleme için protokol 3 büyük adımlardan oluşur.
2.1. Damlacık oluşturma
Not: ddPCR Supermix olduğuBu karışım damlacık üretimi için gerekli olan reaktif içerdiğinden, ddPCR için önerilir.
- , Kontaminasyonu önlemek gibi bir temiz PCR kaput, temiz pipetleri ve düşük protein bağlama tüpleri kullanan, eldiven giymiş gibi standart önlemler, izleyin.
- İnsan genomik DNA örneği minimum konsantrasyonu 3.3 ng / ml olduğundan emin olun. Not: saflaştırılmış DNA örneği konsantrasyonu miktarı% mutasyon sıklığı algılama analizine göre değişir.
- 96 gözlü PCR plakaları içinde reaksiyon karışımlarını bir araya getirin. Çözülme ve oda sıcaklığına kadar reaksiyon bileşenlerini dengeye getirin. (Her saflaştırılmış DNA örneği (66ng / 2 ul), distile su ile 20 ul'ye kadar yapmak, 2X ddPCR SuperMix (10 | il) ve 20 primerleri (ileri ve geri, 900 nM) ve sonda (250 nM) birleştirilerek PCR reaksiyonları hazırlayın ) damlacık jeneratör protokolü başına
- Dağıtım önce tüpün alt kısmında içeriğini toplamak için homojenlik ve kısaca santrifüj sağlamak için iyice karışımı karıştırın. Yük 20 & #181; damlacık oluşumu için kartuş üzerine l.
- İmalatçının tavsiye ettiği protokole göre damlacık jeneratör çalışması,
- Sahibinin sol üst tarafına yerleştirilmiş kartuş içinde çentik ile tutucu içine kartuşu takın. Alt kuyulara ortasına örnekleri içeren bir reaksiyon karışımı 20 ul, ve jeneratör yağı 70 ul ekle.
- Kartuşun üstünde conta takın. Conta sahibinin iki ucunda güvenli bağımlısı olduğundan emin olun; aksi halde, damlacık oluşturma için yeterli basınç elde edilemez olacaktır.
- Cihazın üstündeki yeşil düğmeye basarak damlacık jeneratör açın ve kartuşu takın. Tutucu gücü (sağdan sola) ve tutucu (orta sağ) gösterge ışıkları yeşil, hem doğru konumda olduğunda.
- Kapıyı kapatmak için tekrar enstrüman üst düğmesine basın ve damlacık nesil başlatırlar. Not: b bastıktan sonrabasıp bırakın, damlacıklar oluşturulan mikroakışkan kanallar aracılığıyla petrol ve örnekleri çizim çıkış kuyuları üzerinde manifoldu pozisyonları kendisi. Onlar birikir nerede Damlacıklar, iyi damlacık içine akar. 10 saniye damlacık nesil devam etmekte olduğunu göstermek için daha sonra damlacık gösterge ışığı (sağda) yeşil renkte yanıp söner.
- Damlacık oluşturma tamamlandığında, 3 gösterge ışıkları katı yeşile; düğmesine basarak kapıyı açın ve üniteden tutucu çıkarın. Yuvasından atılan contasını çıkartın ve atın. Not: kartuşun üst kuyu damlacıkları içerir ve orta ve alt oyuklar kalıntı yağın küçük bir miktarı ile, hemen hemen boş olduğunda.
2.2. PCR için Preparasyon
- Üreticinin aygıt protokolde belirtilen her bir numune için, tavsiye edilen bir 96-çukurlu PCR plaka tek bir kuyunun içine en iyi kartuşlardan damlacık içeriğinin 40 ul üzerinden pipetleyin. Hayırte: çok kanallı bir pipet kullanarak damlacıklar emülsiyon aktarmak için idealdir. Damlacıkların Yavaş ve nazik aspirasyon transferleri sırasında damlacık kesme aza indirmek için tavsiye edilir.
- Hemen buharlaşmasını önlemek için damlacıkların aktardıktan sonra folyo ile PCR plaka mühür. PCR plaka kapatıcı ve damlacık okuyucu iğneler ile uyumlu delinebilir folyo plaka contaları kullanın. PCR plaka mühürleyen kullanım kılavuzunda yönergeleri izleyin.
- 180 ° C plaka mühürleyen sıcaklığı ve 5 sn saati ayarlayın.
- Tepsi kapıyı açmak için oka dokunun. 96-iyi tarafı yukarı bakacak şekilde tepsiye destek bloğu yerleştirin. Destek blok üzerine 96-plaka koyun ve tüm plaka kuyuları destek bloğu ile uyumlu olduğundan emin olun.
- Delinebilir folyo mühür 1 levha ile 96-plaka örtün. 96-plaka destek bloğu üzerinde güvenli ve delinebilir folyo mühür ile kaplıdır sonra, mühür düğmesine dokunun. Tepsi kapanacakve ısı yalıtım başlatacaktır.
- Isı yapıştırma işlemi tamamlandığında, kapı otomatik olarak açılır; Termal bisiklet için ısı bloğu plaka kaldırmak ve daha sonra ısı bloğu kaldırmak.
- Plaka tüm kuyu folyo depresyonlar her bir üzerinde aşikar olduğu kontrol ederek sızdırmaz olduğundan emin olun. Mühürlü sonra, plaka, termal bisiklet için hazırdır.
- Damlacıklar çıkarıldıktan sonra, açmak için kartuş tutucu üzerindeki mandalları basın. Boş kartuşu çıkarın ve atın.
- Tablo 2'de ayrıntılı parametreleri takip ederek geleneksel PCR gerçekleştirin.
2.3 Damlacık okuma (üreticinin tavsiye ettiği protokole göre)
Not: damlacıklar halinde nükleik asit hedefin PCR amplifikasyonu takiben damla okuyucu cihaz tek bir 2-renk algılama sistemi 13 kullanılarak her damlacık analiz eder. Biz genellikle FAM algılayıp ayarlamakd VIC muhabiri floroforlar.
- Başbakan damlacık okuyucuya "Flush sistemi" tıklayın ve ddPCR analiz için hazır olun.
- Damlacık okuyucu plaka yükleyin ve tıklayın "start". Damlacık okuyucu, her bir örnek aspire damlacıkları singulates ve 2 renkli dedektörü geçmiş bunları tek dosyaya akarsu. Dedektör olumlu ve olumsuz örnekleri numaralandırmak damlacıkları okur.
- Damlacık okuma tamamlandığında, kapıyı açmak ve üniteden plaka tutucu çıkarın. Sahibinden 96-PCR plakasını çıkarın ve atın.
- Doğru bakım için, damlacık okuyucu yağı yerine ve gerektiğinde atık yuvasını boşaltın. Mikrobiyal büyümeyi önlemek için atık şişeye% 10 çamaşır suyu 50 ml ekleyin.
2.4 DNA mutasyonu profilleme (üreticinin tavsiye ettiği protokole göre)
Not: PCR pozitif ve PCR-negatif damlacıkları mutlak quantific sağlamak için sayılırveri analiz yazılımı kullanılarak dijital formda, hedef BRAF V600E DNA mutasyonlarının asyon.
- Numuneler, tahliller ve deneyler hakkında bilgi girmek için Kur'u tıklatın.
- Kurulumu penceresinde, bir tabak (filename.qlp) yüklemek, sonra verileri açıp analiz analiz tıklatın. Sonuçlar Tablo, Kuyu Seçici ve İşlenmiş Data / Grafik Ekran: Veri analizi arayüzü üç pencere ayrılır.
- İşlenmiş Veri penceresinde, her hedef için konsantrasyon veri plakası haritası kuyularda görünür ve Sonuçlar Tablo tabloda gösterilmektedir. Konsantrasyon araziler verileri görselleştirmek için Konsantrasyon tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bizim ddPCR analizi için, biz BRAF V600E mutasyonu FFPE referans standardı hücre hatları okudu. Damlacık okuyucu dizüstü bilgisayar çalıştıran veri analiz yazılımı bağlanır. Her bir damlacık pozitif ya da negatif olarak flüoresan genlik bazında tanımlanır. Üretici tarafından sağlanan yazılım da kullanıcı tanımlı kesim pozitif ve negatif damlacıklar arasındaki eşiği tanımlamak için girilmesine izin verir. Bir numune, pozitif ve negatif damlacık sayısıdır kopya / ul açısından hedef konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılır.
Floresans algılanabilir ve iki boyutlu bir dağılım çizim ekran içine işlenir, özel yazılım, her damlacık uç paneli için uygun bir kapı çizmek için kullanıldı ve her bir kapı içinde damlacıkların sayıldı edildi. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, her sampl için cut-off hattı üzerindeki mavi noktalar (FAM floresans sinyali) ile temsil edilen damlacıklarıes (pembe çizgi) mutasyona uğramış BRAF V600E pozitifti. BRAF WT mavi noktalarla temsil damlacıklar (NTC; Lane 2) numune non-spesifik sinyal nedeniyle olabilir (yanlış pozitif). Yanlış pozitif sinyaller (BRAF WT), diğer mutasyon örnekleri ile normalize edildi. Şekil 3B'de gösterildiği gibi, WT BRAF damlacıklar yeşil nokta (VIC floresans sinyali) ile temsil edilmektedir. Her iki bölgede de, en alttaki siyah nokta floresan arka plan olarak kabul edilmektedir. Genel mutant alel frekansları tespit göreli WT BRAF'ın yüzdeleri ve BRAF V600E şablonlara dayalı, Şekil 3C gösterilen veriler kullanılarak hesaplanmıştır. Elde edilen sonuçlar ddPCR damlacık olay sayısı ve hesaplanan doğal tipte ve mutant DNA molekülü BRAF V600E (% 50,% 10,% 5,% 1,% 0.5,% 0.1 ve% 0.05) için aşağıdaki kullanılarak hesaplanmıştır örnekleri sayar içeren belirtilen formül.
Mutant frekansı =% 'si (MutantKopya / (Yabani türde + Mutant kopyası)) x 100
Buna göre, BRAF V600E mutasyonu tespit ve referans standardı (BRAF WT) ile doğrulandı. 50,% 10,% 5,% 1,% 0.5,% 0.1 ve% 0.05 ila% Tanımlı BRAF V600E mutasyonu alelik frekanslar ddPCR sisteminin hassasiyet ve tekrarlanabilirlik test etmek için kullanıldı. Bilinen örnek konsantrasyonları ile analizden, biz ddPCR BRAF V600E mutasyonu gibi düşük 0.05 olarak% tespit edebiliyor olduğunu doğruladı. 14 Daha önce bildirildiği gibi NTC veya WT yanlış pozitif mutant sayısının tespiti muhtemelen non-spesifik prob hidrolize olabilir. Bir numunede en az iki kopya algılama tümör dokusunda 15 pozitif olarak kabul edilmiştir.
Aut hazırlık reaktif ve numune yükleme açıklayan Şekil 1. şematik omated DNA ekstraksiyon alet. Bir taşıyıcı raflar örnekleri yerleştirin ve belirtildiği gibi gelen olukları içine reaktifleri dağıtın. Birden örnek türlerini destekler otomatik TPS protokolü, istihdam doğru sunar ve maksimum verimlilik ile güvenilir sonuçlar. Siemens Healthcare Diagnostics izni ile yeniden basılmış. (Siemens Healthcare Diagnostics izniyle).
Otomatik DNA ekstraksiyonu için Doku Hazırlama Sistemi İş Akışı Şekil 2. şematik. FFPE için tam otomatik DNA izolasyon prosedürü gösterilen olumsuz parafin seçimi adımlar, doku enkaz kaldırma ve bağlama ve elüsyon pozitif seçim adımları içeren bölümleri dokular. Siemens Healthcare Diagnostics izni ile yeniden basılmış. (Siemens Healthcare Diagnostics izniyle).
BRAF V600E hassas ölçümü için ddPCR sisteminin Şekil 3. FFPE referans standardı hücre hattı örneklerinde mutasyon. 1D araziler pozitif floresan genliklerinin (A, B) Görselleştirme (1dot -1droplet). (VIC pozitif B) WT BRAF pozitif damlacıkları temsil yeşil noktalar ise Mavi noktalar (A, FAM pozitif), mutant BRAF V600E pozitif damlacıkları temsil etmektedir. Bu saptama FFPE referans standardı hücre hatlarında hassas mutasyon ölçümü sağlar. Pembe çizgi damlacıkları olumlu ve olumsuz sinyaller arasındaki ayrım eşiğidir. (C) fraksiyonel bolluk arsa BRAF V600E mutasyonu (kopya / ul) konsantrasyonu göstermek mavi işaretçileri gösterir veYeşil belirteçler BRAF (WT) ve (kopya / ul) konsantrasyonunu gösterir. Veri analizi yazılımı tarafından üretilen tüm hata çubukları% 95 güven aralığı temsil etmektedir.
| Reaktifler | Hacim (ml) |
| Liziz Tamponu | 106 mi |
| Yıkama Tampon 1 | 101 ml |
| Yıkama Tamponu 2 | 72 mi |
| Yıkama Tamponu 3 | 106 mi |
| Elüsyon Tamponu | 19 mi |
| Manyetik boncuklar | 8 mi |
| FFPE tampon | 15 mi |
| Proteinaz K | 3,3 mi |
48 örnekleri ile DNA ekstraksiyonu için gereklidir reaktifler Tablo 1. toplam hacmi (TPS Kit) birleştirildi.
| Isı | Zaman | # Döngüleri | |
| Enzim aktivasyonu | 95 ° C | 10 dakika | 1 |
| Denatürasyon | 94 ° C | 30 sn | 40 |
| Tavlama / uzatma | 60 ° C | 1 dakika * | |
| Tutmak | 98 ° C | 10 dakika | 1 |
| Tutmak | 4 ° C | Sonsuza dek | 1 |
| * 2-2.5 ° C / sn rampa oranı ayarlarını yapın. 105 ° C olarak ayarlanmış ısıtılmış kapağı kullanın ve 40 ul örnek seviyesini ayarlamak | |||
Tablo 2. Geleneksel PCR ısıl koşullar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, belirli bir gen mutasyonu değerlendirmesi için FFPE referans standardı hücre çizgisi örneklerinden ddPCR uygulanabilirliğini ve DNA izolasyonu vurgulayın. Bu çalışmada, TPS otomatik DNA izolasyon yöntemi kolayca, otomatik adapte edilebilir kullanılır ve büyük ölçekli deneyler ve alt değişkenliği sağlayan, aynı anda 48 farklı örnekleri kapasitelidir. Mevcut çalışmada DNA izolasyonu sınırlamaları biri her FFPE örnek tektir ve yüzey kirleticiler, mikrobiyal flora birbirlerini değişecektir ve / veya insan genetik arka olmasıdır. Genel olarak, ekstre edilmiş DNA kalitesi ve miktarı ve bütün genomik DNA amplifikasyon başarısı sırasında ve ekstraksiyon işleminden sonra, önce çeşitli parametrelere bağlıdır. Bu, tip ve doku miktarını doku koruması için kullanılan sabitleyici tipi, tespit süresini, parafin bloğu ve saklama koşulları yaşı, hem de arzu edilen DNA segmentinin uzunluğu, analiz edilecek içerir <sup> 16. Çözünmemiş parafin kötü örnek kalitesine neden olarak dokudan parafin uzaklaştırılması başarılı çıkarılması için en kritik adımdır. Damlacık oluşturma sırasında, bakım kabarcık oluşumunu önlemek için alınması gereken - bu başarılı mutasyon tespiti için başka önemli bir adımdır. Örnek popülasyonları arasında ortaya çıkan ve deney güdüsü dayalı olabilir varyasyonu örnek numunenin göz önüne alındığında, prosedürde bazı değişiklikler istenilen sonucu elde etmek için gerekli olabilir.
Diğer bir avantajı DNA izolasyonu ve ddPCR Bu protokol otomatik sistemler kullanılarak yapılır, ve dolayısıyla gerekli önemsiz hata ve kullanıcı müdahalesi çok az var. İzolasyon parafine gömülmüş doku / hücrelerden DNA tam genomu ile amplifiye TPS sistemi kullanılarak elde edilmiştir. Otomatik DNA izolasyon sistemi kullanarak dezavantajlarından biri bu örneklerin az sayıda kullanımı maliyet etkin değildir olmasıdır. Bunun yerine otomatik step, diğer standart DNA izolasyon prosedürü, aynı zamanda, sınırlı örnekler için yapılabilecek
Yeni yapılan bir çalışmada kullanarak damlacık dijital PCR (ddPCR) bile FFPE dokulardan elde edilen içiçe normal doku varlığında spesifik genomik lokusların nispi kopya sayısını belirlemek mümkün olduğunu belirtti. Bir kontrol seyreltme serisi kullanarak, Nadauld, L. ve ark. DdPCR deneyi için algılama sınırları (LOD) tayin edildi ve standart gerçek zamanlı PCR 17 ile karşılaştırıldığında DNA az miktarda ilgili geliştirilmiş duyarlılığı rapor etmiştir. Burada, FFPE referans standardı hücre çizgileri ddPCR sisteminin mutasyon tespit etme yeteneğini göstermek için kullanılır. DdPCR sistem sonuçları aşağı% 0.05 mutasyon nadir mutasyon alel frekansları tespit imkanı belirtti. Toplu olarak bu veriler, ddPCR sistemi ayrıca çeşitli değişken allellerinde ve heterozigos klinik tümör numunesinde göreli farklar yüzdeleri kantitatif analiz sağlar göstermektedirs. FFPE örneklerin çok sayıda eş zamanlı olarak, belirli bir gen mutasyonu için analiz edilebilir ve bu nüfusun geniş bir genetik çalışmalar için optimal bir tekniktir.
Son olarak, bu mutasyon sıklığı burada temsil mutlak miktarının ve mutasyon oranı ya da frekans göreli değer olarak kabul edilmemelidir olduğu dikkate alınmalıdır. ddPCR okuma hedef DNA mutasyonu mutlak ölçümü sağlar. Bu değerler, aynı şartlar altında hazırlanan numunelerin mutasyon frekansları doğrulamak için kullanılır ve aynı bölgede dizilenebilmektedir. Bununla birlikte, bu değerler, mutlak tekrarlanabilir ve optimal parametreleri kontrol edildiğinde mutasyon dağılımı ve frekans Kantitatif karşılaştırma için kullanılabilir. Sonuç olarak, son zamanlarda hiçbir ddPCR FFPE ve biyopsi örneklerinde nükleik asitlerin mutlak kantitatif verir ve aynı zamanda da belirlenmesi için referans testleri ile dublekslenebilir sağlam bir araç olarak ortaya çıkmıştırrmalized transkript konsantrasyonları ya da DNA kopya sayısı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Myung Ryuri Oh, Si Eun Kim ve Young DEUG Kim ABION CRO çalışanlarıdır.
Acknowledgments
Bu araştırma Science, ICT ve Gelecek Planlaması (Hibe No 2013M3C8A1075908) Bakanlığı tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı Derneği için Ar-Ge Programı (UÇK) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument | Siemens | 10701001 | Automated DNA isolation instrument |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment | 621BR17718 | ||
| PX1 PCR plate sealer | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| DNA isolation kit | |||
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632398 | |
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632399 | |
| CO-RE tips | Siemens | ||
| ddPCR mutation analysis | |||
| ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | 2X concentration |
| DG8 cartridge | Bio-Rad | BR186-4008 | |
| Droplet Generator oil | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| Gasket | Bio-Rad | BR186-3006 | |
| Droplet reader oil | Bio-Rad | BR-186-3004 |
References
- Vogelstein, B., et al. Genetic alterations during colorectal-tumor development. The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417, 949-954 (2002).
- Solit, D. B., et al. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition. Nature. 439, 358-362 (2006).
- Wong, K. K. Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway. Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).
- Brose, M. S., et al. BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma. Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).
- Wang, L., et al. BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair. Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).
- Hindson, B. J., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification. Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).
- Jones, M., et al. Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'. Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).
- Strain, M. C., et al. Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR. PloS one. 8, e55943 (2013).
- Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR. Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).
- Bizouarn, F. Clinical applications using digital PCR. Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).
- McDermott, G. P., et al. Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR. Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).
- Milbury, C. A., et al. Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations. Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).
- Zhu, G., et al. Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer. The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).
- Fan, H., Gulley, M. L. DNA extraction from paraffin-embedded tissues. Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).
- Nadauld, L., et al. Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR. Translational medicine. 2, (2012).
