Summary
L'obiettivo di questo video è quello di dimostrare come eseguire l'estrazione del DNA automatizzato da inclusi in paraffina linee cellulari fissate in formalina (FFPE) di riferimento standard e delle gocce digitali PCR (ddPCR) analisi per individuare mutazioni rare in un ambiente clinico. Rilevamento mutazioni nei campioni FFPE dimostra l'utilità clinica di ddPCR in campioni FFPE.
Introduction
L'accumulo di mutazioni genetiche nei principali geni regolatori altera programmazione cellula normale come la proliferazione cellulare, il differenziamento e la sopravvivenza, che porta al cancro 1. La chinasi RAS-RAF-MAP media le risposte cellulari ai segnali di crescita. Mutazioni BRAF oncogeno possono derivare da mutazioni del driver nel gene BRAF, che possono causare il BRAF oncoprotein a diventare iperattiva 2. Le mutazioni nel gene BRAF anche tradursi nella segnalazione a valle iperattiva tramite MEK e ERK 3, che, a sua volta, porta alla crescita eccessiva delle cellule e la proliferazione indipendentemente da fattore di crescita-mediata regolazione 4-6.
Sono disponibili diversi strumenti per la mutazione del DNA profiling, come ad esempio in tempo reale mutazioni BRAF V600E quantitativi fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) di riferimento standard di linee cellulari di ddPCR. ddPCR è un metodo basato sulla PCR per la quantificazione assolutaoffrendo una maggiore precisione rispetto ai tradizionali quantitativa real-time PCR (qPCR) 7,8. ddPCR fornisce anche una maggiore potenza e precisione la risoluzione per la rilevazione di mutazioni rare nei modelli di DNA, consentendo la ricerca sul cancro più informativo e la diagnosi 9. Ulteriori vantaggi di ddPCR oltre qPCR convenzionale sono la sua maggiore sensibilità e precisione quando si studia il numero di copie a basso modello 10-12. Qui, un protocollo per estrarre automaticamente DNA da linee cellulari normali riferimento FFPE, seguiti da determinare la presenza o l'assenza di mutazioni BRAFV600E da ddPCR è dimostrata. L'utilizzo di software per l'analisi dei dati e una rappresentazione grafica dei risultati sono anche descritti. L'intera procedura è relativamente semplice e totalmente dipende dal numero di campioni da profilati e il numero delle macchine convenzionali PCR e ddPCR disponibili.
Il protocollo che segue descrive le procedure standard per la BR AF-V600E positivi di riferimento FFPE linee di cellule normali (HD598, HD593, HD617, HD273 e di tipo selvatico (WT)) viene eseguita in uno strumento completamente automatico che utilizza il protocollo Tissue preparazione sistema (TPS). Successivamente, i campioni di DNA isolati vengono analizzati per la presenza di mutazioni BRAF V600E utilizzando il sistema ddPCR. Analisi mirata mutazione viene eseguita dopo tutti i campioni sono stati profilato e i dati sono stati caricati nel software di analisi dati. A seconda del numero di campioni / gruppi studiati, analisi dei dati può richiedere da una a diverse ore. Il componente sperimentale della metodologia richiede accuratezza nella gestione DNA erological Pipette e pipette, un video JOVE Scienze della Formazione spiegare di più sul contesto di pipettaggio "> pipettaggio in 96 pozzetti, mentre l'analisi dei dati viene eseguita utilizzando il software.
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Protocol
1. Estrazione del DNA da linee cellulari FFPE di riferimento standard
Nota: Per questa procedura, estrazione del DNA è stata effettuata da linee cellulari standard di riferimento FFPE (HD598, HD593, HD617, HD273 e di tipo selvatico (WT)) utilizzando il tessuto DNA Kit di isolamento FFPE come descritto nel protocollo di seguito. Estrazione del DNA automatizzato è stato ottenuto seguendo le istruzioni del produttore per l'estrazione del DNA totale.
- Utilizzando un microtomo e il blocco FFPE originale, preparare manualmente sezioni fresche prima di estrazione del DNA e analisi, secondo le procedure stabilite. Assicurarsi che l'ingresso campione per la sezione di tessuto (s) analizzato non superi uno spessore totale di 10 micron e che la superficie non supera 600 mm 2 per una singola sezione.
1.2 Protocollo di TPS
Nota: I volumi indicati nella tabella 1 corrispondono al minimo richiesto per elaborare 48 campioni, e la proceduraindicato è in conformità con le linee guida TPS. Prima di iniziare l'esperimento sistemarsi i campioni FFPE nell'e-tubo per centrifugazione a 600 xg, per evitare la perdita dei campioni nel corso del programma automatico.
- Accendere lo strumento isolamento del DNA automatizzato e il computer. Aprire il software di controllo Esegui e inserire un vassoio di caricamento automatico nella zona di piano di carico TPS.
- Versare il reagente nelle loro depressioni corrispondenti, come mostrato in Figura 1.
- Posizionare i 4 campioni (BRAF WT, BRAF V600E 50%, 5% e 1%) nei rack vettore campione.
- Posizionare le scatole di punta nelle vaschette nelle colonne 2 e 3 e consultare i suggerimenti per la presenza di più di un filtro per ogni suggerimento, che interrompe la corsa.
- Assicurare corretta miscelazione del tampone di lisi e tampone di lavaggio invertendo loro 3-5 volte e caricarle nelle rispettive depressioni nella colonna 4 (Figura 1).
- Dopo l'inversione per poche volte o Vort miteexing, caricare il tampone di eluizione, sfere magnetiche, e di buffer FFPE nelle piccole depressioni nella colonna 5, lasciando 1 slot vuoto dove indicato (Figura 1, Tabella 1).
- Caricare un 2 ml profondo pozzetti (DWP) sul supporto piastra (Figura 1).
- Effettuare le seguenti operazioni finali prima di iniziare una corsa:
- Stappare tutti i tubi e le depressioni dei reagenti. Confermare che dispone di sufficiente capacità nella bottiglia rifiuti liquidi. Verificare che la bottiglia rifiuti solidi è vuota e foderato con un sacchetto. Verificare che la piastra di punta di espulsione è centrata nel gruppo dei rifiuti.
- Chiudere il coperchio anteriore.
- Avviare il software. Aprire il file NA_Prep_Main_MLSTARlet.med.
- Fare clic su "Start". Lo stato dello strumento passa dal minimo a correre.
- Inserire il numero di campioni per questa esecuzione. Scegliere il metodo desiderato per questa esecuzione (DNA = 0). Inserire la posizione della prima alta volume punta, selezionando "1" se tutti i vassoi sono pieni. Inserire la posizione della prima punta volume standard, selezionando "1" se tutti i vassoi sono pieni.
Nota: Lo strumento quindi eseguire attraverso passaggi automatizzati senza l'intervento dell'utente. Un flusso di lavoro dettagliato è illustrato nella figura 2. Una volta che l'esperimento è finito, rifiuti reagenti e punte sono iniettati nella piletta. - Quantificare DNA genomico purificato utilizzando un metodo fluorimetrico.
Nota: campioni di DNA che contengono una concentrazione minima di 3,3 ng / ml sono sottoposti a ddPCR analisi (sezione 2).
2. DNA Mutazione Profiling: ddPCR protocollo
Nota: Il protocollo per mutazione del DNA profiling consiste di 3 fasi principali: 1) generazione Droplet, 2) Convenzionale amplificazione PCR, 3) la lettura di gocce e 4) mutazione del DNA profiling.
2.1. Generazione Droplet
Nota: ddPCR Supermix èconsigliato per ddPCR, come questa miscela contiene reagenti necessari per la generazione di goccioline.
- Per evitare la contaminazione, seguire le precauzioni standard, ad esempio indossando guanti, utilizzando una cappa pulita PCR, pipette pulite, e tubi basso contenuto proteico vincolante.
- Assicurarsi che la concentrazione minima di campione di DNA genomico umano è di 3,3 ng / ml. Nota: La quantità di concentrazione del campione di DNA purificato varia in base all'analisi di rilevamento della frequenza di mutazione%.
- Montare miscele di reazione a piastre PCR da 96 pozzetti. Scongelare ed equilibrare i componenti di reazione di RT. Preparare le reazioni PCR combinando 2X ddPCR supermix (10 ml) e 20 primer (avanti e indietro, 900 nm) e sonda (250 Nm), con ogni campione di DNA purificato (66ng / 2 ml), portare a 20 ml con acqua distillata (come secondo il protocollo generatore di gocce)
- Agitare accuratamente la miscela di garantire l'omogeneità e centrifugare brevemente per raccogliere il contenuto al fondo della provetta prima di dispensare. Carico 20 & #181; l sulla cartuccia per la formazione di goccioline.
- Il funzionamento del generatore di gocce, per protocollo consigliato dal produttore
- Inserire la cartuccia nel supporto con la tacca nella cartuccia posizionato sul lato superiore sinistro del titolare. Aggiungere 20 ml di miscela di reazione contenente campioni in mezzo, e 70 ml di olio di generatore nei pozzetti inferiori.
- Fissare la guarnizione nella parte superiore della cartuccia. Assicurarsi che la guarnizione sia saldamente agganciato su entrambe le estremità del titolare; altrimenti, pressione sufficiente per la generazione di goccioline non sarà raggiunto.
- Aprire il generatore gocciolina premendo il tasto verde sulla parte superiore dello strumento e inserire la cartuccia. Quando la porta è nella posizione corretta, sia la potenza (sinistra a destra) e il supporto (destra centro) spie sono verdi.
- Premere il pulsante in alto sullo strumento nuovo per chiudere la porta e avviare la generazione delle gocce. Nota: Dopo aver premuto il button, un collettore si posizioni sopra i pozzi di scarico, disegno e campioni di olio attraverso i canali microfluidica, dove vengono create le goccioline. Goccioline confluiscono goccia pozzo, dove si accumulano. La spia delle gocce (a destra) lampeggia in verde dopo 10 secondi per indicare che la generazione delle gocce è in corso.
- Quando la generazione delle gocce è completo, tutti gli indicatori 3 luci cambiano a verde fissa; aprire la porta premendo il pulsante, e rimuovere il supporto dall'unità. Rimuovere la guarnizione usa e getta dal supporto e scartarla. Nota: I primi pozzetti della cartuccia contengono goccioline, ed i pozzetti medio e basso sono quasi vuoto, con una piccola quantità di olio residuo.
2.2. Preparazione per la PCR
- Per ciascun campione, Pipettare 40 ml del contenuto goccioline dall'alto bene le cartucce in un singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti PCR raccomandata indicata nella protocollo dello strumento del produttore. Note: Usando una pipetta multicanale è ideale per trasferire le goccioline emulsioni. Lento e dolce l'aspirazione di goccioline si consiglia di ridurre al minimo delle gocce di taglio durante i trasferimenti.
- Sigillare la piastra PCR con pellicola subito dopo il trasferimento gocce per evitare l'evaporazione. Utilizzare piastra del foglio perforabili che sono compatibili con la pellicola sigillante PCR e gli aghi nel lettore gocciolina. Seguire le istruzioni riportate nel manuale di istruzioni sigillante piatto PCR.
- Impostare la temperatura della piastra sigillante a 180 ° C e il tempo di 5 sec.
- Toccare la freccia per aprire lo sportello del vassoio. Posizionare il blocco di supporto sul vassoio con il lato di 96 pozzetti rivolto verso l'alto. Posizionare la piastra a 96 pozzetti sul blocco di supporto e assicurarsi che tutti i pozzetti della piastra sono allineati con il blocco di supporto.
- Coprire la piastra a 96 pozzetti con 1 foglio di pellicola di sigillo perforabile. Una volta che la piastra a 96 pozzetti è fissato sul blocco di supporto e coperto con la pellicola di sigillo perforabile, toccare il pulsante di tenuta. Il vassoio si chiudee saldatura a caldo avvierà.
- Quando termosaldatura è completa, la porta si apre automaticamente; rimuovere la piastra dal blocco calore per cicli termici e quindi rimuovere il blocco di calore.
- Assicurarsi che tutti i pozzetti della piastra sono sigillate verificando che le depressioni del foglio sono evidenti su ogni bene. Una volta sigillato, il piatto è pronto per cicli termici.
- Una volta che le goccioline vengono rimossi, premere i fermi sul supporto della cartuccia per aprirlo. Rimuovere la cartuccia vuota e disfarsene.
- Eseguire convenzionale amplificazione PCR seguendo i parametri descritti nella tabella 2.
2.3 lettura Droplet (come da protocollo consigliato dal produttore)
Nota: Dopo l'amplificazione PCR del target di acido nucleico nelle goccioline, lo strumento lettore gocciolina analizza ogni gocciolina singolarmente usando un sistema di rilevamento 2-colore 13. Noi di solito impostato per rilevare un FAMd VIC fluorofori giornalista.
- Fai clic su "Sistema Flush" per innescare il lettore droplet e renderlo pronto per l'analisi ddPCR.
- Caricare la piastra nel lettore droplet e cliccare su "start". Il lettore gocciolina aspira ogni campione, singulates le goccioline, e torrenti in fila davanti a un rilevatore a 2 colori. Il rivelatore legge le goccioline enumerare campioni positivi e negativi.
- Quando la lettura delle gocce, aprire la porta e rimuovere il supporto targa dall'unità. Rimuovere la piastra PCR a 96 pozzetti dal supporto e scartarla.
- Per una corretta manutenzione, sostituire l'olio lettore di droplet e svuotare il contenitore di raccolta in base alle esigenze. Aggiungere 50 ml di candeggina al 10% per la bottiglia degli scarti per evitare la crescita microbica.
2.4 DNA mutazione del profilo (come da protocollo consigliato dal produttore)
Nota: le goccioline PCR-positivi e PCR-negativi sono contate per fornire quantific assolutozione di destinazione mutazioni BRAF V600E DNA in forma digitale, utilizzando software di analisi dei dati.
- Fare clic su Imposta per inserire le informazioni relative ai campioni, saggi, ed esperimenti.
- Nella finestra di installazione, caricare una piastra (filename.qlp), quindi fare clic su Analizza per aprire e analizzare i dati. L'interfaccia di analisi dei dati è suddiviso in tre finestre: Tabella Risultati, ben Selector e dati oggetto di trattamento / grafico di visualizzazione.
- Nella finestra dati elaborati, i dati di concentrazione per ogni target appaiono nei pozzetti nella mappa piastra e sono riportati nella tabella dei risultati. Clicca Concentrazione per visualizzare i dati Terreni di concentramento.
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Representative Results
Per la nostra analisi ddPCR, abbiamo studiato le linee di cellule normali di riferimento mutazione FFPE BRAFV600E. Il lettore droplet si connette a un software portatile di analisi dei dati del computer in esecuzione. Ogni singola goccia viene definita sulla base dell'ampiezza fluorescente come positivo o negativo. Il software fornito dal produttore permette anche un taglio definito dall'utente da immettere per definire la soglia tra le goccioline positivi e negativi. Il numero di goccioline positivi e negativi in un campione viene utilizzato per calcolare la concentrazione del bersaglio a copie / ml.
La fluorescenza è stato rilevato e trasformato in uno schermo a due dimensioni grafico a dispersione, software personalizzato è stato utilizzato per disegnare porte appropriate per ciascun end point del cluster delle gocce, e il numero di goccioline all'interno di ogni porta è stato contato. Come mostrato in Figura 3A, goccioline rappresentata da punti blu (segnale fluorescente FAM) sopra la linea di demarcazione per tutti samples (linea rosa) sono risultati positivi per mutazione V600E BRAF. Goccioline rappresentati da puntini blu del BRAF WT (NTC, corsia 2) campione potrebbe essere causa di un segnale non specifico (falso positivo). Segnali falsi positivi (BRAF WT) sono stati normalizzati con altri campioni di mutazione. Come mostrato nella Figura 3B, goccioline WT BRAF sono rappresentati da punti verdi (segnale di fluorescenza VIC). In entrambi i grafici, i punti grigi in fondo sono considerati come la fluorescenza di fondo. Le frequenze complessive allele mutante sono stati calcolati utilizzando i dati illustrati nella Figura 3C, in funzione delle relative percentuali di WT BRAF e modelli BRAFV600E rilevati. Risultati ddPCR ottenute contengono i conteggi degli eventi gocciolina e calcolato wild-type e mutante molecola di DNA conta per la V600E BRAF (50%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, 0,1% e 0,05%) campioni calcolato utilizzando il sotto formula menzionata.
% Della frequenza di Mutant = (MutantCopia / (Wildtype + copia mutante)) x 100
Di conseguenza, le mutazioni BRAF V600E sono state identificate e verificate con standard di riferimento (BRAF WT). Definito BRAFV600E mutazione frequenze alleliche del 50%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, 0,1% e 0,05% sono stati usati per testare la sensibilità e la riproducibilità del sistema ddPCR. Dalla nostra analisi con concentrazioni del campione noti, abbiamo confermato che ddPCR è in grado di rilevare a partire da 0,05% del BRAF V600E mutazione. La rilevazione di falsi positivi nel conteggio mutante NTC o WT potrebbe forse essere dovuto alla non-specifico idrolisi sonda come riportato in precedenza 14. Rilevamento di più di due copie di un campione è stato considerato positivo nel tessuto tumorale 15.
Figura 1. Rappresentazione schematica descrizione del reagente e campione di carico in preparazione per aut strumento di estrazione del DNA omated. Mettere i campioni in un rack carrier e dispensare i reagenti in depressioni corrispondenti come detto. Impiegando automatizzato protocollo TPS che supporta più tipi di campioni, offre accurate e risultati affidabili con la massima produttività. Ristampato con il permesso di Siemens Healthcare Diagnostics. (per gentile concessione di Siemens Healthcare Diagnostics).
Figura 2. Rappresentazione schematica della preparazione del tessuto Workflow sistema per l'estrazione del DNA automatizzato. Procedura di isolamento del DNA completamente automatizzata per FFPE tessuti sezioni tra fasi negative di selezione di paraffina, rimozione dei residui di tessuto e le fasi di selezione positiva di rilegatura e di eluizione sono mostrati. Ristampato con il permesso di Siemens Healthcare Diagnostics. (per gentile concessione di Siemens Healthcare Diagnostics).
Figura 3. L'utilizzo del sistema ddPCR per la quantificazione precisa della BRAF V600E mutazione nei campioni di linee cellulari standard di riferimento FFPE. (A, B) Visualizzazione di ampiezze di fluorescenza positivi Terreni 1D (1dot -1droplet). Puntini blu (A, FAM positivo) rappresentano BRAF V600E goccioline-positivo mutanti, mentre punti verdi (B, VIC positivo) rappresentano WT BRAF goccioline -positive. Questa determinazione permette precisa quantificazione mutazione in linee cellulari di standard di riferimento FFPE. La linea rosa è la soglia di discriminazione tra segnali positivi e negativi delle goccioline. (C) Il grafico mostra l'abbondanza frazionaria marcatori blu che indicano la concentrazione (copie / ml) di BRAF V600E mutazione, egli indicatori verdi indicano la concentrazione (copie / ml) di BRAF (WT). Tutte le barre di errore generati dal software di analisi dati rappresentano l'intervallo di confidenza del 95%.
| Reagenti | Volume (ml) |
| Lysis Buffer | 106 ml |
| Wash Buffer 1 | 101 ml |
| Wash Buffer 2 | 72 ml |
| Tampone di lavaggio 3 | 106 ml |
| Elution Buffer | 19 ml |
| Sfere magnetiche | 8 ml |
| Buffer FFPE | 15 ml |
| Proteinase K | 3.3 ml |
Tabella 1. Volume totale di reagenti (kit di TPS) richiesto per l'estrazione del DNA con 48 campioni.
| Temperatura | Tempo | # Cicli | |
| Attivazione di enzimi | 95 ° C | 10 min | 1 |
| Denaturazione | 94 ° C | 30 sec | 40 |
| Ricottura / estensione | 60 ° C | 1 minuto * | |
| Tenere | 98 ° C | 10 min | 1 |
| Tenere | 4 ° C | Per sempre | 1 |
| * Regolare le impostazioni velocità di rampa di 2-2,5 ° C / sec. Utilizzare un coperchio riscaldato impostato a 105 ° C e impostare il volume del campione di 40 microlitri | |||
Tabella 2. convenzionale PCR condizioni termocicli
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Discussion
Qui, si evidenzia l'applicabilità di ddPCR e isolamento del DNA da campioni di linee cellulari normali di riferimento FFPE una specifica valutazione mutazione del gene. In questo studio, TPS DNA metodo di isolamento automatico viene utilizzato, che può essere facilmente adattato, automatizzato, e può ospitare fino a 48 campioni diversi contemporaneamente, consentendo per esperimenti su scala più ampia e bassa variabilità. Uno dei limiti di isolamento del DNA nel presente lavoro è che ogni campione FFPE è unico, e varierà tra loro in contaminanti superficiali, flora microbica e / o sfondi genetiche umane. In generale, la qualità e quantità DNA estratto e il successo di tutta l'amplificazione del DNA genomico dipendono da vari parametri prima, durante e dopo l'estrazione. Questi includono, tipo e quantità di tessuto, tipo di fissativo utilizzato per la conservazione dei tessuti, la durata di fissazione, dell'età delle condizioni dei blocchi di paraffina e stoccaggio, nonché la lunghezza del segmento di DNA desiderato da analizzare <sup> 16. La rimozione di paraffina dal tessuto è il passo più critico per l'estrazione di successo come paraffina indisciolto porta alla scarsa qualità del campione. Durante la generazione delle gocce, la cura deve essere presa per evitare la formazione di bolle - questo è un altro passo fondamentale per l'identificazione della mutazione di successo. Considerando il campione all'altro variazione che potrebbero insorgere tra popolazioni campione e basato sul motivo di questo esperimento, alcune modifiche della procedura possono essere necessari per ottenere risultati desiderati.
Un altro vantaggio è che l'isolamento del DNA e ddPCR viene condotta utilizzando sistemi automatizzati in questo protocollo, e quindi non vi è errore trascurabile e intervento da parte dell'utente è molto minimale. Isolare DNA dell'intero genoma-amplificato da tessuti / cellule incluso in paraffina è stata ottenuta utilizzando il sistema TPS. Uno degli inconvenienti nell'utilizzo sistema di isolamento del DNA automatizzato è che, non è economicamente efficiente utilizzare piccolo numero di campioni. Invece di questo ste automatizzatop, altra procedura di isolamento del DNA standard potrebbe essere effettuata anche per i campioni limitati
Uno studio recente ha dichiarato che l'utilizzo di gocce PCR digitale (ddPCR) è in grado di determinare il numero di copie relativo di specifici loci genomici anche in presenza di tessuto normale Interlacciati ottenuti da tessuti FFPE. Utilizzando una serie di diluizioni di controllo, Nadauld, L. et al., Ha determinato i limiti di rilevamento (LOD) per il saggio ddPCR e segnalato la sua maggiore sensibilità sulle quantità minime di DNA rispetto al real-time PCR standard 17. Qui, le linee cellulari standard di riferimento FFPE vengono utilizzati per dimostrare la capacità di rilevamento di mutazione del sistema ddPCR. I risultati del sistema ddPCR indicato la possibilità di rilevare rare frequenze alleliche mutazione fino a 0,05% mutazione. Collettivamente, questi dati indicano che il sistema consente anche ddPCR analisi quantitativa delle percentuali dei vari alleli mutanti e differenze relative eterozigoti campione di tumore clinicas. Grande numero di campioni FFPE può essere analizzato per le mutazioni genetiche specifiche contemporaneamente e si tratta di una tecnica ottimale per ampi studi genetici sulla popolazione.
Infine, si deve tenere conto del fatto che le frequenze di mutazione sono qui rappresentati sono quantificazione assoluta e non dovrebbero essere considerati come valore relativo di tasso o frequenza di mutazione. ddPCR lettura fornisce la quantificazione assoluta di mutazione del DNA bersaglio. Questi valori possono essere utilizzati per validare frequenze di mutazione su campioni preparati nelle stesse condizioni, e sequenziati sulla stessa regione. Tuttavia, questi valori assoluti sono riproducibili e possono essere utilizzati per il confronto quantitativo di distribuzione e frequenza di mutazione quando i parametri ottimali sono controllati. In conclusione, ddPCR è recentemente emerso come uno strumento robusto che dà quantificazione assoluta degli acidi nucleici nei campioni FFPE e biopsia e anche possono essere duplicati con saggi di riferimento per la determinazione di una noLe concentrazioni trascrizione rmalized o numero di copie di DNA.
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Disclosures
Myung Ryuri Oh, Si Eun Kim e Young Kim Deug sono dipendenti di ABION CRO.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma di ricerca e sviluppo per la società della Fondazione Nazionale delle Ricerche (NRF), finanziato dal Ministero della Scienza, ICT & Future Pianificazione (Grant No. 2013M3C8A1075908).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument | Siemens | 10701001 | Automated DNA isolation instrument |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment | 621BR17718 | ||
| PX1 PCR plate sealer | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| DNA isolation kit | |||
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632398 | |
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632399 | |
| CO-RE tips | Siemens | ||
| ddPCR mutation analysis | |||
| ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | 2X concentration |
| DG8 cartridge | Bio-Rad | BR186-4008 | |
| Droplet Generator oil | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| Gasket | Bio-Rad | BR186-3006 | |
| Droplet reader oil | Bio-Rad | BR-186-3004 |
References
- Vogelstein, B., et al. Genetic alterations during colorectal-tumor development. The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417, 949-954 (2002).
- Solit, D. B., et al. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition. Nature. 439, 358-362 (2006).
- Wong, K. K. Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway. Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).
- Brose, M. S., et al. BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma. Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).
- Wang, L., et al. BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair. Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).
- Hindson, B. J., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification. Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).
- Jones, M., et al. Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'. Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).
- Strain, M. C., et al. Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR. PloS one. 8, e55943 (2013).
- Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR. Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).
- Bizouarn, F. Clinical applications using digital PCR. Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).
- McDermott, G. P., et al. Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR. Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).
- Milbury, C. A., et al. Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations. Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).
- Zhu, G., et al. Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer. The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).
- Fan, H., Gulley, M. L. DNA extraction from paraffin-embedded tissues. Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).
- Nadauld, L., et al. Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR. Translational medicine. 2, (2012).
