Summary
Målet med denne video er at vise, hvordan du udfører automatiseret DNA-ekstraktion fra formalin-fikseret paraffinindlejrede (FFPE) referencestandard cellelinjer og digital dråbe PCR (ddPCR) analyse til påvisning af sjældne mutationer i et klinisk miljø. Detektion af mutationer i FFPE prøver viser den kliniske anvendelighed af ddPCR i FFPE prøver.
Introduction
Ophobningen af genetiske mutationer i vigtige regulatoriske gener ændrer normal celle programmering ligesom celledeling, differentiering og overlevelse, hvilket fører til kræft 1. RAS-RAF-MAP-kinase pathway medierer cellulære reaktioner på vækstsignaler. Onkogen BRAF mutationer kan skyldes førerens mutationer i BRAF-genet, som kan forårsage BRAF oncoprotein at blive overaktiv 2. Mutationer i BRAF-genet også resultere i overaktiv nedstrøms signalering via MEK og ERK 3, som til gengæld fører til overdreven vækst og proliferation uafhængigt af vækstfaktor-medieret regulering 4-6.
Flere værktøjer til rådighed for DNA-mutation profilering, såsom kvantitative realtid BRAF V600E mutationer i formalin-fikseret, paraffinindlejrede (FFPE) referencestandard cellelinjer ved ddPCR. ddPCR er en PCR-metode til absolut kvantificeringtilbyde højere nøjagtighed i forhold til konventionelle kvantitativ real-time PCR (qPCR) 7,8. ddPCR giver også højere opløsningsevne og nøjagtighed til påvisning af sjældne mutationer i DNA-skabeloner, der muliggør mere informativ kræftforskning og diagnose 9. Yderligere fordele ved ddPCR i forhold til konventionelle qPCR omfatter dens forbedret følsomhed og nøjagtighed, når studerer lav skabelon kopiantal 10-12. Heri er en protokol til automatisk ekstraktion af DNA fra FFPE referencestandard cellelinjer, efterfulgt af bestemmelse af tilstedeværelsen eller fraværet af BRAF V600E mutationer ved ddPCR påvist. Brugen af software til dataanalyse og en grafisk gengivelse af resultaterne er også beskrevet. Hele proceduren er forholdsvis enkel og fuldstændig afhænger af antallet af prøver, der skal profilerede og antallet af konventionel PCR og ddPCR maskiner til rådighed.
Følgende protokol beskriver standardprocedurer for BR AF V600E-positive FFPE referencestandard cellelinjer (HD598, HD593, HD617, HD273 og vildtype (WT)) udføres i en fuldautomatisk instrument ved hjælp af Preparation System (TPS) protokol Tissue. Efterfølgende isolerede DNA-prøver analyseret for tilstedeværelsen af BRAF V600E mutationer ved hjælp ddPCR system. Målrettet mutation analyse udføres efter alle prøver er blevet profileret, og data er blevet indlæst i dataanalyse software. Afhængig af antallet af prøver / undersøgte grupper, dataanalyse kan kræve fra en til flere timer. Den eksperimentelle del af metoden kræver nøjagtighed i håndtering DNA ogrologimaster Pipetter og pipetterne, en JOVE Science Education video, der forklarer mere om om sammenhæng med pipettering "> pipettering plader med 96 brønde, mens data analyse udføres ved hjælp af software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DNA ekstraktion fra FFPE Reference Standard cellelinier
Bemærk: Til denne procedure, blev DNA-ekstraktion udføres fra FFPE referencestandard cellelinier (HD598, HD593, HD617, HD273 og vildtype (WT)) ved hjælp af FFPE Tissue DNA isolation kit, som beskrevet i protokollen nedenfor. Automatiseret DNA ekstraktion blev opnået ved at følge producentens instruktioner for total DNA-isolering.
- Ved hjælp af en mikrotom og den oprindelige FFPE blokken, manuelt forberede friske sektioner før dna-ekstraktion og analyse, i henhold til gældende procedurer. Sikre, at inputsample for vævssnittet (r) analyseres ikke overstiger en kombineret samlet tykkelse på 10 um og at overfladearealet ikke overstiger 600 mm 2 for en enkelt sektion.
1.2 TPS-protokol
Bemærk: De i tabel 1 bind svarer til den nødvendige for at behandle 48 prøver minimum og procedurenvist er i overensstemmelse med de retningslinjer TPS. Før start af forsøget slå sig ned FFPE prøver i e-røret ved centrifugering ved 600 xg, for at undgå tab af prøver under den automatiske program.
- Tænd for automatiseret DNA-isolering instrument og computer. Åbn Kør kontrol software og indsæt en auto belastning skuffen ind i TPS dæk læsning område.
- Dispensere reagenser i deres tilsvarende trug som vist i figur 1.
- Placer de 4 prøver (BRAF WT, BRAF V600E 50%, 5% og 1%) i prøven carrier stativer.
- Placer spidsen kasser i renderne i kolonne 2 og 3, og kontrollere de tips til tilstedeværelsen af mere end et filter pr tip, som vil afbryde kørslen.
- Sikre en ordentlig blanding af lysisbuffer og vaskebuffer ved at vende dem 3-5 gange, og indlæse dem i de respektive trug i kolonne 4 (figur 1).
- Efter invertering for nogle gange eller mild Vortexing, indlæse elueringsbufferen, magnetiske perler, og FFPE buffer i de små trug i kolonne 5, efterlader 1 slot tom hvor det er angivet (figur 1, tabel 1).
- Indlæse en 2 ml dyb brønd plade (DWP) på pladen bærer (figur 1).
- Udfør følgende sidste skridt, før du starter en kørsel:
- Tag hætten alle rør og reagens trug. Bekræft, at tilstrækkelig kapacitet til rådighed i flydende affald flasken. Bekræft, at fast affald flasken er tom og foret med en biologisk farlige taske. Bekræft, at spidsen eject pladen er centreret i affaldet forsamling.
- Luk frontdækslet.
- Starter softwaren. Åbn NA_Prep_Main_MLSTARlet.med filen.
- Klik på "Start". Instrumentet status skifter fra tomgang til at køre.
- Indtast antallet af prøver til denne kørsel. Vælg den ønskede metode til dette spil (DNA = 0). Indtast positionen for den første high volume tip, vælge "1", hvis alle bakker er fulde. Indtast positionen for den første standard volumen tip, vælge "1", hvis alle bakker er fulde.
Bemærk: Instrumentet vil derefter køre gennem automatiserede trin uden brugerens indgriben. En detaljeret arbejdsgang er vist i figur 2. Når eksperimentet er afsluttet, er reagenset affald og tips injiceret i affaldet samles. - Kvantificere oprenset genomisk DNA ved hjælp af en fluorometrisk fremgangsmåde.
Bemærk: DNA-prøver, som indeholder et minimum koncentration på 3,3 ng / ul udsættes for ddPCR analyse (afsnit 2).
2. DNA Mutation profilering: ddPCR protokollen
Bemærk: Protokollen for DNA mutation profilering består af 3 hovedtrin: 1) Droplet generation, 2) konventionel PCR-amplifikation, 3) dråbe læsning og 4) DNA mutation profilering.
2.1. Droplet generation
Bemærk: ddPCR Supermix eranbefales til ddPCR, da denne blanding indeholder reagenser, der kræves for dråbe generation.
- For at undgå forurening ved at følge standard sikkerhedsforanstaltninger, såsom handsker, med en ren PCR hætte, rene pipetter, og lav-protein-bindende rør.
- Sørg for, at den minimale koncentration af humant genomisk DNA-prøve er 3,3 ng / pl. Bemærk: Mængden af renset DNA-prøve koncentration vil variere baseret på en analyse af% mutation frekvens afsløring.
- Saml reaktionsblandinger i 96-brønds PCR-plader. Optø og tempereres reaktionskomponenterne til stuetemperatur. Forbered PCR-reaktioner ved at kombinere 2X ddPCR Supermix (10 pi) og 20 primere (fremad og tilbage, 900 nM) og sonde (250 nM) med hvert oprenset DNA-prøve (66ng / 2 pi) fyldes op til 20 pi med destilleret vand (som pr dråben generator protokol)
- Vortexes blandingen grundigt for at sikre ensartethed og kort centrifuge for at opsamle indholdet på bunden af glasset, før dispensering. Load 20 & #181 l på patron til dråbedannelse.
- Drift af dråben generator ifølge producentens anbefalede protokol
- Sæt patronen i holderen med hakket i patronen er placeret på den øverste venstre side af holderen. Tilføj 20 ul reaktionsblanding indeholder prøver ind i midten, og 70 pi generator olie i de nederste brønde.
- Fastgør pakningen over toppen af patronen. Sørg for, at pakningen er sikkert hooked på begge ender af indehaveren ellers vil tilstrækkeligt tryk til dråber generation ikke opnås.
- Åbn dråbe generatoren ved at trykke på den grønne knap på toppen af instrumentet og indsæt patronen. Når indehaveren er i den korrekte position, både effekt (venstre til højre) og holder (midten til højre) indikatoren lyser grønt.
- Tryk på den øverste knap på instrumentet igen for at lukke døren og initiere dråbe generation. Bemærk: Efter tryk på button, en manifold positionerer sig over outlet brønde, tegning olie og prøver gennem mikrofluide kanaler, hvor dråber er oprettet. Dråber strømme ind dråben godt, hvor de ophobes. Dråber indikator lys (til højre) blinker grønt efter 10 sek at angive, at dråbe generation er i gang.
- Når dråbe generation er færdig, alle 3 indikatorlamper skifter til konstant grønt; åbne døren ved at trykke på knappen, og tag holderen fra enheden. Fjern den disponible pakningen ud af holderen, og kassér den. Bemærk: Den øverste brønde i patronen indeholder dråber, og den midterste og nederste brønde er næsten tom, med en lille mængde af resterende olie.
2.2. Forberedelse til PCR
- For hver prøve pipetteres ud 40 pi af dråben indhold fra toppen og patronerne i en enkelt brønd i en anbefalet 96-brønds PCR-plade som angivet i fabrikantens instrument protokol. IngenTe: Ved hjælp af en multi-kanal pipette er ideel til overførsel dråberne emulsioner. Anbefales langsom og blid aspiration af dråber for at minimere dråber klipning under overførsler.
- Forsegl PCR-plade med folie umiddelbart efter overførsel dråber for at undgå fordampning. Brug gennembrydelige folie pladeforseglinger der er kompatible med PCR pladeforsegler og nåle i dråben læseren. Følg instruktionerne i PCR pladeforsegler brugsvejledning.
- Indstil pladeforsegleren temperaturen til 180 ° C og tiden til 5 sek.
- Tryk på pilen for at åbne skuffen døren. Placer støtte blok på bakken med den 96-brønd opad. Placer plade med 96 brønde på støtteblokken og sikre, at alle brønde er på linje med støtteblokken.
- Dæk pladen med 96 brønde med 1 ark gennembrydelige folietætning. Når 96-brønds plade er fastgjort på støtteblokken og dækkes med den gennemtrængelige folie forsegling, trykke tætningen knappen. Skuffen lukkerog varmeforsegling vil igangsætte.
- Når varmeforsegling er færdig, åbner døren automatisk; fjerne pladen fra varmen blokken for termisk cykling og derefter fjerne varme blokken.
- Kontroller at alle brønde i pladen er forseglet ved at kontrollere, at fordybninger i folien er indlysende i hver brønd. Når forseglet, pladen er klar til termisk cykling.
- Når dråberne er fjernet, skal du trykke låsene på patronholderen for at åbne den. Fjern den tomme patron og kassér den.
- Udfør konventionel PCR-amplifikation ved at følge de parametre, der er beskrevet i tabel 2.
2.3 Droplet læsning (som pr producentens anbefalede protokol)
Bemærk: Efter PCR-amplifikation af nukleinsyre målet i dråberne, dråben læseren instrument analyserer hver dråbe individuelt ved hjælp af en 2-farve detektionssystem 13. Vi typisk indstillet til at detektere en FAMd VIC reporter fluoroforer.
- Klik på "Skyl system" til prime dråben læseren og gøre den klar til ddPCR analyse.
- Læg pladen i dråben læseren og klik "start". Den lille dråbe læseren suger hver prøve, singulates dråberne, og vandløb dem i enkelt fil forbi en 2-farve detektor. Detektoren læser dråberne at opregne positive og negative prøver.
- Når dråbe læsning er færdig, åbner døren og fjern pladen holderen fra enheden. Fjern 96-brønds PCR-plade fra holderen, og kassér den.
- For korrekt vedligeholdelse, erstatter dråben læseren olie og tøm affaldsbeholderen efter behov. Der tilsættes 50 ml 10% blegemiddel til affaldet flasken for at forhindre mikrobiel vækst.
2.4 DNA-mutation profilering (som pr producentens anbefalede protokol)
Bemærk: PCR-positive og PCR-negative dråber tælles at tilvejebringe absolutte quantification af target BRAF V600E DNA mutationer i digital form, ved hjælp af data analyse software.
- Klik på Opsætning for at indtaste oplysninger om de prøver, analyser og eksperimenter.
- I vinduet Setup indlæse en plade (filename.qlp), klik derefter på Analyser for at åbne og analysere data. Den dataanalyse interfacet er opdelt i tre vinduer: Resultater Tabel, godt Selector og behandlede data / grafisk display.
- I det behandlede data vinduet, koncentrationsbesvær data for hvert mål vises i brøndene i pladen kort og er tabuleret i Resultater Tabel. Klik Koncentration at visualisere data i koncentration plots.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Til vores ddPCR analyse, vi studerede BRAF V600E mutation FFPE referencestandard cellelinjer. Dråben læser forbinder til en bærbar computer, der kører dataanalyse software. Hver enkelt dråbe defineres på grundlag af fluorescerende amplitude som værende enten positiv eller negativ. De oplysninger, som producenten software giver også mulighed en brugerdefineret cutoff skal indtastes for at definere grænsen mellem de positive og negative dråber. Antallet af positive og negative dråber i en prøve anvendes til at beregne koncentrationen af målet i form af kopier / pl.
Fluorescens blev detekteret og forarbejdet til et todimensionalt punktdiagram display, brugerdefineret software blev anvendt til at drage passende porte for hver dråbe endpoint klynge, og antallet af dråber inden for hver port blev talt. Som vist i figur 3A, smådråber repræsenteret ved blå prikker (FAM fluorescens signal) over cut-off line for alle samples (lyserød linje) var positive for muteret BRAF V600E. Dråber repræsenteret ved blå prikker i BRAF WT (NTC, bane 2) prøve kan skyldes en ikke-specifikt signal (falsk positiv). Falske positive signaler (BRAF WT) blev normaliseret med andre mutation prøver. Som vist i figur 3B, er WT BRAF dråber repræsenteret ved grønne prikker (VIC fluorescenssignal). I begge plots er de grå prikker nederst betragtes som fluorescens baggrund. De samlede mutante allelfrekvenserne blev beregnet under anvendelse af data vist i figur 3C, baseret på den relative procentdel af WT BRAF og BRAF V600E skabeloner påvises. Opnåede ddPCR resultater indeholder dråben begivenhedstælling og beregnet vildtype og mutant DNA-molekyle tæller for BRAF V600E (50%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, 0,1% og 0,05%) prøver beregnet ved hjælp af nedenstående ovennævnte formel.
% Af Mutanthyppighed = (Mutantcopy / (Vildtype + mutant kopi)) x 100
Følgelig blev BRAF V600E mutationer identificeres og verificeres med referencestandard (BRAF WT). Defineret BRAF V600E mutation allele frekvenser på 50%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, 0,1% og 0,05% blev anvendt til at teste følsomheden og reproducerbarheden af ddPCR systemet. Fra vores analyse med kendte prøvekoncentrationer, bekræftede vi, at ddPCR er i stand til at påvise så lavt som 0,05% af BRAF V600E mutation. Afsløring af falske positive mutant tæller i NTC eller WT muligvis skyldes ikke-specifik probe hydrolyse som rapporteret tidligere 14. Påvisning af mere end to kopier i en prøve er blevet betragtet som positive i tumorvæv 15.
Figur 1. Skematisk fremstilling beskriver reagens og prøve lastning som forberedelse til aut omated DNA-ekstraktion instrument. Placer prøverne i et luftfartsselskab stativer og dispensere reagenserne i tilsvarende trug som nævnt. Anvender automatiseret TPS protokol, der understøtter flere prøvetyper, leverer præcise og pålidelige resultater med maksimal produktivitet. Re-trykt med tilladelse fra Siemens Healthcare Diagnostics. (høflighed af Siemens Healthcare Diagnostics).
Figur 2. Skematisk afbildning af Vævspræparat System Arbejdsgang for automatiseret DNA-ekstraktion. Fuldautomatisk DNA-isolering procedure for FFPE væv sektioner herunder negative selektionssystemer trin af paraffin, vævsrester fjernes og positiv selektion trinnene binding og eluering er vist. Re-trykt med tilladelse fra Siemens Healthcare Diagnostics. (høflighed af Siemens Healthcare Diagnostics).
Figur 3. Anvendelse af ddPCR system til præcis kvantificering af BRAF V600E mutation i FFPE reference- standard celle line prøver. (A, B) Visualisering af positive fluorescensamplituderne i 1D plots (1dot -1droplet). Blå prikker (A, FAM positiv) repræsenterer mutant BRAF V600E-positive dråber, mens grønne prikker (B, VIC positiv) repræsenterer WT BRAF -positive dråber. Denne bestemmelse giver mulighed for præcis mutation kvantificering i FFPE referencestandard cellelinjer. Den lyserøde linje er grænsen forskelsbehandlingen mellem positive og negative signaler dråberne. (C) Den fraktionelle overflod plot viser blå markører der indikerer koncentrationen (kopier / ul) i BRAF V600E mutation, ogde grønne markører angiver koncentrationen (kopier / ul) i BRAF (WT). Alle fejlsøjler genereret af dataanalyse software repræsenterer 95% konfidensinterval.
| Reagenser | Volumen (ml) |
| Lysis Buffer | 106 ml |
| Vaskebuffer 1 | 101 ml |
| Vaskebuffer 2 | 72 ml |
| Vaskebuffer 3 | 106 ml |
| Elueringsbuffer | 19 ml |
| Magnetiske perler | 8 ml |
| FFPE buffer | 15 ml |
| Proteinase K | 3,3 ml |
Tabel 1. Samlet volumen af reagenser (TPS-kit), der kræves til DNA ekstraktion med 48 prøver.
| Temperatur | Tid | # Cycles | |
| Enzymaktivering | 95 ° C | 10 min | 1 |
| Denaturering | 94 ° C | 30 sek | 40 |
| Annealing / forlængelse | 60 ° C | 1 min * | |
| Hold | 98 ° C | 10 min | 1 |
| Hold | 4 ° C | Forever | 1 |
| * Justér rampe rate indstillinger til 2-2,5 ° C / sek. Brug et opvarmet låg indstillet til 105 ° C og indstille lydstyrken prøven til 40 pi | |||
Tabel 2. Konventionel PCR termocyklingsbetingelser
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her fremhæver vi anvendeligheden af ddPCR og DNA isolation fra FFPE referencestandard celle line prøver for en bestemt genmutation vurdering. I denne undersøgelse, er TPS automatiseret DNA-isolering anvendte metode, som let kan tilpasses, automatiseret og kan rumme op til 48 forskellige prøver samtidigt, hvilket muliggør større skala eksperimenter og lavere variabilitet. En af begrænsningerne af DNA-isolering i det foreliggende arbejde er, at hver FFPE prøven er unikt og vil variere hinanden i overfladeforurening, mikrobielle flora, og / eller humane genetiske baggrunde. Generelt ekstraherede DNA kvalitet og mængde og succes for hele genomisk DNA-amplifikation afhænger af forskellige parametre før, under og efter ekstraktion. Disse omfatter, type og mængde væv, type fikseringsmiddel anvendes til vævskonservering, varighed fiksering, alder paraffinblokken og opbevaringsbetingelser, samt længden af den ønskede DNA-segment, der skal analyseres <sup> 16. Fjernelse af paraffin fra vævet er den mest kritiske trin for en vellykket ekstraktion som uopløst paraffin fører til dårlig prøve kvalitet. Under dråben generation, skal der drages omsorg for at forhindre bobledannelse - dette er endnu et vigtigt skridt for en vellykket mutationspåvisning. I betragtning af prøve til prøve variation, der måtte opstå mellem befolkningerne sample og baseret på motivet af eksperimentet, kan visse ændringer i proceduren være forpligtet til at opnå det ønskede resultat.
En anden fordel er, at DNA-isolering og ddPCR gennemføres ved hjælp af automatiske systemer i denne protokol, og dermed er der er ubetydelig fejl, og brugerens medvirken kræves er meget minimal. Isolering af hel-genom-amplificeret DNA fra paraffinindlejrede væv / celler blev opnået ved anvendelse TPS. En af ulemperne ved at anvende automatiseret DNA-isolering system er, at det ikke er omkostningseffektiv at bruge små antal prøver. I stedet for denne automatiske step, andre standard DNA isoleringsproceduren kunne også udføres for begrænsede prøver
En nylig undersøgelse angivet, at bruge dråbe digital PCR (ddPCR) er i stand til at bestemme den relative kopiantal af specifikke genomiske loci, selv i nærværelse af blandet normalt væv opnået fra FFPE væv. Ved at bruge en kontrol fortyndingsrække, Nadauld, L. et al. Bestemmes detektionsgrænserne (LOD) for ddPCR assay og indberettet sin forbedret følsomhed på minimale mængder af DNA i forhold til standard realtids-PCR 17. Her bliver FFPE referencestandard cellelinjer der anvendes til at påvise mutationen afsløring evne ddPCR systemet. De ddPCR systemets resultater indikerede mulighed for at påvise sjældne mutation allele frekvenser ned til 0,05% mutation. Kollektivt indikerer disse data, at ddPCR systemet muliggør også kvantitativ analyse af de procentdele af forskellige mutantalleler og relative forskelle i heterozygot klinisk tumorprøves. Stort antal FFPE prøver kan analyseres for særlige genmutationer samtidigt, og dette er en optimal teknik til befolkningsgrupper brede genetiske undersøgelser.
Endelig skal det tages i betragtning, at de mutationsfrekvenser er repræsenteret her, er absolut kvantificering og bør ikke betragtes som relativ værdi mutation sats eller frekvens. ddPCR udlæsning giver absolut kvantificering af mål-DNA mutation. Disse værdier kan anvendes til validering mutationsfrekvenser af prøver fremstillet under de samme betingelser, og sekventeret i samme region. Men disse absolutte værdier er reproducerbare og kan anvendes til kvantitativ sammenligning af mutation distribution og frekvens, når optimale parametre styres. Afslutningsvis har ddPCR nylig opstået som en robust værktøj, der giver absolut kvantificering af nukleinsyrer i FFPE og biopsi prøver og kan også duplex med reference- analyser til bestemmelse af enten ingenrmalized udskrift koncentrationer eller DNA-kopi nummer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Myung Ryuri Åh, Si Eun Kim, og Young Deug Kim er medarbejdere i ABION CRO.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af F & U-program for Society of National Research Foundation (NRF), finansieret af Ministeriet for Videnskab, IKT & fremtidige planlægning (Grant nr 2013M3C8A1075908).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument | Siemens | 10701001 | Automated DNA isolation instrument |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment | 621BR17718 | ||
| PX1 PCR plate sealer | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| DNA isolation kit | |||
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632398 | |
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632399 | |
| CO-RE tips | Siemens | ||
| ddPCR mutation analysis | |||
| ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | 2X concentration |
| DG8 cartridge | Bio-Rad | BR186-4008 | |
| Droplet Generator oil | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| Gasket | Bio-Rad | BR186-3006 | |
| Droplet reader oil | Bio-Rad | BR-186-3004 |
References
- Vogelstein, B., et al. Genetic alterations during colorectal-tumor development. The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417, 949-954 (2002).
- Solit, D. B., et al. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition. Nature. 439, 358-362 (2006).
- Wong, K. K. Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway. Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).
- Brose, M. S., et al. BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma. Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).
- Wang, L., et al. BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair. Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).
- Hindson, B. J., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification. Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).
- Jones, M., et al. Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'. Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).
- Strain, M. C., et al. Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR. PloS one. 8, e55943 (2013).
- Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR. Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).
- Bizouarn, F. Clinical applications using digital PCR. Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).
- McDermott, G. P., et al. Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR. Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).
- Milbury, C. A., et al. Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations. Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).
- Zhu, G., et al. Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer. The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).
- Fan, H., Gulley, M. L. DNA extraction from paraffin-embedded tissues. Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).
- Nadauld, L., et al. Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR. Translational medicine. 2, (2012).
