Summary
Målet med denne videoen er å vise hvordan man skal utføre automatisert DNA ekstraksjon fra formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) referanse standard cellelinjer og digital dråpe PCR (ddPCR) analyse for å påvise sjeldne mutasjoner i en klinisk setting. Oppdager mutasjoner i FFPE- prøvene viser den kliniske nytten av ddPCR i FFPE- prøver.
Introduction
Akkumulering av genetiske mutasjoner i viktige regulatoriske gener endrer normal celle programmering som celledeling, differensiering og overlevelse, som fører til kreft en. RAS-RAF-MAP kinasereaksjonsveien medierer cellulære responser til vekstsignaler. Onkogene BRAF mutasjoner kan skyldes driver mutasjoner i BRAF-genet, noe som kan føre til at BRAF onkoprotein å bli overaktiv 2. Mutasjoner i BRAF genet også resultere i overaktiv nedstrøms signalisering via MEK og ERK 3, som i sin tur fører til overdreven cellevekst og proliferasjon uavhengig av vekstfaktor-medierte regulering 4-6.
Flere verktøy er tilgjengelige for DNA mutasjon profilering, for eksempel kvantitative sanntids BRAF V600E mutasjoner i formalinfiksert, parafininnstøpte (FFPE) referanse standard cellelinjer ved ddPCR. ddPCR er en PCR-basert metode for absolutt kvantifiseringtilby høyere nøyaktighet i forhold til konvensjonelle kvantitativ real-time PCR (qPCR) 7,8. ddPCR gir også høyere oppløsningsevne og nøyaktighet for påvisning av sjeldne mutasjoner i DNA-maler, slik at mer informativ kreftforskning og diagnose 9. Ytterligere fordeler av ddPCR over konvensjonelle qPCR inkludere sin økt følsomhet og nøyaktighet når man studerer lav mal kopiantall 10-12. Heri er en protokoll for automatisk å ekstrahere DNA fra FFPE referansestandardcellelinjer, etterfulgt av bestemmelse av nærvær eller fravær av BRAF mutasjoner V600E av ddPCR demonstrert. Bruken av programvare for dataanalyse og en grafisk fremstilling av resultatene er også beskrevet. Hele prosedyren er relativt enkel og helt avhengig av antallet prøver som skal profilerte og antall konvensjonelle PCR og ddPCR maskiner tilgjengelig.
Den følgende protokollen beskriver standardprosedyrer for BR AF V600E-positive FFPE referansestandardcellelinjer (HD598, HD593, HD617, HD273 og villtype (wt)) blir utført på en helt automatisk instrument ved bruk av protokollen Tissue Fremstilling System (TPS). Deretter blir isolerte DNA-prøver analysert for tilstedeværelse av BRAF mutasjoner V600E hjelp ddPCR system. Målrettet mutasjon analysen utføres etter at alle prøver er profilert og dataene er blitt lastet inn i dataanalyseprogramvare. Avhengig av antall av sampler / grupper undersøkt, dataanalyse kan kreve fra en til flere timer. Den eksperimentelle del av metodikk krever nøyaktighet ved håndtering av DNA ogrological Pipettes og pipetter, en Jove Science Education video som forklarer mer om om sammenheng med pipettering "> pipettering i 96 brønners plater, mens dataanalyse er utført ved hjelp av programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DNA Extraction fra FFPE Reference Standard cellelinjer
Merk: For denne prosedyren, ble DNA-ekstraksjon utført fra FFPE referanse standard cellelinjer (HD598, HD593, HD617, HD273 og hvete (WT)) bruker FFPE Tissue DNA isolering kit som beskrevet i protokollen under. Automatisert DNA ekstraksjon ble oppnådd ved å følge produsentens instruksjoner for total DNA isolering.
- Ved hjelp av en mikrotom og den opprinnelige FFPE blokken, manuelt fremstille nye seksjoner forut for DNA-ekstraksjon og analyse, i henhold til etablerte prosedyrer. Sikre at prøven inngang for vevet seksjon (er) analyserte ikke overstiger en samlet tykkelse på 10 um, og at overflatearealet ikke overstiger 600 mm 2 for en enkelt seksjon.
1.2 TPS protokollen
Merk: De volumer som er vist i tabell 1 samsvarer med det minimum som kreves for å behandle 48 prøver, og fremgangsmåtenvist er i samsvar med TPS retningslinjer. Før eksperimentet startes slå seg ned i FFPE-prøver i e-røret ved sentrifugering ved 600 xg, for å unngå tap av prøver i løpet av automatisert program.
- Slå på automatisert DNA isolering instrument og datamaskin. Åpne Kjør kontroll programvare og sette inn en automatisk belastning skuffen inn i TPS dekk lasteområde.
- Dispensere reagenser inn i de tilsvarende fordypninger slik som vist i figur 1.
- Plasser de 4 prøvene (BRAF WT, BRAF V600E 50%, 5% og 1%) i stativene prøve selskaper.
- Plasser tips bokser i rennene i kolonnene 2 og 3 og sjekk tipsene for tilstedeværelsen av mer enn ett filter per tips, som vil avbryte kjøringen.
- Sikre riktig blanding av lyseringsbuffer og vaskebufferen ved å snu dem 3-5 ganger og laste dem inn i de respektive bunnene i kolonne 4 (figur 1).
- Etter å snu for noen ganger eller mild vortexing, laste elueringsbuffer, magnetiske kuler, og FFPE buffer i de små karene i kolonne 5, forlater en slot tomt der det er angitt (figur 1, tabell 1).
- Legg i en 2 ml dyp brønn plate (DWP) på plate carrier (figur 1).
- Utfør følgende siste trinnene før du starter et løp:
- Korken alle rør og reagenser trau. Bekrefte at tilstrekkelig kapasitet er tilgjengelig i flytende avfallsflasken. Bekrefte at den faste avfallsflasken er tom og foret med et biologisk bag. Bekreft at spissen utløserplaten er sentrert i avfallet forsamlingen.
- Lukk frontdekselet.
- Start programvaren. Åpne NA_Prep_Main_MLSTARlet.med filen.
- Klikk "Start". Instrumentet status vil bytte fra inaktiv til å kjøre.
- Skriv inn antall prøver for denne kjøringen. Velg ønsket metode for denne kjøringen (DNA = 0). Går inn i posisjonen til den første høye volUme tips, velge "1" hvis alle skuffene er fulle. Skriv inn posisjonen til den første standarden volum tips, velge "1" hvis alle skuffene er fulle.
Merk: Apparatet vil da kjøre gjennom automatiserte skritt uten brukermedvirkning. En detaljert arbeidsflyt er vist i figur 2. Når eksperimentet er ferdig, blir reagensen avfall og tips injisert inn i avfallssammenstillingen. - Kvantifisere renset genomisk DNA ved å bruke en fluorometrisk metode.
Note: DNA-prøver som inneholder en minimal konsentrasjon på 3,3 ng / mL utsettes for ddPCR analyse (seksjon 2).
2. DNA Mutation Profilering: ddPCR Protocol
Merk: Protokollen for DNA mutasjon profilering består av 3 hovedtrinn: 1) dråpe generasjon, 2) Konvensjonell PCR-amplifisering, 3) Dråpe lesing og 4) DNA-mutasjon profilering.
2,1. Droplet generasjon
Merk: ddPCR SuperMix eranbefales for ddPCR, da denne blandingen inneholder reagenser som er nødvendig for dråpe-generasjon.
- For å unngå forurensning, følger standardregler, for eksempel hansker, med en ren PCR hette, rene pipetter, og lav proteinbindings rør.
- Sikre at minimum konsentrasjon av humant genomisk DNA-prøve er 3,3 ng / mL. Merk: Mengden av renset DNA-prøve konsentrasjon vil variere basert på analyse av% mutasjonsfrekvens gjenkjenning.
- Montere reaksjonsblandingene i 96-brønners PCR-plater. Tine og likevekt reaksjonskomponentene til RT. Forbered PCR reaksjoner ved å kombinere 2X ddPCR SuperMix (10 mL) og 20 primere (forover og bakover, 900 nM) og probe (250 nM) med hver renset DNA-prøve (66ng / 2 ul) utgjør 20 ml med destillert vann (som pr dråpegeneratoren protokoll)
- Vortex blandingen grundig for å sikre homogenitet og kort sentrifuge for å samle opp innholdet i bunnen av røret før dispensering. Load 20 & #181; l på kassetten for dråpedannelse.
- Drift av dråpe generator, per produsentens anbefalte protokoll
- Sett patronen i holderen med hakket i kassetten sitter på øvre venstre side av holderen. Tilsett 20 ul reaksjonsblanding inneholdende prøvene inn i midten, og 70 ul av generator olje inn i de nedre brønnene.
- Fest pakningen over toppen av patronen. Sørg for at pakningen er sikkert hekta på begge ender av holderen; ellers vil tilstrekkelig trykk for dråpe generering ikke oppnås.
- Åpne dråpegenerator ved å trykke på den grønne knappen på toppen av instrumentet og sett blekkpatronen. Når holderen er i riktig posisjon, både strøm (venstre til høyre) og holder (midten til høyre) lampene lyser grønt.
- Trykk den øverste knappen på instrumentet igjen for å lukke døren og sette i gang dråpe generasjon. Merk: Når du trykker på button, en manifold posisjonerer seg over uttaket brønner, tegning olje og prøver gjennom microfluidic kanaler, der dråpene er opprettet. Dråper strømmer inn i dråpen brønnen, hvor de akkumuleres. Dråpen indikatorlys (til høyre) blinker grønt etter 10 sek for å indikere at dråpe generasjon er i gang.
- Når dråpe generasjon er ferdig, alle 3 indikatorlamper skifte til grønt; åpne døren ved å trykke på knappen, og fjerne holderen fra enheten. Fjern engangspakning fra holderen og kast den. Merk: Den øverste brønner på patronen inneholde dråper, og de midtre og nedre brønnene er nesten tom, med en liten mengde restolje.
2,2. Forberedelse til PCR
- For hver prøve Pipetter ut 40 ul av dråpe innholdet fra toppen godt patronene i en enkelt brønn av en anbefalt 96-brønners PCR-plate som angitt i produsentens protokoll instrument. Neite: Ved hjelp av en flerkanals pipette er ideelle for overføring av dråper emulsjoner. Sakte og forsiktig aspirasjon av dråper anbefales å redusere dråpe klipping under overføringer.
- Tett PCR plate med folie umiddelbart etter overføring dråper for å unngå fordampning. Bruk perforerbare folie plate seler som er kompatible med PCR plate forsegler og nålene i dråpe leseren. Følg instruksjonene i PCR plate sealer instruksjonsmanual.
- Innstill plateforsegler temperaturen til 180 ° C og tiden til 5 sek.
- Trykk på pilen for å åpne skuffen døren. Plasser støttekloss på brettet med 96 brønner siden opp. Plasser 96-brønn plate på støtteblokken og sikre at alle platebrønner er innrettet med underlagsblokken.
- Dekk til 96-brønners plate med ett ark av perforerbar folieforseglingen. Når 96-brønns plate blir sikret på støttekloss og dekket med gjennomhull folieforseglingen, berører forseglingen knappen. Brettet vil stengeog varmforsegling vil starte.
- Når varmforsegling er fullført, åpner døren automatisk; fjerne platen fra varmen blokk for termisk sykling og deretter fjerne varmen blokken.
- Pass på at alle brønnene i platen er forseglet ved å sjekke at fordypninger i folie er lett synlig i løpet av hver brønn. Når forseglet, er platen klar for termisk sykling.
- Når dråpene er fjernet, trykker låsene på kassettholderen for å åpne den. Fjern den tomme beholderen og kast den.
- Utføre konvensjonelle PCR-amplifisering ved å følge de parametre som er beskrevet i tabell 2.
2.3 Droplet lesing (som per produsentens anbefalte protokoll)
Merk: Etter PCR-amplifikasjon av nukleinsyre-målet i dråpene, analyserer hver dråpe individuelt ved hjelp av en to-fargedeteksjonssystem 13 dråpe leseren instrumentet. Vi vanligvis satt til å oppdage FAM end VIC reporter fluorophores.
- Klikk "Flush system" for å prime dråpen leseren og gjøre den klar for ddPCR analyse.
- Laste platen inn i dråpe leser og klikk "start". Dråpe leseren aspirerer hver prøve, singulates dråpene, og bekker dem i én fil forbi en to-farge detektor. Detektoren leser dråpene til å nummerere positive og negative prøver.
- Når dråpe lesing er fullført, åpne døren og fjerne platen holderen fra enheten. Fjern 96-brønns PCR plate fra holderen og kast den.
- For riktig vedlikehold, skifte dråpe leseren olje og tømme avfallsbeholderen etter behov. Tilsett 50 ml 10% blekemiddel til avfallet flasken for å hindre mikrobiell vekst.
2.4 DNA mutasjon profilering (som per produsentens anbefalte protokoll)
Merk: PCR-positive og PCR-negative dråper regnes å gi absolutt quantificasjon av målet BRAF V600E DNA mutasjoner i digital form, ved hjelp av dataanalyse programvare.
- Klikk på Oppsett for å legge inn informasjon om de prøver, analyser og eksperimenter.
- I Setup vinduet, legger en plate (filename.qlp), klikk deretter Analyser for å åpne og analysere dataene. Dataanalysen Grensesnittet er delt inn i tre vinduer: Resultater Tabell, Well Selector og prosesserte data / grafisk display.
- I Bearbeidet data vinduet, konsentrasjonsdata for hvert mål vises i brønnene i kart plate og er oppført i resultattabellen. Klikk Konsentrasjon å visualisere data i konsentrasjons plott.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For vår ddPCR analyse, studerte vi BRAF V600E mutasjon FFPE referanse standard cellelinjer. Dråpen leseren kobles til en bærbar datamaskin som kjører dataanalyse programvare. Hver enkelt dråpe er definert på basis av fluoriserende amplitude som å være enten positiv eller negativ. Programvaren som leveres av produsenten gir også en brukerdefinert cutoff oppgis å definere terskelen mellom de positive og negative dråper. Antallet av positive og negative dråper i en prøve blir anvendt til å beregne konsentrasjonen av target i form av kopier / ul.
Fluorescens ble påvist og behandlet i en to-dimensjonal spredningsdiagram display, tilpasset programvare ble anvendt for å trekke de riktige porter for hver dråpe endepunkt klynge, og antallet dråper innenfor hver port ble tellet. Som vist i figur 3A, igjen dråper representert ved prikker (FAM blå fluorescens-signal) over cut-off line for alle samples (rosa linje) var positive for mutert BRAF V600E. Dråper som representeres av blå punkter i BRAF WT (NTC, felt 2) Prøven kan være på grunn av et ikke-spesifikt signal (falsk positiv). Falske positive signaler (BRAF WT) ble normalisert med andre mutasjons prøver. Som vist på figur 3B, blir WT BRAF dråper representert ved prikker (VIC grønne fluorescens signal). I begge plottene er de grå punkter på bunnen anses som fluorescensen bakgrunn. Den samlede mutant allel frekvenser ble beregnet ved hjelp av dataene som er vist i figur 3C, basert på de relative prosenter av WT BRAF og BRAF V600E maler oppdaget. Innhentet ddPCR resultater inneholde dråpehendelses teller og beregnet villtype og mutant DNA-molekyl teller for BRAF V600E (50%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, 0,1% og 0,05%) prøver beregnet ved hjelp av nedenfor nevnte formel.
% Av Mutant frekvens = (Mutantcopy / (hvete + Mutant kopi)) x 100
Følgelig ble BRAF V600E mutasjoner identifisert og bekreftet med referansestandard (BRAF WT). Definert BRAF V600E mutasjon allele frekvenser på 50%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, 0,1% og 0,05% ble brukt for å teste sensitivitet og reproduserbarhet av ddPCR system. Fra vår analyse med kjente prøve konsentrasjoner, bekreftet vi at ddPCR er i stand til å oppdage så lavt som 0,05% av BRAF V600E mutasjon. Påvisning av falsk positiv mutant telling i NTC eller WT kan muligens være på grunn av ikke-spesifikk probe hydrolyse som rapportert tidligere 14. Deteksjon av mer enn to kopier i en prøve har vært ansett som positiv i tumorvev 15.
Figur 1. Skjematisk fremstilling beskriver reagens og prøve lasting i forberedelsene til aut omated DNA ekstraksjon instrument. Plasser prøvene i en transportør stativer og dispensere reagensene inn i tilsvarende trau som nevnt. Ansette automatisert TPS-protokollen som støtter flere prøvetyper, leverer nøyaktige og pålitelige resultater med maksimal produktivitet. Re-trykt med tillatelse fra Siemens Healthcare Diagnostics. (courtesy of Siemens Healthcare Diagnostics).
Figur 2. Skjematisk fremstilling av Vevspreparering System Arbeidsflyt for automatisert DNA-ekstraksjon. Helautomatisk DNA isoleringsprosedyren for FFPE vev seksjoner inkludert negative seleksjons trinn av parafin, vev rusk fjerning og positive seleksjons trinnene bindende og eluering vises. Re-trykt med tillatelse fra Siemens Healthcare Diagnostics. (courtesy of Siemens Healthcare Diagnostics).
Figur 3. Bruk av ddPCR system for nøyaktig kvantifisering av BRAF V600E mutasjon i FFPE referanse standard cellelinje prøver. (A, B) Visualisering av positive fluorescens amplituder i 1D tomter (1dot -1droplet). Blå prikker (A, FAM positive) representerer mutant BRAF V600E-positive dråper, mens grønne prikker (B, VIC positive) representerer WT BRAF -positive dråper. Denne bestemmelsen gir presise mutasjon kvantifisering i FFPE referanse standard cellelinjer. Den rosa linje er den diskriminerende terskel mellom positive og negative signaler på dråpene. (C) Den fraksjon overflod Plottet viser blå markører som angir den konsentrasjon (kopier / mikroliter) i BRAF V600E mutasjon, ogde grønne markørene indikerer konsentrasjonen (kopier / ul) av BRAF (WT). Alle feilfelt som genereres av dataanalyse programvare representerer 95% konfidensintervall.
| Reagenser | Volum (ml) |
| Lysis Buffer | 106 ml |
| Wash Buffer 1 | 101 ml |
| Wash Buffer 2 | 72 ml |
| Wash Buffer 3 | 106 ml |
| Elueringsbuffer | 19 ml |
| Magnetiske kuler | 8 ml |
| FFPE buffer | 15 ml |
| Proteinase K | 3,3 ml |
Tabell 1. Totalt volum av reagenser (TPS kit) som kreves for DNA ekstraksjon med 48 prøver.
| Temperatur | Tid | # Cycles | |
| Enzymaktivering | 95 ° C | 10 min | 1 |
| Denaturering | 94 ° C | 30 sek | 40 |
| Gløding / utvidelse | 60 ° C | 1 min * | |
| Hold | 98 ° C | 10 min | 1 |
| Hold | 4 ° C | Forever | 1 |
| * Juster rampe rente innstillinger til 2-2,5 ° C / sek. Bruke et oppvarmet lokk satt til 105 ° C og satt prøvevolumet til 40 ul | |||
Tabell 2. Konvensjonell PCR termo vilkår
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her uthever vi anvendelsen av ddPCR og DNA isolert fra FFPE referanse standard cellelinje prøver for en spesifikk genmutasjon vurdering. I denne studien er TPS automatisert DNA metoden som brukes som lett kan tilpasses, automatisert, og kan huse opptil 48 forskjellige prøver samtidig, noe som åpner for større skala eksperimenter og lavere variabilitet. En av begrensningene i den av DNA i den foreliggende arbeid er at hver FFPE prøven er unik, og vil variere med hverandre i overflateforurensninger, mikrobielle flora og / eller humane genetiske bakgrunner. Generelt ekstraherte DNA kvalitet og kvantitet og effekten av hele genomisk DNA-amplifikasjon er avhengig av flere parametere før, under og etter ekstraksjon. Disse inkluderer, typen og mengden av vev, type bindemiddel som brukes for konservering vev, varighet av fiksering, alder parafin blokk og lagringsbetingelser, så vel som lengden av den ønskede DNA-segmentet som skal analyseres <sup> 16. Fjerning av parafin fra vevet er den mest kritiske trinnet for vellykket ekstraksjon som uoppløst parafin fører til dårlig kvalitet prøven. Under dråpen generasjon, må man sørge for å unngå bobledannelse - dette er en annen viktig skritt for vellykket mutasjon deteksjon. Tatt i betraktning den prøve til prøve variasjoner som måtte oppstå mellom prøve populasjoner og basert på motiv av forsøket, kan visse modifikasjoner i fremgangsmåten være nødvendig for å oppnå ønsket resultat.
En annen fordel er at DNA-isolering og ddPCR blir utført ved bruk av automatiserte systemer i denne protokollen, og dermed er det ubetydelig feil og brukerintervensjon kreves er svært minimal. Isolere hel-genom-DNA amplifisert fra parafininnstøpte vev / celler ble oppnådd ved hjelp av TPS-systemet. En av ulempene med å bruke automatisert DNA isolert system er at det ikke er kostnadseffektivt å benytte lite antall prøver. I stedet for denne automatiserte step, andre standard DNA isolering prosedyren kan også utføres for begrensede prøver
En fersk studie uttalte at det å bruke dråpe digital PCR (ddPCR) er i stand til å bestemme den relative kopi antall spesifikk genomisk loci selv i nærvær av intermingled normalt vev hentet fra FFPE- vev. Ved å bruke en styre fortynningsrekke, Nadauld, L. et al., Bestemt påvisningsgrensene (LOD) for ddPCR analysen og rapporterte dets forbedret følsomhet i minimale mengder av DNA sammenlignet med standard real-time PCR 17. Her blir FFPE referansestandardcellelinjer som benyttes for å demonstrere mutasjon deteksjonsevnen til ddPCR system. De ddPCR systemet Resultatene indikerte muligheten for å detektere sjeldne mutasjon alleliske frekvenser ned til 0,05% mutasjon. Til sammen indikerer disse data at ddPCR system gjør det også mulig kvantitativ analyse av de prosentandeler av forskjellige mutante alleler og relative forskjellene i heterozygot klinisk tumorprøves. Et stort antall FFPE-prøver kan bli analysert for spesifikke mutasjoner samtidig, og dette er en optimal teknikk for befolknings brede genetiske studier.
Til slutt bør det tas hensyn til at mutasjonen frekvensene er representert her er absolutt kvantifisering og skal ikke betraktes som forholdet mellom verdien av mutasjonshastighet eller frekvens. ddPCR avlesning gir absolutt kvantifisering av target DNA mutasjon. Disse verdiene kan brukes til å validere mutasjons frekvenser på prøver fremstilt under de samme betingelser, og sekvensert over samme region. Men disse absolutte verdier er reproduserbare, og kan anvendes for kvantitativ sammenligning av mutasjons fordeling og frekvens når optimale parametre blir styrt. I konklusjonen, har ddPCR nylig dukket opp som et robust verktøy som gir absolutt kvantifisering av nukleinsyrer i FFPE- og biopsiprøver og også kan tosidig med referanse analyser for bestemmelse av enten ingenrmalized transkripsjon konsentrasjoner eller DNA kopi nummer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Myung Ryuri Oh, Si Eun Kim, og Young Deug Kim er ansatte i ABION CRO.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av FoU-programmet for Society of National Research Foundation (NRF), finansiert av departementet for vitenskap, IKT & Future Planning (Grant No. 2013M3C8A1075908).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument | Siemens | 10701001 | Automated DNA isolation instrument |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment | 621BR17718 | ||
| PX1 PCR plate sealer | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| DNA isolation kit | |||
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632398 | |
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632399 | |
| CO-RE tips | Siemens | ||
| ddPCR mutation analysis | |||
| ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | 2X concentration |
| DG8 cartridge | Bio-Rad | BR186-4008 | |
| Droplet Generator oil | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| Gasket | Bio-Rad | BR186-3006 | |
| Droplet reader oil | Bio-Rad | BR-186-3004 |
References
- Vogelstein, B., et al. Genetic alterations during colorectal-tumor development. The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417, 949-954 (2002).
- Solit, D. B., et al. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition. Nature. 439, 358-362 (2006).
- Wong, K. K. Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway. Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).
- Brose, M. S., et al. BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma. Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).
- Wang, L., et al. BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair. Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).
- Hindson, B. J., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification. Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).
- Jones, M., et al. Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'. Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).
- Strain, M. C., et al. Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR. PloS one. 8, e55943 (2013).
- Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR. Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).
- Bizouarn, F. Clinical applications using digital PCR. Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).
- McDermott, G. P., et al. Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR. Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).
- Milbury, C. A., et al. Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations. Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).
- Zhu, G., et al. Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer. The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).
- Fan, H., Gulley, M. L. DNA extraction from paraffin-embedded tissues. Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).
- Nadauld, L., et al. Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR. Translational medicine. 2, (2012).
