Summary
يصف هذا البروتوكول وسيلة لتشريح، والتعامل معها بشكل تجريبي وإإكسبلنتس الشبكية ثقافة بأكملها من أجنة الدجاج. ثقافات يزدرع هي مفيدة عند نسبة نجاح عالية والفعالية واستنساخ هناك حاجة لاختبار آثار البلازميدات ل electroporation و / أو المواد كاشف، أي مثبطات الأنزيمية.
Abstract
شبكية العين هي نموذج جيد للجهاز العصبي المركزي النامية. حجم كبير للعين والأهم من ذلك الوصول للتلاعب التجريبية في البيضة / في الجسم الحي يجعل من الدجاج شبكية العين الجنينية نموذج تجريبي تنوعا وفعالة جدا. على الرغم من أن شبكية العين الدجاج سهلة لاستهداف في البيضة عن طريق الحقن داخل العين أو Electroporation لل، والتركيز الفعال والدقيق للالكواشف داخل شبكية العين قد يكون من الصعب السيطرة عليها بشكل كامل. قد يكون هذا بسبب الاختلافات في موقع الحقن الدقيق، والتسرب من العين أو نشرها متفاوتة من المواد. وعلاوة على ذلك، وتواتر التشوهات والوفيات بعد التلاعب الغازية مثل Electroporation للمرتفع إلى حد ما.
يصف هذا البروتوكول والبيضة السابقين تقنية لزراعة إإكسبلنتس شبكية العين كلها من أجنة الدجاج ويوفر طريقة للتعرض للرقابة في شبكية العين إلى الكواشف. بروتويصف العقيد كيفية تشريح، تجريبيا التلاعب، وإإكسبلنتس الشبكية ثقافة بأكملها من أجنة الدجاج. لل explants يمكن تربيتها لحوالي 24 ساعة وأن تخضع للتلاعب مختلفة مثل Electroporation لل. المزايا الرئيسية هي أن التجربة ليست متوقفة على بقاء الجنين وأن تركيز الكاشف قدم يمكن أن تختلف والسيطرة من أجل تحديد وتحسين التركيز الفعال. وعلاوة على ذلك، والتقنية هي سريعة ورخيصة وجنبا إلى جنب مع ارتفاع نسبة النجاح التجريبية، فإنه يضمن استنساخه النتائج. وينبغي التأكيد على أنه بمثابة مكمل ممتاز لتجارب أجريت في البيضة.
Introduction
شبكية العين هي جزء من الجهاز العصبي المركزي وأنه هو، مع بساطتها النسبية والهندسة المعمارية الخلوية تتميز جيدا، وهذا نموذج شعبية لدراسة تطوير النظام العصبي المركزي. عين الجنين الدجاج كبيرة نسبيا بالمقارنة مع بقية الجنين. وبالتالي فإنه يمكن الوصول إليه بسهولة في البيضة للتلاعب التجريبية، مثل الحقن أو Electroporation لل، وبمثابة أداة ممتازة لاكتساب المعرفة حول خلايا شبكية والبيولوجيا التطورية في الجسم الحي. على الرغم من هذه المزايا الرئيسية، ويمكن البقاء على قيد الحياة من الأجنة تكون منخفضة عند التجارب هي الغازية مثل مع electroporations، تكرار الحقن، أو التلاعب التجريبية مجتمعة.
Electroporation للمن البلازميدات الحمض النووي في الجنين الدجاج في البيضة هي تقنية مهمة وراسخة 1. انها تسمح لوصفها من الخلايا العصبية والبحث عن المفقودين من مصير المحمولة، فضلا عن مساحات العصبية في NERV المركزينظام الأوس ويسمح للتعبير عن الجينات خارج الرحم لتحليل وظيفة البروتين في الجسم الحي. وقد استخدمت هذه التقنية للدراسات الأنبوب العصبي 2، الدماغ المؤخر 3، وشبكية العين 4. Electroporation للمن شبكية العين الجنينية في البيضة لديه بعض الصعوبات التجريبية التي ترتبط الوضع في الجسم الحي. موقف العين، ويرجع ذلك إلى لطي الجمجمة الجنين، نسبيا قريبة إلى القلب. هذا القرب يزيد من خطر الإصابة بالسكتة القلبية بعد Electroporation لل، وتتزايد المخاطر مع تزايد عمر الجنين. وعلاوة على ذلك، للوصول إلى العين، فمن الضروري لفتح الأغشية الجنينية، مما يزيد من خطر النزيف والتشوهات وانخفاض الجدوى لاحقة. عند اختبار وتحسين البلازميد الحمض النووي الجديد في كثير من الأحيان دون نتيجة المظهرية معروفة، هذه القيود قد يقلل من فعالية وقوة الأسلوب حتى لالتجريبي من ذوي الخبرة. كما وردت في هذا البروتوكول، وثقافة ثثقب يزدرع الشبكية، الذي يعرف بأنه الشبكية العصبية كاملة مع الظهارة الصبغية إزالتها، وسيلة فعالة أن يكمل في نهج البيضة.
الحقن داخل العين من الكواشف الكيميائية هي سهلة نسبيا لأداء في البيضة. ومع ذلك، فإن التركيز الفعال والدقيق الكواشف حقن داخل الشبكية العصبية قد يكون من الصعب السيطرة عليها بشكل كامل. قد تختلف حجم حقن بسبب التسرب والموقع الدقيق للحقن قد تؤثر على كل من توزيع كاشف داخل العين ونشرها من خلال والجسم الزجاجي. سوف تقلب لها آثار كبيرة على تفسير النتائج عند أي يتم تحديد منحنى الاستجابة للجرعة لمثبطات الانزيم. ولا سيما إذا كان تأثير صغير ونافذة الزمني للتأثير ضيق. وعلاوة على ذلك، سوى عين واحدة يمكن استخدامها من كل جنين عند إجراء التجارب في البيضة وذلك بسبب الآثار النظامية المحتملة عبر مجرى الدمعلى العين المقابل. العمر مطابقة مهم عند دراسة التنمية والتغير الفردي بين المعالجة ويمكن أن يؤدي الأجنة التحكم لتقلب التجريبية إضافية.
لهذه الأسباب، وضعت البيضة السابقين أسلوب يعتمد على إإكسبلنتس الشبكية من أجنة الدجاج، والتي يمكن أن يتعرض العصبية في الشبكية إلى موحدة وتسيطر حالة تجريبية في المختبر. وقد تم تطوير هذا البروتوكول على أساس البروتوكولات السابقة 5-9. إإكسبلنتس الشبكية من مرحلة (ش) 20 (أيام الجنينية [E] 3) لst31 (E7) تم تشريح أجنة الدجاج، مثقف و electroporated مع تركيز الحمض النووي البلازميد محددة أو يتعرض إلى المتوسطة التي تحتوي على تركيز محددة من كاشف كيميائي. تم تنفيذ بروتوكول المعروضة هنا بنجاح في المنشورات الحديثة، وذلك باستخدام العديد من الكواشف الكيميائية المختلفة، بما في ذلك المنظمين من الحمض النووي من التلف الطريق، مثل KU55933، SB 218078، وNSC 109555 ديتوsylate، ودورة الخلية، مثل Cdk1 / 2 المانع الثالث 10،11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم تنفيذ هذا البروتوكول وفقا للتوصيات الواردة في "دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية لجمعية البحوث في الرؤية وطب العيون".
1. التعامل مع البيض وجمع العين
- تخزين البيض ليفورنو البيضاء في 12-14 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 1 في الاسبوع. إذا كانت متوفرة، واستخدام برودة النبيذ تبريد لتخزين البويضات المخصبة.
ملاحظة: درجات الحرارة متجر ارتفاع تؤدي إلى نمو غير طبيعي للأجنة، في حين انخفضت درجات الحرارة إلى زيادة معدل الوفيات. مددت فترة التخزين يزيد على حد سواء وفيات والتنمية غير طبيعي. - احتضان البيض في 37.5 درجة مئوية و 60٪ البيض مرطب حاضنة مع هزاز لطيف على تردد 5 مرات في 24 ساعة.
- إزالة البيض المحتضنة من حاضنة البيض في سن الجنينية المطلوب.
ملاحظة: يتم تحديد عمر الجنين الدجاج لأن الوقت من الحضانة وكما تدل أيام الجنينية (E) أو المراحل (ش)، وفقا لسلسلة من مراحل النمو التي وصفها همبرغر وهاميلتون 12. - وضع البيض المحدد في غطاء تدفق الصفحي. مسح قشر البيض مع 70٪ من الإيثانول لتجنب التلوث من الجنين.
ملاحظة: إجراء كافة الإجراءات تحت ظروف معقمة مع حلول عقيمةhttp://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions والصكوك. - اضغط على جانب من البيض بحزم ضد سطح صلب لاتخاذ اجراءات فتح البيض. وضع المحتوى في طبق بيتري 100 ملم. استخدام ملعقة صغيرة لنقل الجنين الى طبق بيتري 35 ملم تحتوي مسبقا تحسنت (37 ° C) برنامج تلفزيوني 1X لمنع الأنسجة من التجفيف.
- وضع طبق بيتري 35 ملم تحتوي على الأنسجة الجنينية في الصعود إلى مجهر مجهر stereovision تشريح في غطاء تدفق الصفحي. قطع رأس الجنين عن طريق معسر الرقبة مع ملقط غرامة والتخلص من الجسم.
- استخدام ملقط غرامة لإجراء شق عشرالخام الفم، البطني للعين. بدءا من موقع شق، المسيل للدموع مفتوحة الأنسجة المحيطة بالعين بأكملها. قرصت العصب البصري وإزالة العين سليمة من محجر العين. جمع كل من اليسار والعين اليمنى من نفس الجنين للاستخدام إما السيطرة أو العين المعالجة.
- استخدام ملعقة صغيرة لنقل وجهة نظر إلى 35 مم طبق بتري جديدة تحتوي مسبقا تحسنت (37 ° C) برنامج تلفزيوني 1X.
2. إعداد الجامع الشبكية إإكسبلنتس
- استخدام ملقط غرامة لإزالة جميع الأنسجة حول العين بما في ذلك بدأة صلبوية.
ملاحظة: سوف الأنسجة مما يسهل فصل شبكية العين على الجسم الزجاجي والعدسة مع الظهارة الصبغية سليمة (الشكل 1A-B). - استخدام ملقط غرامة لقرصة شق صغير في ظهارة الصباغ في الجزء الظهري من العين دون الإضرار العصبية في الشبكية (الشكل 1C).
- استخدام ملقط غرامة المسيل للدموع بلطف فتح starti الظهارة الصبغيةنانوغرام في موقع شق، وترك العدسة والشبكية كلها تعلق على الجسم الزجاجي (1D الشكل). إبقاء العين في دافئ (37 درجة مئوية) برنامج تلفزيوني 1X لتسهيل إزالة الظهارة الصبغية.
ملاحظة: قد يكون من الصعب الظهارة الصبغية لإزالة، وخصوصا على طول الجسم الهدبي حول التلميذ، في المنطقة الأمامية للعين، وعلى طول الشق المشيمية. ولذلك، فإن بعض ظهارة الصباغ قد يكون غادر على الشبكية العصبية (الشكل 1E-F).
3. علاج الجامعة الشبكية إإكسبلنتس
- Electroporation للمن إإكسبلنتس شبكية العين كلها
ملاحظة: Electroporation للمن إإكسبلنتس شبكية العين كلها لا يمكن أن يؤديها مباشرة بعد الخطوة 2.- إعداد مستنبت تحتوي على 1: 1 DMEM: F12 مزيج العناصر الغذائية، و 10٪ FBS، 10 U / مل البنسلين الستربتومايسين، 5 ميكروغرام / مل الأنسولين، و2 مم L-الجلوتامين.
- قطع 1.5 مل القابل للتصرف كفيت البلاستيك (12،5 مم × 12.5 مم × 45 مم) (أو أي حاوية صغيرة قادرة على اجراء حل 300-400 ميكرولتر) حوالي 8 ملم من أسفل باستخدام منشار غرامة ذات نصول.
- تمييع DNA البلازميد الاختيار في 1xDPBS إلى تركيز النهائي من 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر.
- بدوره على electroporator ومجموعة المعلمات إلى 15 V لST20 - st25 (E3-E4) شبكية العين و 20 V لst26 - st27 (E5) شبكية العين. تعيين نبض يكرر إلى 5 نبضات من 50 مللي ثانية نبض طول مع 1 فترات ثانية. استخدام مولد النبض التي يمكن السيطرة عليها من قبل دواسة القدم على الأرض كما ستكون هناك حاجة بكلتا يديه لعقد الأقطاب في المكان.
- ربط اثنين مجداف على شكل (شقة، بقطر دائري. 4 ملم) أقطاب البلاتين (الشكل 2A) إلى مقبس إخراج على مولد النبض.
ملاحظة: أدلى الأقطاب البلاتين المستخدمة في هذا البروتوكول من قبل ورشة عمل الجامعة. وأدلى الأقطاب الكهربائية من 0.1 ملم لوحة البلاتين "rondelles" (البلاتين الصف: 950 PT / 5 النحاس). وربط 0.8 ملم وايإعادة ومعزول باستخدام الأنابيب البلاستيكية. - نقل بعناية يزدرع الشبكية كله من الخطوة 2.3 إلى كفيت (أو وعاء صغير ما يعادلها) باستخدام ماصة باستير البولي ايثيلين مع طرف قطع للحصول على الحجم الصحيح طرف فتح ليزدرع الشبكية. تجنب استخدام نصائح ماصة كما تميل الشبكية لنعلق على البلاستيك وتمزيق.
- استخدام ماصة 100 ميكرولتر لإزالة بلطف كامل برنامج تلفزيوني 1X المحيطة الشبكية اتخاذ يزدرع الحرص على عدم لمس شبكية العين لتجنب تمزق.
- إضافة 100 ميكرولتر حل البلازميد كفيت لتغطية يزدرع الشبكية كله. دفع برفق يزدرع الشبكية بالملقط إذا كان يطفو إلى الأعلى. استخدام ملقط أو أقطاب من وضع العدسة لمواجهة أي جانب واحد من كفيت والعصب البصري إلى أسفل كفيت.
- وضع القطب الموجب أمام العدسة والقطب السالب وراء شبكية العين (الشكل 2A)، دون لمس الأنسجة.
- تطبيق الحالية عن طريق الضغط على أسفل دواسة القدم. التحقق من وجود فقاعات في الأقطاب مشيرا إلى تفريغ ناجحة.
- استخدام ماصة 100 ميكرولتر لإزالة كافة مزيج من البلازميد كفيت دون الإضرار شبكية العين. هذا المزيج البلازميد يمكن إعادة استخدامها 3-5 مرات.
- تملأ كفيت مع ما قبل تحسنت (37 ° C) برنامج تلفزيوني 1X. استخدام ملقط لفصل بلطف يزدرع الشبكية من جدار كفيت. بعد Electroporation للشبكية العين وتغطي في بعض الأحيان مع فقاعات، مما يجعل من التمسك جدار كفيت.
- استخدام ماصة باستور البولي ايثيلين لنقل يزدرع الشبكية كله في 24 لوحة جيدا تحتوي على 1 مل قبل تحسنت (37 ° C) مستنبت لكل بئر. احتضان يزدرع الشبكية واحد لكل بئر.
- احتضان يزدرع الشبكية عند 37 درجة مئوية على شاكر المدورة، مع سرعة ثابتة من 50 دورة في الدقيقة، داخل الخلية الحاضنة مع 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة. تناوب هو ضمان أقصى قدر من التعرض إلى المتوسطة وpreveالإقليم الشمالي التصاق الشبكية في الجزء السفلي من لوحة 24-جيدا.
- انتقل إلى الخطوة 4.
- علاج إإكسبلنتس الشبكية كاملة مع الكواشف الكيميائية
ملاحظة: العلاج الكيميائي للإإكسبلنتس شبكية العين كلها يمكن القيام بها مباشرة بعد الخطوة 2.- إعداد مستنبت تحتوي على 1: 1 DMEM: F12 مزيج العناصر الغذائية، و 10٪ FBS، 10 U / مل البنسلين الستربتومايسين، 5 ميكروغرام / مل الأنسولين، و2 مم L-الجلوتامين.
- استخدام ملعقة صغيرة لنقل يزدرع الشبكية من الخطوة 2.3 إلى 24 لوحة جيدا تحتوي على 1 مل قبل حرارة (37 درجة مئوية) مستنبت لكل بئر. احتضان يزدرع الشبكية واحد لكل بئر.
- احتضان يزدرع الشبكية كامل لمدة 60 دقيقة في 37 ° C على شاكر المدورة، مع سرعة ثابتة من 50 دورة في الدقيقة، داخل الخلية الحاضنة مع CO 2 5٪ قبل إضافة كاشف كيميائي أو مركبة.
- تحضير المحلول الكيميائي، على سبيل المثال Cdk1 / 2 المانع الثالث، مثبط لM-مرحلة تطور 13، في المباراة النهائيةتركيز 30 ميكرومتر في DMSO.
- إزالة 24 لوحة جيدا، وتحتوي على يزدرع الشبكية كله، من الخلية الحاضنة. إضافة 10 ميكرولتر من كاشف كيميائي أو السيارة (DMSO) مباشرة إلى المتوسطة في شبكية العين، مما أدى إلى تركيز النهائي من 300 نانومتر Cdk1 / 2 المانع الثالث في 0.01٪ DMSO. تدوير يدويا لوحة 24-جيدا للسماح حتى توزيع الكاشف الكيميائي أو مركبة في الحل.
- احتضان لل explants الشبكية عند 37 درجة مئوية على شاكر المدورة، مع سرعة ثابتة من 50 دورة في الدقيقة، داخل حاضنة مع 5٪ CO 2 في الوقت المطلوب (تصل إلى 24 ساعة).
- انتقل إلى الخطوة 4.
4. التثبيت وتجميد الجامعة الشبكية Eexplants
- إزالة 24 لوحة جيدا تحتوي على تعامل يزدرع الشبكية كله من الخلية الحاضنة.
- استخدام ملعقة صغيرة لنقل يزدرع الشبكية لوحة 24-جيدا تحتوي على 1 مل / بئر الجليد البارد 4٪ لامتصاص العرق في 1XPBS. Incubaالشركة المصرية للاتصالات على الجليد لمدة 15 دقيقة.
- استخدام ملعقة صغيرة لنقل يزدرع الشبكية كله إلى لوحة 24-جيدا تحتوي على 1 مل / جيد 1XPBS المثلجة لغسل شبكية العين. احتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
- استخدام ملعقة صغيرة لنقل يزدرع الشبكية كله إلى لوحة 24-جيدا تحتوي على 1 مل / بئر الجليد الباردة السكروز 30٪ في 1XPBS. احتضان على الجليد لمدة 1-3 ساعة اعتمادا على يوم الجنينية لشبكية العين. لST20 - st25 (E3) شبكية العين، احتضان لمدة 1 ساعة، شبكية العين السن يحتاجون وقتا أطول في الحضانة السكروز.
- استخدام ملعقة صغيرة لنقل يزدرع الشبكية كله على فيلم البارافين تحتوي على ما يقرب من 500 ميكرولتر ناظم البرد تجميد المتوسطة المتزايدة. إزالة أكبر السكروز أقصى حد ممكن عن طريق تحريك بلطف يزدرع الشبكية في المتوسط تجميد باستخدام ملعقة صغيرة.
- نقل يزدرع الشبكية إلى قالب التضمين التي تحتوي على تجميد المتوسطة. وضع العين لتسهيل باجتزاء في المستقبل. وضع قالب التضمين التي تحتوي على يزدرع الشبكية كله على الدكتورذ الجليد حتى المتوسطة يتم تجميد الصلبة. تخزين في -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف هذا البروتوكول إعداد (الشكل 1A-F) وزراعة شبكية العين من إإكسبلنتس كاملة من أجنة الدجاج. وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح لإإكسبلنتس كلها الشبكية من الأجنة من ST20 (E3) لst31 (E7).
Electroporation للمن البلازميدات الحمض النووي في إإكسبلنتس شبكية العين بأكملها يسمح لوضع العلامات وتعقب الخلايا الاصلية في شبكية العين أو الإفراط في التعبير من المنتجات الجينات المختلفة. للتجارب Electroporation لل، وإزالة الظهارة الصبغية بعناية من العين منزوعة النواة من st25 (E4 ½) الجنين. وبعد ذلك وضعت ازدراع شبكية العين كله في كفيت التي تحتوي على البلازميد حل الحمض النووي، وغمرت المياه أقطاب (الشكل 2A) وطبقت تيار. بعد 24 ساعة من زراعة، كانت خلايا إيجابية GFP مرئية في جزء كبير من شبكية العين سليمة (الشكل 2B). بعد باجتزاء، تم الكشف عن GFP + الخلايا واحد بسهولة على طول المحور apico القاعدية من شبكية العين (فايجوري 2C). أدى Electroporation للفي منطقة الشبكية كبيرة تناول والبلازميد والتعبير عن الجين المراسل. كان معدل النجاح، مقاسا بعدد من شبكية العين حيث تبلغ مساحتها electroporated أكبر من 1/5 من شبكية العين الإجمالية، و 75٪ (62 من أصل 83 شبكية العين) لكامل شبكية العين يزدرع Electroporation لل، مقارنة ب 14٪ (37 من أصل 263 العيون ) لفي Electroporation للالبيضة. وقد تم بنجاح إجراء التجارب على Electroporation للإإكسبلنتس شبكية العين كلها على ST20 (E3) لst27 (E5) الأجنة.
يمكن لل explants الشبكية كلها تكون مثقف لحوالي 24 ساعة (3A الشكل وB). قد يؤدي مرات حضانة أطول للتأخر في النمو، تشوهات شكلية، وموت الخلايا المبرمج في نهاية المطاف تفكك الشبكية (الشكل 3C). عندما زراعة شبكية العين الدجاج كما إإكسبلنتس كلها بنية شبكية العين لا تزال سليمة. وهذا يشمل توزيع المراحل المختلفة من دورة الخلية على طول apico-بسآل المحور. خلال التطور الطبيعي تخضع الخلايا S-المرحلة على الجانب القاعدية، تليها الانقسام على الجانب قمية من شبكية العين 14،15. وهناك قسم من يزدرع الشبكية كله، مثقف لمدة 24 ساعة، وimmunostained مع الفوسفات-هيستون 3 (PH3) الأجسام المضادة، واصفة الخلايا في أواخر G2 / M-المرحلة (الشكل 3D). تم العثور على خلايا إيجابية PH3 على الجانب قمية من شبكية العين، بما يتفق مع تطوير شبكية العين العادية. ومجمع السيكلين B1-Cdk1 نشط في نواة بدء M-المرحلة الانتقالية 13. ومنع النشاط Cdk1-كيناز تمنع الأحداث أسفل مجرى والتي هي ضرورية لانتشار دورة الخلية في الانقسام. المرحلة 29 وحضنت (E6) إإكسبلنتس الشبكية كاملة مع Cdk1 / 2 المانع الثالث لمدة 4 ساعة و تم تحليل PH3 مناعية. تخفيض Cdk1 / 2 المانع III عدد الخلايا إيجابية PH3 (الشكل 3E)، مما يشير إلى كتلة كفاءة G2 / M-المرحلة الانتقالية. الحد من عدد mitoses بعد محطات الصرف الصحيالتحقق من الإقليم الشمالي مع المانع Cdk1 / 2 أن العلاج كان فعالا.
الشكل 1. إزالة ظهارة الصباغ. وتشريح وهو اليوم الجنينية العين 6 (st29) دجاج وإعدادها للزراعة كما يزدرع الشبكية كله. (A) عرض من العين الأمامية مع التلميذ والعدسة والشق المشيمية أسفل. الظهارة الصبغية سليمة ولكن تمت إزالة بدأة صلبوية والأنسجة المحيطة الضام. (B) مشاهدة الجزء الخلفي من العين. خروج العصب البصري وشق المشيمية إلى الأسفل. (C) شق في الظهارة الصبغية (D) تمت إزالة معظم الظهارة الصبغية. (E) تبقى بعض الظهارة الصبغية في طول حافة الجسم الهدبي و( F) الشق المشيمية. LE: العدسة والجسم الهدبي، CF:شق المشيمية، ON: البصري خروج العصب. شريط المقياس هو 0.5 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. Electroporation للمن إإكسبلنتس شبكية العين بأكملها. (A) عرض تخطيطي من أقطاب البلاتين وكيف أنها متوضعة على جانبي ازدراع شبكية العين كله أن يتم غمرها في محلول الحمض النووي البلازميد في كفيت مبتورا. (B) يزدرع الشبكية كامل بعد 24 ساعة من زراعة، و (C) مقطوع شبكية العين. ON: البصري خروج العصب. شريط المقياس هو (A) 4 مم، (B) 0.5 مم، (C) 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر وهاء rsion من هذا الرقم.
كانت ثابتة الشكل 3. مثقف إإكسبلنتس شبكية العين بأكملها، تجميد، cryosectioned، وصفت من قبل المناعية. (A) A st29 كله يزدرع الشبكية مثقف لمدة 24 ساعة. الميكروسكوب مضان من تلطيخ النووي بعد (B) 24 ساعة و(C) 48 ساعة. (D) تم استخدام الأجسام المضادة PH3 إلى خلايا التسمية في أواخر G2 / M-المرحلة. (E) الكثافة النسبية (PH3 + خلية / ملم 2، يعني ± SD) ومضان الميكروسكوب من PH3 + الخلايا في st29 بعد Cdk1 / 2 المانع الثالث العلاج لمدة 4 ساعة مقارنة مع السيارة. أولا: همبرغر ومراحل هاملتون، تي الطالب اختبار، ** P <0.01، ن ≥ 4 عيون المعالجة، 4 أقسام لكل عين، ح: ساعات. شريط المقياس هو (A) 0.5 مم، (BE) 10 ميكرون.jove.com/files/ftp_upload/53202/53202fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا العمل قدم بروتوكول مفصلة للتشريح، Electroporation للأو العلاج الكيميائي، وزراعة شبكية العين من إإكسبلنتس كاملة من أجنة الدجاج. هذا البروتوكول هو سهل وسريع ويسمح لكل من نسبة نجاح عالية واستنساخه النتائج.
Electroporation للمن إإكسبلنتس شبكية العين كلها تنتج مناطق واسعة من الخلايا التي تعبر عن التركيبة الجينية للاهتمام. فمن السهل أن وضع بشكل صحيح الأقطاب وفضح جزء محدد من الشبكية إلى تركيز الحمض النووي البلازميد محددة. هذا النهج يسمح لطريقة يمكن الاعتماد عليها لتحقيق وظيفة الجينات في شبكية العين مع نسبة نجاح أعلى عادة مقارنة electroporations في البيضة. ويقدم يزدرع الشبكية كله أيضا من الممكن لفضح الشبكية إلى المتوسطة التي تحتوي على تركيز محددة من كاشف كيميائي إعطاء توزيع موحد للكاشف في الشبكية العصبية. بروتوكول يسمح مجتمعةالعلاجات حيث يتم electroporated شبكية العين أولا وتعامل مع المواد الحين. تأثير التباين بين الأجنة الفردية قد يكون الحد الأدنى، لأن كلا من العين المعالجة والسيطرة التي يمكن جمعها من نفس الجنين وعلاجها بشكل مستقل.
وقد تم تحسين بروتوكول لإإكسبلنتس شبكية العين كلها من ST20 (E3) لst27 (E5) الأجنة ل electroporation وST20 (E3) لst31 (E7) الأجنة لعلاج مادة كيميائية. في مراحل أعمارهم الشبكية / كوب الضوئية صغير جدا وهشة للتعامل بشكل فعال وفي البيضة Electroporation للهو الأكثر احتمالا أكثر كفاءة. لم يتم تنفيذ Electroporations على إإكسبلنتس شبكية العين كلها على مراحل أقدم من st27 (E5). ومن المرجح ممكن للتكيف مع هذا البروتوكول لإإكسبلنتس من الأجنة القديمة. ويشمل ذلك الحصول على cuvettes أكبر والآبار أكبر للحضانة وزيادة حجم الشبكية مستنبت. ومع ذلك، من خلال E12-14 ظهارة الصباغ والجزء الخارجي للتصبح خلايا مستقبلة للضوء المرتبطة بها ارتباطا وثيقا، وإزالة الظهارة الصبغية قد يؤدي إلى تلف شبكية العين. يجب أن تكون شبكية العين سليمة أثناء إجراء التجارب كامل والحضانة.
مع هذا التشريح وبروتوكول زراعة، والسلامة الهيكلية للبنية شبكية العين لا تزال سليمة خلال 24 ساعة، استنادا إلى التعبير عن علامات محددة نوع من الخلايا. كما ذكر، درسنا تقدم دورة الخلية في إإكسبلنتس وعملية الهجرة النووية interkinetic من الخلايا الاصلية في شبكية العين تبدو طبيعية. إذا تم تنفيذ بروتوكول بسرعة لا يوجد سوى آثار صغيرة على التقدم التنموي في النباتى. ومع ذلك، فإن التنمية قد تباطأ قليلا ويزدرع التي تم تربيتها لمدة 24 ساعة قد يواجه سن التنموي الذي هو 2/1 ساعة أصغر من نظيره الطبيعي. ينصح لمقارنة يزدرع إلى نفس العمر شبكية العين العادية وينصح للاستخدام في العين المقابل باعتبارها EXPL تجريبيمكافحة النمل. وتجدر الإشارة إلى أن إزالة الظهارة الصبغية الشبكية قد تؤثر على تطوير قطاعات مبصرة الخارجي. كما ينبغي الإشارة إلى أن شبكية العين يزدرع تمثل شبكية العين المصابة بخلايا الشبكية العقدة axotomized.
هذا البروتوكول هو بسيط، وبالتالي يقلل من الأخطاء التجريبية ولكن البيضة السابقين الوضع يتطلب عدة عناصر تحكم التجريبية. عملية التنموية المحددة التي تخضع لدراستها باستخدام هذه البيضة السابقين بروتوكول يمكن أيضا أن تدرس في نفس الوقت ويمكن مقارنتها إلى وضعها الطبيعي في حالة البيضة. يجب أن يكون دائما وشملت الضوابط التجريبية المناسبة، مثل المركبات المستخدمة لإذابة المواد. عند استخدام حاصرات مسار إشارة، استخدام عدة مثبطات مختلفة لنفس العملية أو استخدام مثبطات المختلفة التي تستهدف الأنزيمات في أكثر من مستوى واحد من المسار المحدد الذي يتم دراستها. ل electroporation، وهو DNA البلازميد، معربا عن GFP هو مفيدمراقبة إيجابية سا. إذا لم يكن هذا البلازميد تنتج أي تعبير مراسل الجين، فمن الأرجح بسبب أن القطب الموجب (+) والسالب (-) متوضعة بشكل غير صحيح. سوف البلازميد DNA ثم تهاجر بعيدا عن الشبكية. ولذلك عند اختبار البلازميدات DNA رواية المستحسن أن تشمل البلازميد الحمض النووي التي تعبر عن بروتين فلوري مختلف كعنصر تحكم Electroporation للداخلية. وقد تم تحسين المعلمات Electroporation للالموصوفة في هذا البروتوكول لإنتاج عدد كبير من الجينات مراسل معربا عن الخلايا. انخفاض الجهد أو عدد من البقول يقلل من عدد الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل، والتي قد تؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة. ومع ذلك، وزيادة الجهد أو عدد النبضات قد يؤدي إلى تلف الأنسجة وزيادة موت الخلايا. وقد استخدمت ثلاث مجموعات من العرف أقطاب البلاتين لجميع electroporations خلال أكثر من عامين دون أن تظهر أي انخفاض القدرة. الأقطاب يجب تنظيفها بعناية وsurfac الكهربائييمكن مصقول ه. تتوفر التجارية 4 مم أقطاب مجداف.
ويركز هذا البروتوكول على Electroporation للمن البلازميدات DNA وعلاج الكيميائي للإإكسبلنتس شبكية العين بأكملها. فمن الممكن لتوسيع هذا البروتوكول لتشمل إجراءات تجريبية أخرى، مثل ضربة إلى أسفل في التعبير الجيني باستخدام oligomers morpholino. يفتح هذا الإجراء يزدرع الشبكية كله حتى لإمكانية إجراء تجارب على المدى القصير بطريقة سهلة وسريعة وقابلة للتكرار للغاية. أنه يقلل من التكاليف والوقت وعدد الحيوانات اللازمة لكل تجربة والأهم من ذلك أنه يزيد من إمكانية الحصول على بيانات صلبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1xPBS (tablet) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10x DPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 734-0006 | |
| 100 μl pipette tips | VWR | 613-0798 | |
| 1.5 ml disposable plastic cuvette | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24-well plate | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm Petri dish | VWR | 391-1998 | |
| 70% ethanol | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inhibitor III | 217714 | Calbiochem | 300 nM in 0.01% DMSO |
| Cell culture incubator | Thermo Forma | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Electrodes | Platina, custom made | ||
| Electro square porator ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 Nutrient mix | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Forceps | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Freezing medium NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| GFP expressing DNA plasmid (pZGs) | |||
| Humidified incubator | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| Mounting medium ProLong Gold with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Paraffin film | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way embedding mold | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicillin streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| PhosphoHistone 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Dilution 1/4,000 |
| Platinum electrodes (custom made from "rondelles") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Dia: 4mm, 0.1 mm thickness |
| Platimun electrodes | Sonidel | CUY700P4L | Dia: 4 mm |
| Polyethylene pasteur pipette | VWR | 612-2853 | |
| Rotator shaker | VWR | 444-2900 | |
| Small spoon | VWR | 231-2151 | |
| Sucrose | VWR | 443815S | |
| White Leghorn eggs | Local supplier | ||
| Wine cooler | WineMaster 24, Caso, Berlin Germany |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Method. 24, 43-48 (2001).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain. J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. J Vis Exp. , (2012).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina. Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).
- Tomita, K., et al. Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis. Neuro. 16, 723-734 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).
- Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors. Exp eye re. 93, 556-564 (2011).
- Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway. Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).
- Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest. Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).
- Sauer, F. Mitosis in the neural tube. J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).
