Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att dissekera, experimentellt manipulera och kultur hela näthinnan explants från kycklingembryon. Explantation kulturer är användbara när hög träffsäkerhet, effektivitet och reproducerbarhet krävs för att testa effekterna av plasmider för elektroporering och / eller reagensämnen, dvs enzymatiska hämmare.
Abstract
Näthinnan är en bra modell för det utvecklande centrala nervsystemet. Den stora storleken av ögat och framför allt tillgängligheten för experimentella manipulationer i ovo / in vivo gör kycklingen embryonala näthinnan en mångsidig och mycket effektiv experimentell modell. Även kyckling näthinnan är lätt att rikta in ovo genom intraokulära injektioner eller elektroporation, kan den effektiva och exakta koncentrationen av reagensen i näthinnan vara svårt att helt kontroll. Detta kan bero på variationer i den exakta injektionsstället, läckage från ögat eller ojämn diffusion av substanser. Vidare är frekvensen av missbildningar och mortalitet efter invasiva manipulationer såsom elektroporation ganska hög.
Detta protokoll beskriver en ex ovo teknik för odling hela näthinnan explants från kycklingembryon och tillhandahåller en metod för kontrollerad exponering av näthinnan till reagens. Protocol beskriver hur att dissekera, experimentellt manipulera och kultur hela näthinnan explants från kycklingembryon. Explantaten kan odlas cirka 24 timmar och utsättas för olika manipulationer såsom elektroporering. De stora fördelarna är att experimentet inte är beroende på överlevnaden av embryot och att koncentrationen av den införda reagenset kan varieras och kontrolleras för att fastställa och optimera den effektiva koncentrationen. Dessutom är den teknik snabb, billig och tillsammans med dess höga experimentella framgång, garanterar det reproducerbar resultat. Det bör understrykas att det fungerar som ett utmärkt komplement till experiment utförda in ovo.
Introduction
Näthinnan är en del av det centrala nervsystemet och det är, med sin relativa enkelhet och väldefinierad cellulär arkitektur, en populär modell för att studera centrala utveckling nervsystemet. Ögat hos kycklingembryo är relativt stor i jämförelse med resten av embryot. Det är därför lätt att nå in ovo för experimentella manipulationer, såsom injektioner eller elektroporering, och fungerar som ett utmärkt verktyg för att få kunskap om retinal cell och utvecklingsbiologi in vivo. Trots dessa stora fördelar, kan överlevnad embryon vara låg när experiment är invasiva såsom med electroporations, upprepade injektioner, eller kombinerade experimentella manipulationer.
Elektroporering av DNA-plasmider in i kycklingembryo in ovo är ett viktigt och väl etablerad teknik 1. Det möjliggör märkning av nervceller, spårning av cell öde liksom neuronala områden i centrala nervligt systemet och den möjliggör ektopisk genuttryck för att analysera proteinfunktion in vivo. Tekniken har använts för studier av neuralrörsdefekter 2, bakhjäman 3, och näthinnan 4. Elektroporering av embryonala näthinnan i ovo har vissa experimentella svårigheter som är relaterade till in vivo situationen. Positionen för ögat, på grund av den kraniella vikning av embryot, är relativt nära hjärtat. Denna närhet ökar risken för hjärtstillestånd efter elektroporering och risken ökar med åldern av embryot. Dessutom är det att komma åt ögat nödvändigt att öppna de embryonala membranen, vilket ökar risken för blödning, missbildningar och efterföljande minskad lönsamhet. Vid testning och optimering av en ny DNA-plasmid ofta utan känd fenotypisk resultat, kan dessa begränsningar minska effekten och kraften i metoden även för en erfaren experimentalist. Som framgår av detta protokoll, kultur whål retinal explantat, definierad som hela neurala näthinnan med pigmentepitelet avlägsnats, är en effektiv metod som kompletterar in ovo-tillvägagångssätt.
Intraokulära injektioner av kemiska reagens är relativt lätta att utföra in ovo. Dock kan den effektiva och exakta koncentrationen av injicerade reagenser i den neurala näthinnan vara svårt att helt kontrollera. Den injicerade volymen kan variera på grund av läckage och det exakta injektionsstället kan påverka såväl fördelningen av reagenset inuti ögat och diffusion genom glaskroppen. Variationen kommer att få stora konsekvenser för tolkning av resultaten när det vill säga en dos-responskurva för ett enzymhämmare bestäms; särskilt om effekten är liten och den temporala fönstret av effekten är smal. Dessutom kan bara en enda öga användas från varje embryo när du utför i ovo experiment på grund av potentiella systemiska effekter via blodetpå den kontralaterala ögat. Ålder matchning är viktigt när man studerar utvecklingen och den individuella variationen mellan behandlade och embryon kontroll kan leda till ytterligare experimentell variabilitet.
Av dessa skäl var en ex ovo metod baserad på näthinnan explants från kycklingembryon utvecklas, där neurala näthinnan kan utsättas för en enhetlig och kontrollerad experimentell tillstånd in vitro. Den nuvarande protokollet har utvecklats baserat på tidigare protokollen 5-9. Retinala explants från scenen (st) 20 (embryonala dagar [E] 3) till ST31 (E7) kycklingembryon dissekerades, odlades och elektro med en definierad DNA-plasmid koncentration eller utsätts för ett medium innehållande en definierad koncentration av ett kemiskt reagens. Protokollet presenteras här har framgångsrikt genomförts under de senaste publikationer, med hjälp av flera olika kemiska reagenser, inklusive regulatorer av DNA-skador väg, såsom KU55933, SB 218078 och NSC 109555 ditosylate och cellcykeln, såsom CDK1 / 2-hämmare III 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll genomförs i enlighet med rekommendationerna i "Guide för skötsel och användning av försöksdjur i Föreningen för forskning inom vision och oftalmologi".
1. Ägg Hantering och Eye samling
- Lagra vita Leghorn ägg vid 12-14 ° C under en längre tid än en vecka. Om tillgängligt, använd en kyld vinkyl för att lagra befruktade ägg.
Obs: Högre butiks temperaturer leder till onormal utveckling av embryon, medan lägre temperaturer ökar dödligheten. Förlängd lagringstid ökar både dödligheten och onormal utveckling. - Inkubera ägg i en 37,5 ° C och 60% fuktad ägg inkubator med försiktig gungning vid en frekvens av 5 gånger per 24 h.
- Ta bort ruvade ägg från ägget inkubator vid önskad embryonala ålder.
Obs: Åldern på kycklingembryo är bestämda vid tidpunkten för inkubation och betecknas som embryonala dagar (E) eller som stadier (st), Enligt rad utvecklingsstadier beskrivs av Hamburger och Hamilton 12. - Placera de valda ägg i dragskåp med laminärt flöde. Torka av äggskal med 70% etanol för att undvika kontaminering av embryot.
Obs: Genomför alla förfaranden under aseptiska förhållanden med sterila lösningarhttp://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions och instrument. - Knacka på sidan av ägget hårt mot en hård yta för att spricka öppna ägget. Placera innehållet i en 100 mm petriskål. Använd en liten sked för att överföra embryot till en 35 mm petriskål innehållande förvärmda (37 ° C) 1 x PBS för att förhindra vävnad från torkning.
- Placera 35 mm petriskål innehållande den embryonal vävnad på ett binokulärt Stereo dissektionsmikroskop i dragskåp med laminärt flöde. Halshugga embryot genom att nypa halsen med fin pincett och kasta kroppen.
- Använd fin pincett för att göra ett snitt thgrov munnen, ventrala till ögat. Börjar vid stället för snittet, riva upp den vävnad som omger hela ögat. Nypa bort synnerven och avlägsna intakta ögat från ögonhålan. Samla både vänster och höger öga från samma embryo för användning som antingen kontrollen eller det behandlade ögat.
- Använd en liten sked för att överföra ögonen i ett annat 35 mm petriskål innehållande förvärmda (37 ° C) 1 x PBS.
2. Beredning av hela näthinnan explants
- Använd fin pincett för att ta bort all vävnad runt ögat inklusive skleral anlage.
Obs: Vävnaden lossnar lätt fungera som lämnande näthinnan på glaskroppen och linsen med pigmentepitelet intakt (Figur 1A-B). - Använd fin pincett för att nypa ett litet snitt in i pigmentepitel på den dorsala delen av ögat utan att skada neurala näthinnan (Figur 1C).
- Använd fin pincett för att försiktigt riva öppna pigmentepitelet starting vid stället för snittet, lämnar linsen och hela näthinnan fäst till glaskroppen (figur 1D). Håll ögat i varmt (37 ° C) 1 x PBS för att underlätta avlägsnandet av pigmentepitelet.
Obs: pigmentepitel kan vara svåra att avlägsna, i synnerhet längs ciliarkroppen runt pupillen, i den främre regionen av ögat, och längs åderhinnan spricka. Därför kan en del av pigmentepitelet lämnas på neurala näthinnan (Figur 1E-F).
3. Behandling av hela näthinnan explants
- Elektroporering av hela näthinnan explants
Obs: Elektroporation av hela näthinnan explants kan utföras direkt efter steg 2.- Förbered odlingsmedium innehållande 1: 1 DMEM: F12 Nutrient blandning, 10% FBS, 10 U / ml penicillin streptomycin, 5 | ig / ml insulin, och 2 mM L-glutamin.
- Skär av en 1,5 ml engångs plastkyvett (12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm) (eller någon liten behållare kan hålla 300-400 il lösning) ca 8 mm från botten med hjälp av en fin blad såg.
- Späd DNA-plasmid av val i 1xDPBS till en slutlig koncentration av 0,1 | ig / | il.
- Slå på elektroporator och inställda parametrarna till 15 V för ST20 - ST25 (E3-E4) näthinnan och 20 V för ST26 - st27 (E5) näthinnan. Ställ in puls-upprepningarna till 5 pulser av 50 msek pulslängd med 1 sekunds intervall. Använd en pulsgenerator som kan styras av en fotpedal på golvet eftersom båda händerna behövs för att hålla elektroderna på plats.
- Ansluta två paddel modell (platt, cirkulär diam. 4 mm) platina elektroder (Figur 2A) till utgången på pulsgeneratorn.
Obs! Platinaelektroder som används i detta protokoll gjordes av universitetet verkstad. Elektroderna gjordes från 0,1 mm platinaplatta "rondeller" (platina klass: 950 Pt / 5 Cu). Förbindelse 0,8 mm wire isolerades med hjälp av plaströr. - Försiktigt överföra hela retinal Explantation från steg 2,3 till kyvetten (eller motsvarande liten behållare) med en polyeten pasteurpipett med spetsen avskuren för att få rätt tips öppningsstorlek för retinal Explantation. Undvik att använda pipettspetsar som näthinnan tenderar att fästa till plast och riva sönder.
- Använd en 100 l pipett att försiktigt ta bort hela 1x PBS omger näthinnans Explantation noga med att inte röra näthinnan för att undvika rivning.
- Lägg 100 pl plasmidlösning till kyvetten för att täcka hela näthinnan explantatet. Tryck försiktigt ned näthinnans Explantation med pincett om det flyter upp till toppen. Använd pincett eller elektroder för att positionera linsen att möta alla en sida av kyvetten och den optiska nerven till botten av kyvetten.
- Placera den positiva elektroden framför linsen och den negativa elektroden bakom näthinnan (Figur 2A), utan att röra vid vävnaden.
- Applicera strömmen genom att trycka ned fotpedal. Kontrollera om bubblor på elektroderna indikerar framgångsrik urladdning.
- Använd en 100 | j, l pipett för att ta bort alla plasmiden blandningen från kyvetten utan att skada näthinnan. Plasmiden blandningen kan återanvändas tre till fem gånger.
- Fyll kuvetten med förvärmda (37 ° C) 1x PBS. Använd pincett för att försiktigt lossa retinala explantatet från väggen av kuvetten. Efter elektroporering näthinnan ibland täckt med bubblor, vilket gör det vidhäftar till väggen i kuvetten.
- Använd polyeten pasteurpipett för att överföra hela den retinala explantatet i en 24-brunnsplatta innehållande 1 ml förvärmd (37 ° C) odlingsmedium per brunn. Inkubera en retinal Explantation per brunn.
- Inkubera näthinnans explantatet vid 37 ° C på en rotator skakare, med en konstant hastighet av 50 varv per minut, i en cellinkubator med 5% CO2 under 24 timmar. Rotationen är att säkerställa maximal exponering för mediet och att Prevent vidhäftning av näthinnan till botten av 24-brunnsplattan.
- Gå vidare till steg 4.
- Behandling av hela näthinnan explants med kemiska reagenser
Obs: Kemisk behandling av hela näthinnan explants kan utföras direkt efter steg 2.- Förbered odlingsmedium innehållande 1: 1 DMEM: F12 Nutrient blandning, 10% FBS, 10 U / ml penicillin streptomycin, 5 | ig / ml insulin, och 2 mM L-glutamin.
- Använd en liten sked för att överföra det retinala explantatet från steg 2,3 i en 24-brunnsplatta innehållande 1 ml förvärmda (37 ° C) odlingsmedium per brunn. Inkubera en retinal Explantation per brunn.
- Inkubera hela näthinnan explantatet för 60 min vid 37 ° C på en rotator skakare, med en konstant hastighet av 50 varv per minut, i en cellinkubator med 5% CO2 före tillsats av ett kemiskt reagens eller vehikel.
- Bered den kemiska lösningen, exempelvis CDK1 / 2-inhibitor III en hämmare av M-fas progression 13, vid en slutligkoncentration av 30 pM i DMSO.
- Avlägsna 24-brunnar, innehållande hela retinal explantation, från cellinkubator. Tillsätt 10 pl av det kemiska reagenset eller fordonet (DMSO) direkt till näthinnans mediet, vilket resulterar i en slutlig koncentration av 300 nM CDK1 / 2-inhibitor III i 0,01% DMSO. Rotera manuellt 24-brunnar för att medge jämn fördelning av det kemiska reagenset eller vehikel i lösningen.
- Inkubera näthinnan explants vid 37 ° C på en rotator skakare, med en konstant hastighet av 50 varv per minut, i en inkubator med 5% CO2 under önskad tid (upp till 24 h).
- Gå vidare till steg 4.
4. Fixering och Frysning av hela retinal Eexplants
- Ta bort 24-brunnar innehåller den behandlade hela retinal Explantation från cellinkubator.
- Använd en liten sked för att överföra näthinnan Explantation till en 24-brunnar innehåller 1 ml / brunn iskall 4% paraformaldehyd i 1xPBS. Incubate på is under 15 minuter.
- Använd en liten sked för att överföra hela näthinnan Explantation till en 24-brunnar innehåller 1 ml / brunn iskalla 1xPBS att tvätta näthinnan. Inkubera på is under 10 minuter.
- Använd en liten sked för att överföra hela näthinnan Explantation till en 24-brunnar innehåller 1 ml / brunn iskall 30% sackaros i 1xPBS. Inkubera på is under 1-3 h beroende på den embryonala dag av näthinnan. För ST20 - ST25 (E3) näthinnor, inkubera i 1 timme, äldre näthinnor behöver längre inkubationstid i sackaros.
- Använd en liten sked för att överföra hela retinal Explantation på en paraffin film som innehåller cirka 500 pl kryostat frysning monteringsmedium. Ta bort så mycket sackaros som möjligt genom att försiktigt flytta retinal Explantation i frysmedium med hjälp av liten sked.
- Överför näthinnan Explantation till en inbäddning form innehållande frysmedium. Placera ögat för att underlätta framtida sektionering. Placera inbäddning formen som innehåller hela retinal Explantation på dry is tills mediet är fryst fast. Förvara vid -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll beskriver framställningen (Figur 1A-F) och odling av hela näthinnan explants från kycklingembryon. Detta protokoll har använts med framgång för hela näthinnan explants från embryon från ST20 (E3) till ST31 (E7).
Elektroporering av DNA plasmider i hela näthinnan explants möjliggör märkning och spårning av retinala progenitorceller eller överuttryck av olika genprodukter. För elektroporation experiment pigmentepitel försiktigt bort från enukleerat öga av en ST25 (E4 ½) embryot. Hela retinala explantatet placerades sedan i en kyvett innehållande DNA-plasmiden lösningen sattes elektroder nedsänkta (figur 2A) och en ström applicerades. Efter 24 h av odling, GFP-positiva celler var synliga i en stor del av det intakta näthinnan (Figur 2B). Efter snittning, har enstaka GFP + celler lätt upptäckas längs apico-basala axel näthinnan (Figur 2C). Elektroporering resulterade i en stor retinal område tar upp plasmiden och uttrycker reportergenen. Framgången, mätt med antalet näthinnor med ett elektro område större än 1/5 av den totala näthinnan, var 75% (62 av 83 näthinnor) för hela retinal Explantation elektroporering, jämfört med 14% (37 av 263 ögon ) för in ovo-elektroporering. Elektroporering experiment på hela näthinnan explants har framgångsrikt genomförts på ST20 (E3) till st27 (E5) embryon.
Hela näthinnan explants kan odlas under ca 24 h (figur 3A och B). Längre inkubationstider kan leda till utvecklingsförsening, morfologiska missbildningar, apoptos och slutligen sönderdelning av näthinnan (Figur 3C). När odling av kyckling näthinnor som hela explantat arkitekturen i näthinnan förblir intakt. Detta inkluderar distribution av de olika faserna av cellcykeln längs apico-basal axel. Under normal utveckling cellerna undergår S-fasen på den basala sidan, följt av mitos på den apikala sidan av näthinnan 14,15. En sektion från en hel retinal explantation, odlades under 24 h tillfördes immunofärgades med en Phospho-Histon 3 (PH3) antikropp, märkning av celler i sen G2 / M-fas (figur 3D). De PH3 positiva celler hittades på den apikala sidan av näthinnan, överensstämmer med normal retinal utveckling. En aktiv cyklin B1-CDK1 komplex i kärnan kommer att inleda M-fasövergång 13. Blockering av CDK1-kinasaktiviteten kommer att hämma nedströms händelser som är nödvändiga för cellcykeln förökning i mitos. Etapp 29 (E6) hela näthinnan explants inkuberades med CDK1 / 2 Inhibitor III för 4 h och PH3 immunoreaktivitet analyserades. Den CDK1 / 2-inhibitor III reducerade antalet PH3 positiva celler (figur 3E), vilket tyder på en effektiv block av G2 / M-fas övergång. Reduktionen av antalet mitoser efter treatment med CDK1 / 2-hämmare kontrollerat att behandlingen var effektiv.
Figur 1. Borttagning av pigmentepitel. En embryonal dag 6 (st29) kyckling öga dissekerades och förberedd för odling i sin helhet retinal Explantation. (A) Vy över främre ögat med eleven och linsen och åderhinnan spricka nedåt. Pigmentepitel är intakt men skleral anlage och omgivande bindväv har avlägsnats. (B) Vy över den bakre delen av ögat. Synnerven exit och åderhinnan spricka är vända nedåt. (C) snitt i pigmentepitelet. (D) De flesta av pigmentepitelet har avlägsnats. (E) En del pigmentepitel lämnas vid längs kanten av ciliarkroppen och ( F) choroid spricka. LE: lins och ciliarkroppen, CF:åderhinnan spricka, ON: synnerven exit. Skala bar är 0,5 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Elektroporation av hela näthinnan explants. (A) Schematisk presentation av platinaelektroder och hur de är placerade på vardera sidan av hela näthinnan explantatet som är nedsänkt i DNA-plasmid-lösning i den stympade kyvetten. (B) Hela näthinnan explantat efter 24 h av odling, och (C) sektione näthinnan. ON: synnerven exit. Skala bar är (A) 4 mm (B) 0,5 mm, (C) 50 um. Klicka här för att se en större ve rsion av denna siffra.
Figur 3. Odlade hela näthinnan explants fixerades, frusen, cryosectioned, och märktes genom immunhistokemi. (A) En st29 hel retinal explantat odlades under 24 timmar. Fluorescensmikrofotografier av nukleär färgning efter (B) 24 timmar och (C) 48 timmar. (D) En PH3 antikropp används för att märka celler i slutet av G2 / M-fas. (E) Den relativa densiteten (PH3 + celler / mm 2, medelvärde ± SD) och fluorescensmikrofotografier av PH3 + -celler vid st29 efter CDK1 / 2-inhibitor III behandling för 4 h jämfört med vehikel. st: Hamburger och Hamilton stadier, t-test, ** p <0,01, n ≥ 4 behandlade ögonen, 4 sektioner per öga, H: timmar. Skalstreck är (A) 0,5 mm, (BE) 10 | j, m.jove.com/files/ftp_upload/53202/53202fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta arbete ett detaljerat protokoll för dissektion, elektroporering eller kemisk behandling, och odling av hela näthinnan explants från kycklingembryon presenteras. Detta protokoll är lätt, snabbt och möjliggör både ett bra resultat och reproducerbara resultat.
Elektroporering av hela näthinnan explants producerar stora områden av celler som uttrycker genkonstruktionen av intresse. Det är lätt att korrekt positionera elektroderna och för att exponera en specifik del av näthinnan till en definierad DNA-plasmid-koncentration. Detta tillvägagångssätt möjliggör en tillförlitlig metod för att undersöka genfunktion i näthinnan med ett typiskt större framgång jämfört med elektroporer in ovo. Hela retinala explantatet gör det också möjligt att exponera näthinnan till ett medium innehållande en definierad koncentration av ett kemiskt reagens som ger en likformig fördelning av reagenset i neurala näthinnan. Protokollet möjliggör kombineradbehandlingar där näthinnan först electroporated och behandlades sedan med ämnen. Inverkan av variationer mellan enskilda embryon kan minimeras, eftersom både de behandlade och kontrollögat kan hämtas från samma embryo och behandlas oberoende.
Protokollet har optimerats för hela näthinnan explants från ST20 (E3) till st27 (E5) embryon för elektroporering och ST20 (E3) till ST31 (E7) embryon för kemiskt ämne behandling. Vid yngre stadier näthinnan / optisk koppen är för liten och bräcklig för att effektivt hantera och in ovo elektroporering är troligen mer effektiva. Electroporations på hela näthinnan explants utfördes inte på scener som är äldre än st27 (E5). Det är sannolikt möjligt att anpassa detta protokoll för att explants från äldre embryon. Som skulle omfatta erhålla större kyvetter, större brunnar för odling och ökad volym av retinal odlingsmedium. Men genom E12-14 pigmentepitel och det yttre segmentet avljusmätare celler blir nära associerade, och avlägsnande av pigmentepitelet kan skada näthinnan. Näthinnan bör vara intakt under hela experimentförfarandet och inkubation.
Med denna dissektion och odling protokoll, den strukturella integriteten hos näthinnans arkitekturen förblir intakt under 24 timmar, baserat på uttrycket av celltyp specifika markörer. Som nämnts, har vi studerat cellcykelprogression hos explantaten och processen för interkinetic nukleär migrering av retinala progenitorceller ser normalt. Om protokollet görs snabbt det bara små effekter på utvecklings progression i explantatet. Emellertid kan utvecklingen vara något långsammare och ett explantat som odlats under 24 h kan uppvisa en utvecklingsålder som är 1-2 h yngre än den normala motsvarigheten. Det rekommenderas att jämföra explantatet till åldersmatchade normala näthinnan och det rekommenderas att använda kontralaterala ögat som en experimentell explant kontroll. Det bör påpekas att avlägsnande av näthinnans pigmentepitel kan påverka utvecklingen av de yttre fotoreceptorsegmenten. Det bör också påpekas att en Explantation näthinnan representerar en skadad näthinnan med axotomiserade näthinneganglieceller.
Detta protokoll är enkel och därför minskar experimentella fel men ex ovo situationen kräver flera experimentella kontroller. En särskild utvecklings process som är föremål för att studeras med användning av denna ex ovo Protokollet kan även studeras parallellt och jämföras med den normala in ovo-situationen. Lämpliga experimentella kontroller måste alltid finnas med, såsom fordon som används för att lösa ämnen. Vid användning av signalväg blockerare, använda flera olika inhibitorer för samma process eller använda olika inhibitorer som målenzym på mer än en nivå av den specifika väg som studeras. För elektroporering är en GFP-uttryckande DNA-plasmid användbar aför SA positiv kontroll. Om sådan plasmid inte producerar någon reportergenuttryckning, är det mest troligt på grund av att anoden (+) och katoden (-) är felaktigt placerad. Den DNA-plasmid kommer då migrera bort från näthinnan. Vid testning av nya DNA-plasmider är det rekommenderas därför att inkludera en DNA-plasmid som uttrycker en annan fluorescerande protein som en intern elektroporering kontroll. Elektroporering parametrar som beskrivs i detta protokoll har optimerats för att producera ett stort antal reportergen uttryckande celler. Minskning av spänningen eller antalet pulser minskar antalet transfekterade celler, vilket kan ge falska negativa resultat. Emellertid kan öka spänningen eller antalet pulser leda till skada på vävnaden och ökad celldöd. Tre uppsättningar av skräddarsydda platinaelektroder har använts för alla electroporations under mer än två år utan att visa någon reducerad kapacitet. Elektroderna måste rengöras noggrant och elektrod surface poleras. Kommersiella 4 mm paddel elektroder finns tillgängliga.
Detta protokoll är inriktat på elektroporering av DNA-plasmider och kemisk behandling av hela näthinnan explants. Det är möjligt att ytterligare utöka detta protokoll för att inkludera andra experimentella förfaranden, såsom en knock-down av genuttryck med användning av morfolinooligomerer. Hela retinal Explantation förfarande öppnar upp för möjligheten att utföra korttidsförsök på ett enkelt, snabbt och mycket reproducerbart sätt. Det minskar kostnaderna, tid och antal djur som behövs för varje experiment och viktigast det ökar möjligheten att få solida data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1xPBS (tablet) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10x DPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 734-0006 | |
| 100 μl pipette tips | VWR | 613-0798 | |
| 1.5 ml disposable plastic cuvette | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24-well plate | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm Petri dish | VWR | 391-1998 | |
| 70% ethanol | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inhibitor III | 217714 | Calbiochem | 300 nM in 0.01% DMSO |
| Cell culture incubator | Thermo Forma | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Electrodes | Platina, custom made | ||
| Electro square porator ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 Nutrient mix | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Forceps | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Freezing medium NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| GFP expressing DNA plasmid (pZGs) | |||
| Humidified incubator | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| Mounting medium ProLong Gold with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Paraffin film | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way embedding mold | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicillin streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| PhosphoHistone 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Dilution 1/4,000 |
| Platinum electrodes (custom made from "rondelles") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Dia: 4mm, 0.1 mm thickness |
| Platimun electrodes | Sonidel | CUY700P4L | Dia: 4 mm |
| Polyethylene pasteur pipette | VWR | 612-2853 | |
| Rotator shaker | VWR | 444-2900 | |
| Small spoon | VWR | 231-2151 | |
| Sucrose | VWR | 443815S | |
| White Leghorn eggs | Local supplier | ||
| Wine cooler | WineMaster 24, Caso, Berlin Germany |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Method. 24, 43-48 (2001).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain. J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. J Vis Exp. , (2012).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina. Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).
- Tomita, K., et al. Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis. Neuro. 16, 723-734 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).
- Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors. Exp eye re. 93, 556-564 (2011).
- Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway. Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).
- Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest. Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).
- Sauer, F.
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).
