Summary
Este protocolo describe un método para diseccionar, experimentalmente manipular y explantes de cultivo completo de la retina a partir de embriones de pollo. Los cultivos de explantes son útiles cuando alta tasa de éxito, la eficacia y reproducibilidad son necesarios para probar los efectos de plásmidos para la electroporación y / o sustancias de reactivos, es decir, inhibidores enzimáticos.
Abstract
La retina es un buen modelo para el sistema nervioso central en desarrollo. El gran tamaño del ojo y lo más importante la accesibilidad para las manipulaciones experimentales en ovo / in vivo hace que el pollo retina embrionaria un modelo experimental versátil y muy eficiente. Aunque la retina de pollo es fácil dirigirse in ovo mediante inyecciones intraoculares o la electroporación, la concentración eficaz y exacta de los reactivos dentro de la retina puede ser difícil de controlar completamente. Esto puede ser debido a las variaciones de la zona de inyección exacta, la fuga desde el ojo o desigual difusión de las sustancias. Además, la frecuencia de malformaciones y mortalidad después de manipulaciones invasivos tales como la electroporación es bastante alta.
Este protocolo describe un ex ovo técnica para el cultivo de explantes de retina enteros a partir de embriones de pollo y proporciona un método para la exposición controlada de la retina a los reactivos. El protocol describe cómo diseccionar, experimentalmente manipular y explantes de cultivo enteros de la retina a partir de embriones de pollo. Los explantes pueden cultivarse durante aproximadamente 24 h, y ser sometidos a diferentes manipulaciones tales como la electroporación. Las principales ventajas son que el experimento no es dependiente de la supervivencia del embrión y que la concentración del reactivo introducido se puede variar y controlado con el fin de determinar y optimizar la concentración efectiva. Además, la técnica es rápida, barata y junto con su alta tasa de éxito experimental, se asegura reproducible resultados. Cabe destacar que sirve como un excelente complemento para los experimentos realizados in ovo.
Introduction
La retina es parte del sistema nervioso central y es, con su relativa simplicidad y la arquitectura celular bien caracterizada, un modelo popular para estudiar el desarrollo del sistema nervioso central. El ojo del embrión de pollo es relativamente grande en comparación con el resto del embrión. Por tanto, es de fácil acceso en ovo de manipulaciones experimentales, tales como inyecciones o electroporación, y sirve como una excelente herramienta para adquirir conocimientos sobre las células de la retina y la biología del desarrollo in vivo. A pesar de estas ventajas importantes, la supervivencia de los embriones puede ser baja cuando los experimentos son invasivas como con electroporaciones, inyecciones repetidas, o manipulaciones experimentales combinados.
La electroporación de plásmidos de ADN en el embrión de pollo in ovo es un importante y bien establecida técnica 1. Permite para el etiquetado de las neuronas, la localización del destino celular, así como tractos neuronales en el centro de nervous sistema y permite ectópico expresión génica para analizar la función de proteínas in vivo. La técnica ha sido utilizada para los estudios de tubo neural 2, hindbrain 3, 4 y la retina. Electroporación de retina embrionaria in ovo tiene algunas dificultades experimentales que están relacionados con la situación in vivo. La posición del ojo, debido a la plegado craneal del embrión, es relativamente cerca del corazón. Esta proximidad aumenta el riesgo de un paro cardíaco después de la electroporación, y el riesgo aumenta con la edad del embrión. Por otra parte, para acceder al ojo, es necesario abrir las membranas embrionarias, aumentando así el riesgo de sangrado, malformaciones y posterior viabilidad reducida. Al probar y optimizar un nuevo plásmido de ADN a menudo sin un resultado fenotípico conocido, estas limitaciones pueden disminuir la eficacia y el poder del método incluso para un experimentalista experimentado. Tal como se presenta en este protocolo, la cultura de la wexplante agujero retinal, que se define como a toda la retina neural con el epitelio de pigmento eliminado, es un método eficaz que complementa el enfoque en ovo.
Inyecciones intraoculares de reactivos químicos son relativamente fáciles de realizar in ovo. Sin embargo, la concentración eficaz y exacta de los reactivos inyectados dentro de la retina neural puede ser difícil de controlar totalmente. El volumen inyectado puede variar debido a las fugas y el sitio exacto de la inyección puede afectar tanto a la distribución del reactivo dentro del ojo y de la difusión a través del cuerpo vítreo. La variabilidad tendrá importantes implicaciones para la interpretación de los resultados cuando es decir, se determina una curva dosis-respuesta para un inhibidor de la enzima; particularmente si el efecto es pequeño y la ventana temporal del efecto es estrecho. Por otra parte, un solo ojo puede ser utilizado de cada embrión cuando se realiza en experimentos in ovo debido a los posibles efectos sistémicos a través del torrente sanguíneosobre el ojo contralateral. Coincidente edad es importante a la hora de estudiar el desarrollo y la variabilidad individual entre tratados y los embriones de control pueden conducir a la variabilidad experimental adicional.
Por estas razones, un ex ovo método basado en explantes de retina de embriones de pollo fue desarrollado, en el que la retina neural puede ser expuesto a un uniforme y controlada condición experimental in vitro. El presente protocolo fue desarrollado en base a protocolos anteriores 5-9. Explantes de retina de la etapa (st) 20 (días embrionarias [E] 3) a ST31 (E7) embriones de pollo fueron disecados, culta y electroporación con una concentración de ADN plásmido definido o expuestos a un medio que contiene una concentración definida de un reactivo químico. El protocolo que aquí se presenta ha sido implementado con éxito en publicaciones recientes, utilizando varios reactivos químicos diferentes, incluyendo los reguladores de la vía de daño en el ADN, como KU55933, SB 218078 y NSC 109555 ditosylate, y el ciclo celular, tal como Cdk1 / 2 inhibidor III 10,11.
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Protocol
Este protocolo se realiza de acuerdo con las recomendaciones de la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología".
1. Manipulación del huevo y la recogida de los ojos
- Almacene los huevos Leghorn blancas a 12-14 ° C durante no más de 1 semana. Si está disponible, utilice un enfriador de vino refrigerada para almacenar los huevos fertilizados.
Nota: Las temperaturas más altas del almacén conducen a un desarrollo anormal de los embriones, mientras que las temperaturas más bajas aumenta la mortalidad. Tiempo de almacenamiento extendido aumenta tanto la mortalidad y el desarrollo anormal. - Incubar los huevos en un 37,5 ° C y 60% humidificado incubadora de huevos con suave balanceo a una frecuencia de 5 veces por 24 horas.
- Retire los huevos incubados de la incubadora de huevos a la edad embrionaria deseado.
Nota: La edad del embrión de pollo se determina como el tiempo de incubación y se denota como día embrionario (E) o como etapas (st), De acuerdo con la serie de etapas de desarrollo descritos por Hamburguesa y Hamilton 12. - Coloque los huevos seleccionados en la campana de flujo laminar. Limpiar la cáscara del huevo con etanol al 70% para evitar la contaminación del embrión.
Nota: Llevar a cabo todos los procedimientos en condiciones asépticas con soluciones estérileshttp://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions e instrumentos. - Toque en el lado del huevo firmemente contra una superficie dura para abrir una grieta en el huevo. Coloque el contenido en un 100 mm placa de Petri. Use una pequeña cuchara para transferir el embrión a una placa de Petri de 35 mm que contiene precalentado (37 ° C) 1x PBS para evitar que el tejido de secado.
- Coloque la placa de Petri de 35 mm que contiene el tejido embrionario en un microscopio de disección estereoscópica binocular en la campana de flujo laminar. Decapitar el embrión apretando el cuello con unas pinzas finas y descartar el cuerpo.
- Utilice unas pinzas finas para hacer una incisión ªáspera la boca, ventral a la vista. Comenzando en el sitio de la incisión, rasgar el tejido que rodea todo el ojo. Pellizcar el nervio óptico y quitar el ojo intacto de la cuenca del ojo. Recoge tanto el ojo izquierdo y derecho desde el mismo embrión para su uso, ya sea como el control o el ojo tratado.
- Use una cuchara pequeña para transferir los ojos a una nueva placa de Petri de 35 mm que contiene precalentado (37 ° C) 1x PBS.
2. Preparación de toda la retina explantes
- Utilice unas pinzas finas para retirar todo el tejido alrededor del ojo incluyendo la anlage escleral.
Nota: El tejido se separará fácilmente dejando la retina en el cuerpo vítreo y la lente con el epitelio de pigmento intacta (Figura 1A-B). - Utilice unas pinzas finas pellizcar una pequeña incisión en el epitelio pigmentario en la parte dorsal del ojo sin dañar la retina neural (Figura 1C).
- Utilice unas pinzas finas para arrancar suavemente abra la starti epitelio pigmentariong en el sitio de incisión, dejando la lente y toda la retina unido al cuerpo vítreo (Figura 1D). Mantener el ojo en caliente (37 ° C) 1x PBS para facilitar la eliminación del epitelio pigmentario.
Nota: El epitelio de pigmento puede ser difícil de eliminar, en particular, a lo largo del cuerpo ciliar alrededor de la pupila, en la región anterior del ojo, ya lo largo de la fisura coroides. Por lo tanto, algunos de epitelio pigmentario se puede dejar en la retina neural (Figura 1E-F).
3. El tratamiento de toda la retina explantes
- Electroporación de explantes de retina enteros
Nota: La electroporación de los explantes de retina enteros puede realizarse directamente después de la etapa 2.- Preparar medio de cultivo que contiene 1: 1 DMEM: F12 mezcla de nutrientes, 10% de FBS, 10 U / ml de penicilina estreptomicina, 5 mg / ml de insulina, y 2 mM L-glutamina.
- Corte un 1,5 ml desechables cubeta de plástico (12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm) (o cualquier pequeño recipiente capaz de contener la solución de 300-400 l) aproximadamente 8 mm de la parte inferior usando una sierra de hoja fina.
- Diluir el plásmido de ADN de elección en 1xDPBS a una concentración final de 0,1 mg / l.
- Encienda los parámetros electroporador y set de 15 V para ST20 - ST25 (E3-E4) retina y 20 V para ST26 - ST27 (E5) retina. Ajuste los pulsos repeticiones de 5 pulsos de 50 ms de pulso de longitud con intervalos de 1 seg. Utilice un generador de impulsos que puede ser controlado por un pedal en el suelo como se necesitarán ambas manos para sostener los electrodos en su lugar.
- Conecte dos paleta en forma de (, diam circular plana. 4 mm) electrodos de platino (Figura 2A) a la toma de salida del generador de impulsos.
Nota: Los electrodos de platino utilizados en este protocolo fueron hechas por el taller de la universidad. Los electrodos fueron hechas de placa de platino de 0,1 mm "rondelles" (grado de platino: 950 Pt / 5 Cu). La conexión de 0,8 mm wire se aisló utilizando un tubo de plástico. - Transferir cuidadosamente todo el explante de la retina desde el paso 2.3 a la cubeta (o recipiente pequeño equivalente) usando una pipeta Pasteur de polietileno con la punta cortada para adquirir el tamaño adecuado punta de apertura para el explante de la retina. Evite el uso de puntas de pipeta como la retina tiende a unir a la de plástico y desgarrar.
- Utilice una pipeta 100 l para eliminar suavemente todo el 1x PBS que rodea el explante teniendo cuidado de no tocar la retina la retina para evitar que se rompa.
- Añadir solución de plásmido 100 l a la cubeta para cubrir todo el explante de la retina. Presione suavemente el explante de la retina con pinzas si flota a la cima. El uso de fórceps o electrodos de situar el objetivo hacer frente a cualquier un lado de la cubeta y el nervio óptico hasta el fondo de la cubeta.
- Coloque el electrodo positivo en frente de la lente y el electrodo negativo detrás de la retina (Figura 2A), sin tocar el tejido.
- Aplique la corriente presionando el pedal. Compruebe si hay burbujas en los electrodos que indican la descarga con éxito.
- Usar una pipeta de 100 l para eliminar toda la mezcla de plásmido a partir de la cubeta sin dañar la retina. La mezcla de plásmido puede ser reutilizado tres a cinco veces.
- Llenar la cubeta con precalentado (37 ° C) 1x PBS. El uso de fórceps para desprender suavemente el explante de la retina de la pared de la cubeta. Después de la electroporación la retina a veces se cubrió con burbujas, lo que hace que se adhiera a la pared de la cubeta.
- Utilice la pipeta Pasteur de polietileno para transferir todo el explante de la retina en una placa de 24 pocillos que contenía 1 ml precalentado (37 ° C) medio de cultivo por pocillo. Incubar un explante de la retina por pocillo.
- Incubar el explante de la retina a 37 ° C en un agitador rotatorio, con una velocidad constante de 50 rpm, dentro de un incubador de células con 5% de CO 2 durante 24 horas. La rotación es asegurar la máxima exposición al medio y para prevent adherencia de la retina a la parte inferior de la placa de 24 pocillos.
- Continúe con el paso 4.
- El tratamiento de los explantes de retina enteras con reactivos químicos
Nota: El tratamiento químico de los explantes de retina enteros puede realizarse directamente después de la etapa 2.- Preparar medio de cultivo que contiene 1: 1 DMEM: F12 mezcla de nutrientes, 10% de FBS, 10 U / ml de penicilina estreptomicina, 5 mg / ml de insulina, y 2 mM L-glutamina.
- Use una cuchara pequeña para transferir el explante de la retina desde el paso 2.3 en una placa de 24 pocillos que contenía 1 ml precalentado (37 ° C) medio de cultivo por pocillo. Incubar un explante de la retina por pocillo.
- Incubar toda la retina explante durante 60 min a 37 ° C en un agitador rotatorio, con una velocidad constante de 50 rpm, dentro de un incubador de células con 5% de CO 2 antes de añadir un reactivo químico o vehículo.
- Preparar la solución química, por ejemplo Cdk1 / 2 inhibidor III, un inhibidor de la progresión de la fase M-13, en una finalconcentración de 30 mM en DMSO.
- Retire la placa de 24 pocillos, que contiene todo el explante de la retina, de la incubadora celular. Añadir 10 l de reactivo químico o el vehículo (DMSO) directamente al medio de la retina, resultando en una concentración final de 300 nM Cdk1 / 2 inhibidor III en 0,01% de DMSO. Girar manualmente la placa de 24 pocillos para permitir una distribución uniforme del reactivo químico o vehículo en la solución.
- Incubar los explantes de retina a 37 ° C en un agitador rotatorio, con una velocidad constante de 50 rpm, dentro de un incubador con 5% de CO 2 durante el tiempo deseado (hasta 24 h).
- Continúe con el paso 4.
4. Fijación y Congelación de Whole Retina Eexplants
- Retire la placa de 24 pocillos que contiene el explante de la retina entera tratada de la incubadora celular.
- Use una cuchara pequeña para transferir el explante de la retina a una placa de 24 pocillos que contienen 1 ml / pocillo helada paraformaldehído al 4% en 1xPBS. Incubate en hielo durante 15 min.
- Use una cuchara pequeña para transferir todo el explante de la retina a una placa de 24 pocillos que contienen 1 ml / pocillo 1xPBS frío de hielo para lavar la retina. Incubar en hielo durante 10 min.
- Use una cuchara pequeña para transferir todo el explante de la retina a una placa de 24 pocillos que contienen 1 ml / pocillo frío hielo sacarosa 30% en 1xPBS. Incubar en hielo durante 1-3 hr dependiendo del día embrionario de la retina. Para ST20 - ST25 (E3) retinas, se incuban durante 1 hora, retinas mayores necesitan más tiempo de incubación en sacarosa.
- Use una cuchara pequeña para transferir todo el explante de la retina sobre una película de parafina con un contenido medio de montaje de aproximadamente 500 l de congelación criostato. Retire la mayor cantidad de sacarosa posible moviendo suavemente el explante de la retina en el medio de congelación utilizando la cuchara pequeña.
- Transferir el explante de la retina a un molde de inclusión que contiene medio de congelación. Coloque el ojo para facilitar la futura seccionamiento. Ponga el molde de inclusión que contiene todo el explante de la retina en dry hielo hasta que el medio se congela sólido. Almacenar a -80 ° C.
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Representative Results
Este protocolo describe la preparación (Figura 1A-F) y el cultivo de los explantes de retina enteros a partir de embriones de pollo. Este protocolo se ha usado con éxito para explantes de retina a partir de embriones enteros de ST20 (E3) a ST31 (E7).
La electroporación de plásmidos de ADN en explantes de retina enteros permite para el etiquetado y el rastreo de las células progenitoras de la retina o sobre-expresión de diferentes productos génicos. Para los experimentos de electroporación, el epitelio pigmentario se retiró cuidadosamente desde el ojo enucleado de un ST25 (E4 ½) embrión. A continuación, el explante de la retina entera se colocó en una cubeta que contiene la solución de ADN plásmido, los electrodos se sumergieron (Figura 2A) y una corriente se aplicó. Después de 24 h de cultivo, las células GFP positivas eran visibles en una gran parte de la retina intacta (Figura 2B). Tras el corte, las células individuales GFP + fueron fácilmente detectados a lo largo del eje-apico basal de la retina (Fifigura 2C). La electroporación se tradujo en una gran área de la retina tomando el plásmido y que expresa el gen reportero. La tasa de éxito, medido por el número de retinas con un área electroporación más grande que 1/5 de la retina total fue del 75% (62 de 83) retinas para toda la electroporación explante de la retina, en comparación con 14% (37 de 263 ojos ) en la electroporación in ovo. Experimentos de electroporación en explantes de retina enteros con éxito se han realizado en ST20 (E3) para ST27 (E5) embriones.
Los explantes de retina enteros pueden ser cultivadas durante aproximadamente 24 h (Figura 3A y B). Tiempos de incubación más largos pueden llevar a retraso en el desarrollo, malformaciones morfológicas, la apoptosis y, finalmente, la desintegración de la retina (Figura 3C). Cuando el cultivo de las retinas de pollo como explantes de toda la arquitectura de la retina se mantiene intacta. Esto incluye la distribución de las diferentes fases del ciclo celular a lo largo de los apico-basal eje. Durante el desarrollo normal de las células se someten a la fase S en el lado basal, seguido por la mitosis en el lado apical de la retina 14,15. Una sección de un explante retina conjunto, se cultivaron durante 24 horas, se immunostained con un fosfo-histona 3 (PH3) de anticuerpos, el etiquetado de las células a finales de G2 / M fase (Figura 3D). Las células PH3 positivos se encontraron en la parte apical de la retina, en consonancia con el desarrollo normal de la retina. Un complejo activo de ciclina B1-Cdk1 en el núcleo iniciará transición de fase M-13. El bloqueo de la actividad de Cdk1-quinasa inhibirá acontecimientos corriente abajo que son necesarias para la propagación del ciclo celular en la mitosis. Etapa 29 (E6) explantes de retina enteros se incubaron con la Cdk1 / 2 Inhibidor III durante 4 horas y se analizó la inmunorreactividad PH3. El Cdk1 / 2 inhibidor III redujo el número de células positivas PH3 (Figura 3E), lo que indica un bloque eficiente de transición G2 / M-fase. La reducción del número de mitosis después de limpnt con el inhibidor de Cdk1 / 2 se verifica que el tratamiento era eficaz.
Figura 1. La eliminación del epitelio pigmentario. Un ojo 6 (ST29) de pollo el día embrionario se disecó y se preparó para el cultivo como explante retina conjunto. (A) Vista de la anterior del ojo con la pupila y el cristalino y la fisura coroides hacia abajo. El epitelio pigmentario está intacto pero el anlage escleral y el tejido conectivo que rodea se ha eliminado. (B) Vista de la parte posterior del ojo. La óptica salida del nervio y fisura coroidea están orientados hacia abajo. (C) Incisión en el epitelio de pigmento. (D) La mayor parte del epitelio pigmentario se ha eliminado. (E) Algunos epitelio pigmentario se deja a lo largo del borde del cuerpo ciliar y ( F) la fisura coroidea. LE: lente y cuerpo ciliar, CF:fisura coroidea, ON: salida del nervio óptico. La barra de escala es de 0,5 mm. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Electroporación de explantes de retina enteros. (A) Representación esquemática de los electrodos de platino y cómo están posicionados a ambos lados de todo el explante de la retina que se sumerge en una solución de plásmido de ADN en la cubeta truncado. (B) explante entero después de la retina 24 h de cultivo, y (C) seccionaron retina. ON: salida del nervio óptico. La barra de escala es (A) 4 mm, (B) 0,5 mm, (C) 50 micras. Por favor haga clic aquí para ver una grande ve rsión de esta figura.
Figura 3. explantes de retina enteras cultivadas fueron fijadas, congelados, cryosectioned, y etiquetados por inmunohistoquímica. (A) Un ST29 explante retina toda cultivaron durante 24 horas. Micrografías de fluorescencia de tinción nuclear después (B) 24 horas y (C) 48 h. (D) Un anticuerpo PH3 se utilizó a las células de la etiqueta a finales de G2 / M fase. (E) La densidad relativa (PH3 + células / mm 2, media ± DE) y la fluorescencia micrografías de células PH3 + en ST29 después Cdk1 / 2 inhibidor III tratamiento durante 4 horas en comparación con el vehículo. st: Hamburguesa y etapas de Hamilton, la prueba t de Student, ** p <0,01, n ≥ 4 ojos tratados, 4 secciones por ojo, H: horas. La barra de escala es de (A) 0,5 mm, (BE) 10 micras.jove.com/files/ftp_upload/53202/53202fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este trabajo se presenta un protocolo detallado para la disección, la electroporación o tratamiento químico, y el cultivo de los explantes enteros retina de embriones de pollo. Este protocolo es fácil, rápido y permite tanto una alta tasa de éxito y reproducible resultados.
Electroporación de explantes de retina enteros produce grandes áreas de células que expresan el constructo de gen de interés. Es fácil de colocar correctamente los electrodos y para exponer una parte específica de la retina a una concentración de plásmido de ADN definida. Este enfoque permite un método fiable para investigar la función de genes en la retina con una tasa de éxito típicamente más altos en comparación con electroporaciones en ovo. El explante retinal conjunto también hace que sea posible exponer la retina a un medio que contiene una concentración definida de un reactivo químico que da una distribución uniforme del reactivo en la retina neural. El protocolo permite combinadotratamientos donde la retina está primero a electroporación y luego tratados con sustancias. La influencia de la variabilidad entre los embriones individuales se puede minimizar, ya que tanto el ojo tratado y el control puede ser recogida a partir del mismo embrión y tratarse de forma independiente.
El protocolo ha sido optimizado para los explantes enteros retina de ST20 (E3) para ST27 (E5) embriones para la electroporación y ST20 (E3) para ST31 (E7) embriones para el tratamiento de la sustancia química. En las etapas más jóvenes de la retina / copa óptica es demasiado pequeño y frágil para manejar con eficacia y la electroporación in ovo es más probable que sea más eficiente. Electroporaciones en explantes de retina enteros no se realizó en etapas anteriores a ST27 (E5). Es probable posible adaptar este protocolo para explantes de embriones mayores. Eso incluiría la obtención de cubetas grandes, pozos más grandes para la incubación y el aumento de volumen de medio de cultivo de la retina. Sin embargo, por E12-14 el epitelio pigmentario y el segmento exterior de lacélulas fotorreceptoras se vuelven estrechamente asociada, y la eliminación del epitelio pigmentario pueden dañar la retina. La retina debe estar intacto durante todo el procedimiento experimental y de incubación.
Con esta disección y el protocolo de cultivo, la integridad estructural de la arquitectura de la retina permanece intacta durante 24 horas, basado en la expresión de marcadores específicos tipo de célula. Como se ha mencionado, hemos estudiado la progresión del ciclo celular en los explantes y el proceso de la migración nuclear interkinetic de las células progenitoras de la retina se ve normal. Si no se realiza el protocolo rápidamente sólo hay pequeños efectos sobre la progresión del desarrollo en el explante. Sin embargo, el desarrollo puede ser desaceleró ligeramente y un explante que ha sido cultivado durante 24 hr puede presentar una edad de desarrollo que es de 1-2 hr más joven que la contraparte normal. Se recomienda comparar el explante de retina normal de la misma edad y se recomienda utilizar el ojo contralateral como expl experimentalcontrol de hormigas. Cabe señalar que la eliminación del epitelio pigmentario de la retina puede afectar el desarrollo de los segmentos fotorreceptores externos. También hay que señalar que una retina explante representa una retina lesionada con las células ganglionares de la retina axotomizadas.
Este protocolo es simple y por lo tanto reduce los errores experimentales, pero el ex ovo situación exige varios controles experimentales. Un proceso de desarrollo específico que está sujeto a ser estudiado el uso de esta ex ovo protocolo también puede ser estudiado en paralelo y se compara con la situación normal en la ovo. Los controles experimentales apropiados siempre deben ser incluidos, tales como los vehículos utilizados para solubilizar sustancias. Al utilizar bloqueadores de señal vía, utilizar varios inhibidores diferentes para el mismo proceso o utilizar diferentes inhibidores de enzimas que se dirigen a más de un nivel de la vía específica que se estudia. Para la electroporación, un plásmido de ADN que expresan GFP es un útilcontrol positivo sa. Si tal plásmido no produce ninguna expresión del gen informador, es más probable debido a que el ánodo (+) y el cátodo (-) están posicionados incorrectamente. El plásmido de ADN entonces migrar fuera de la retina. Al probar nuevos plásmidos de ADN por lo tanto se recomienda incluir un plásmido de ADN que expresa una proteína fluorescente diferente como un control interno de la electroporación. Los parámetros de electroporación descritos en este protocolo se han optimizado para producir un elevado número de células que expresan el gen reportero. La disminución de la tensión o el número de impulsos reduce el número de células transfectadas, lo que puede producir resultados falsos negativos. Sin embargo, el aumento de la tensión o el número de impulsos puede conducir a daño del tejido y el aumento de la muerte celular. Tres conjuntos de electrodos de platino por encargo se han utilizado para todos los electroporaciones durante más de dos años sin mostrar ninguna capacidad reducida. Los electrodos deben limpiarse cuidadosamente y el surfac electrodoser pulido e. 4 mm comerciales electrodos paddle están disponibles.
Este protocolo se centra en la electroporación de plásmidos de ADN y el tratamiento químico de los explantes de retina enteros. Es posible ampliar aún más este protocolo para incluir otros procedimientos experimentales, tales como un knock-down de la expresión génica con el uso de oligómeros de morfolino. El procedimiento de explante retina entera se abre la posibilidad de realizar experimentos a corto plazo de una manera fácil, rápida y altamente reproducible. Reduce los costos, el tiempo y el número de animales necesarios para cada experimento y lo más importante que aumenta la posibilidad de obtener datos sólidos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1xPBS (tablet) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10x DPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 734-0006 | |
| 100 μl pipette tips | VWR | 613-0798 | |
| 1.5 ml disposable plastic cuvette | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24-well plate | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm Petri dish | VWR | 391-1998 | |
| 70% ethanol | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inhibitor III | 217714 | Calbiochem | 300 nM in 0.01% DMSO |
| Cell culture incubator | Thermo Forma | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Electrodes | Platina, custom made | ||
| Electro square porator ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 Nutrient mix | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Forceps | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Freezing medium NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| GFP expressing DNA plasmid (pZGs) | |||
| Humidified incubator | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| Mounting medium ProLong Gold with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Paraffin film | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way embedding mold | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicillin streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| PhosphoHistone 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Dilution 1/4,000 |
| Platinum electrodes (custom made from "rondelles") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Dia: 4mm, 0.1 mm thickness |
| Platimun electrodes | Sonidel | CUY700P4L | Dia: 4 mm |
| Polyethylene pasteur pipette | VWR | 612-2853 | |
| Rotator shaker | VWR | 444-2900 | |
| Small spoon | VWR | 231-2151 | |
| Sucrose | VWR | 443815S | |
| White Leghorn eggs | Local supplier | ||
| Wine cooler | WineMaster 24, Caso, Berlin Germany |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Method. 24, 43-48 (2001).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain. J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. J Vis Exp. , (2012).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina. Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).
- Tomita, K., et al. Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis. Neuro. 16, 723-734 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).
- Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors. Exp eye re. 93, 556-564 (2011).
- Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway. Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).
- Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest. Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).
- Sauer, F.
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).
