Summary

Espianti di retina intero da pollo embrioni per trattamenti di elettroporazione e Agenti chimici

Published: September 30, 2015
doi:

Summary

Questo protocollo descrive un metodo per analizzare, sperimentalmente manipolare e cultura interi espianti di retina di embrioni di pollo. Le culture espianto sono utili quando alto tasso di successo, l'efficacia e riproducibilità sono necessari per testare gli effetti di plasmidi per elettroporazione e / o di sostanze reagenti, vale a dire, gli inibitori enzimatici.

Abstract

La retina è un buon modello per il sistema nervoso centrale di sviluppo. Le grandi dimensioni degli occhi e, soprattutto, l'accessibilità per le manipolazioni sperimentali in ovo / in vivo rende il pollo retina embrionale un modello sperimentale versatile e molto efficiente. Anche se la retina pollo è facile bersaglio in ovo da iniezioni intraoculari o elettroporazione, la concentrazione efficace e precisa dei reagenti all'interno della retina può essere difficile da completamente il controllo. Ciò può essere dovuto a variazioni del sito di iniezione esatta, fuoriuscita dall'occhio o diffusione uniforme delle sostanze. Inoltre, la frequenza di malformazioni e mortalità dopo manipolazioni invasive come l'elettroporazione è piuttosto elevato.

Questo protocollo descrive un ex ovo tecnica per la coltura di espianti retinici interi da embrioni di pollo e fornisce un metodo per esposizione controllata della retina ai reagenti. Il protocol descrive come sezionare, sperimentalmente manipolare, e la cultura interi espianti di retina di embrioni di pollo. Gli espianti possono essere coltivate per circa 24 ore ed essere sottoposti a diverse manipolazioni come elettroporazione. I principali vantaggi sono che l'esperimento non dipende la sopravvivenza dell'embrione e che la concentrazione del reagente introdotto può essere variata e controllata al fine di determinare e ottimizzare la concentrazione efficace. Inoltre, la tecnica è rapida, economica e, insieme con il suo alto tasso di successo sperimentale, assicura riproducibile risultati. Va sottolineato che serve come un ottimo complemento per esperimenti eseguiti in ovo.

Introduction

La retina è parte del sistema nervoso centrale ed è, con la sua relativa semplicità e architettura cellulare ben caratterizzato, un modello popolare per lo studio dello sviluppo del sistema nervoso centrale. L'occhio dell'embrione di pollo è relativamente grande rispetto al resto dell'embrione. E 'quindi facilmente accessibile in ovo per manipolazioni sperimentali, come le iniezioni o elettroporazione, e serve come un ottimo strumento per acquisire conoscenze su cellule della retina e biologia dello sviluppo in vivo. Nonostante questi importanti vantaggi, la sopravvivenza degli embrioni può essere basso quando gli esperimenti sono invasivi come ad esempio con electroporations, iniezioni ripetute o manipolazioni sperimentali combinati.

Elettroporazione di plasmidi DNA nell'embrione di pollo in ovo è una importante e consolidata tecnica 1. Esso consente per l'etichettatura dei neuroni, tracciando del destino delle cellule, così come tratti neuronali nella NERV centroSistema di unità organizzative e permette per l'espressione genica ectopica di analizzare la funzione delle proteine ​​in vivo. La tecnica è stata utilizzata per gli studi di tubo neurale 2, romboencefalo 3, 4 e della retina. Elettroporazione di retina embrionale in ovo ha qualche difficoltà sperimentali che sono legati alla situazione in vivo. La posizione dell'occhio, a causa della piegatura craniale dell'embrione, è relativamente vicino al cuore. Questa vicinanza aumenta il rischio di arresto cardiaco dopo l'elettroporazione, e il rischio aumenta con l'età dell'embrione. Inoltre, per accedere l'occhio, è necessario aprire le membrane embrionali, aumentando così il rischio di sanguinamento, malformazioni e conseguente ridotta vitalità. Durante il test e l'ottimizzazione di un nuovo plasmide DNA spesso senza un risultato fenotipico noto, queste limitazioni possono diminuire l'efficacia e la potenza del metodo anche per un sperimentalista con esperienza. Come presentato in questo protocollo, la cultura del wespianto foro retina, definito come l'insieme retina neurale con dell'epitelio pigmentato rimosso, è un metodo efficace che completa l'approccio in ovo.

Iniezioni intraoculari di reagenti chimici sono relativamente facili da eseguire in ovo. Tuttavia, la concentrazione efficace e precisa dei reagenti iniettati all'interno della retina neurale può essere difficile controllare completamente. Il volume iniettato può variare a causa delle perdite e il luogo esatto di iniezione può influenzare sia la distribuzione del reagente all'interno dell'occhio e la diffusione attraverso il corpo vitreo. La variabilità avrà importanti implicazioni per l'interpretazione dei risultati, quando cioè una curva dose-risposta per un inibitore viene definito sulla; in particolare se l'effetto è piccola e la finestra temporale dell'effetto è stretta. Inoltre, solo un occhio può essere utilizzato da ogni embrione durante l'esecuzione in esperimenti ovo a causa di potenziali effetti sistemici attraverso il flusso sanguignosul occhio controlaterale. Età matching è importante quando si studia lo sviluppo e la variabilità individuale tra trattati e degli embrioni di controllo possono portare a ulteriore variabilità sperimentale.

Per queste ragioni, un ex ovo metodo basato su espianti retinici da embrioni di pollo è stato sviluppato, in cui la retina neurale può essere esposto ad una uniforme e controllato condizione sperimentale in vitro. Il presente protocollo è stato sviluppato sulla base di precedenti protocolli 5-9. Espianti di retina di fase (st) 20 (giorni embrionali [E] 3) a ST31 (E7) embrioni di pollo sono stati sezionati, colto e elettroporate con una concentrazione di DNA plasmidico definita o esposti ad un terreno contenente una concentrazione definita di un reagente chimico. Il protocollo presentato qui è stato implementato con successo in pubblicazioni recenti, utilizzando diversi reagenti chimici diversi, tra cui le autorità di regolamentazione della via danno al DNA, come KU55933, SB 218.078, e NSC 109555 Ditosylate, e il ciclo cellulare, come Cdk1 / 2 inibitore III 10,11.

Protocol

Questo protocollo è eseguita in conformità con le raccomandazioni nella "Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio dell'Associazione per la ricerca in visione e oculistica". 1. Manipolazione Uovo e la raccolta degli occhi Conservare le uova bianche Livorno a 12-14 ° C per non più di 1 settimana. Se disponibile, utilizzare un dispositivo di raffreddamento di vino refrigerato per conservare le uova fecondate. Nota: temperatura del serbatoio pi?…

Representative Results

Questo protocollo descrive la preparazione (Figura 1A-F) e coltura di espianti retinici interi da embrioni di pollo. Questo protocollo è stato usato con successo per interi espianti di retina da embrioni di ST20 (E3) a ST31 (E7). Elettroporazione di plasmidi DNA in tutto espianti di retina permette per l'etichettatura e la tracciabilità delle cellule progenitrici della retina o sovra-espressione di diversi prodotti genici. Per gli esperimenti di elettroporazione, l&#39…

Discussion

In questo lavoro viene presentato un protocollo dettagliato per la dissezione, elettroporazione o trattamento chimico, e la coltura di interi espianti di retina di embrioni di pollo. Questo protocollo è facile, veloce e consente sia un alto tasso di successo e riproducibile risultati.

Elettroporazione di interi espianti retinici produce grandi aree di cellule che esprimono il costrutto gene di interesse. È facile posizionare correttamente gli elettrodi e di esporre una p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond and St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier.

Materials

1xPBS (tablet) Life technologies 18912-014
10xDPBS Life technologies 14080-048
100 mm Petri dish VWR 734-0006
100 μL pipette tips VWR 613-0798
1.5 mL disposable plastic cuvette Thomas Scientific 8495V01
24-well plate Sigma Aldrich D7039
35 mm Petri dish VWR 391-1998
70% ethanol Solveco 1054
Cdk1/2 inhibitor III 217714 Calbiochem 300nM in 0.01% DMSO
Cell culture incubator Thermo Forma
Dissecting microscope Leica
DMEM Life Technologies 41966-029
Electrodes Platina, custom made
Electro square porator ECM 830 Harvard Apparatus
F12 Nutrient mix Life Technologies 31331-028
FBS Life Technologies 16140-071
Forceps AgnThos 0108-5-PS
Freezing medium NEG50 Cellab, Sweden 6502
GFP expressing DNA plasmid (pZGs)
Humidified incubator Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany 8204
Insulin Sigma Aldrich I9278-5ML
L-glutamine Life Technologies 25030024
Mounting medium ProLong Gold with DAPI Life Technologies P36935
Paraffin film VWR 291-1214P
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 16005-1KG-R
Peel-A-Way embedding mold  Sigma Aldrich E6032
Penicillin streptomycin Life Technologies 15140-122
PhosphoHistone 3 (PH3)  Millipore 06-570 Dilution 1/4000
Platinum electrodes (custom made from "rondelles") Sargenta 390-R (rondeller) Dia: 4mm, 0.1 mm thickness
Platimun electrodes  Sonidel CUY700P4L Dia: 4 mm
Polyethylene pasteur pipette VWR 612-2853
Rotator shaker VWR 444-2900
Small spoon VWR 231-2151
Sucrose VWR 443815S
White Leghorn eggs Local supplier
Wine cooler WineMaster 24, Caso, Berlin Germany

References

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Cite This Article
Shirazi Fard, S., Blixt, M., Hallböök, F. Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments. J. Vis. Exp. (103), e53202, doi:10.3791/53202 (2015).

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