Summary
इस प्रोटोकॉल, काटना प्रयोगात्मक हेरफेर और चिकन भ्रूण से संस्कृति पूरे रेटिना explants के लिए एक विधि का वर्णन है। उच्च सफलता दर, प्रभावकारिता और reproducibility electroporation और / या अभिकर्मक पदार्थ, यानी, एंजाइमी अवरोधकों के लिए plasmids के प्रभाव का परीक्षण करने की जरूरत है जब explant संस्कृतियों उपयोगी होते हैं।
Abstract
रेटिना के विकास के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए एक अच्छा मॉडल है। ओवो / इन विवो में प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के लिए आंख के बड़े आकार और सबसे महत्वपूर्ण बात पहुंच चिकन भ्रूण रेटिना एक बहुमुखी और बहुत ही कुशल प्रयोगात्मक मॉडल बनाता है। चिकन रेटिना intraocular इंजेक्शन या electroporation द्वारा ओवो में लक्षित करना आसान है, रेटिना के भीतर अभिकर्मकों के प्रभावी और सटीक एकाग्रता पूरी तरह से नियंत्रण करने के लिए मुश्किल हो सकता है। यह आंख या पदार्थों का असमान प्रसार से सटीक इंजेक्शन साइट, रिसाव की विविधताओं के कारण हो सकता है। इसके अलावा, इस तरह के इलेक्ट्रोपोरेशन के रूप में आक्रामक जोड़तोड़ के बाद विकृतियों और मृत्यु दर की आवृत्ति बल्कि उच्च है।
इस प्रोटोकॉल चिकन भ्रूण से पूरे रेटिना explants संवर्धन के लिए तकनीक ओवो एक पूर्व वर्णन करता है और अभिकर्मकों के लिए रेटिना के नियंत्रित तक पहुंचाने के लिए एक तरीका प्रदान करता है। आद्यकर्नल प्रयोगात्मक, काटना हेरफेर, और चिकन भ्रूण से संस्कृति पूरे रेटिना explants करने के लिए कैसे करें। explants लगभग 24 घंटे के लिए संवर्धित किया जा सकता है और इस तरह इलेक्ट्रोपोरेशन के रूप में विभिन्न जोड़तोड़ के अधीन हो। प्रमुख लाभ प्रयोग भ्रूण के अस्तित्व पर और शुरू की अभिकर्मक की एकाग्रता विविध और प्रभावी एकाग्रता का निर्धारण और अनुकूलन करने के क्रम में नियंत्रित किया जा सकता है कि निर्भर नहीं है कि कर रहे हैं। इसके अलावा, तकनीक इसकी उच्च प्रयोगात्मक सफलता दर के साथ एक साथ, तेजी से सस्ता और है, यह प्रतिलिपि प्रस्तुत करने को सुनिश्चित करता है परिणाम है। ऐसा लगता है कि ओवो में प्रदर्शन प्रयोगों के लिए एक उत्कृष्ट पूरक के रूप में कार्य करता है कि जोर दिया जाना चाहिए।
Introduction
रेटिना केंद्रीय तंत्रिका तंत्र का हिस्सा है और यह उसके रिश्तेदार सादगी और अच्छी तरह से विशेषता सेलुलर वास्तुकला, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विकास के अध्ययन के लिए एक लोकप्रिय मॉडल के साथ है। चिकन भ्रूण की आंख भ्रूण के बाकी की तुलना में अपेक्षाकृत बड़ी है। इसलिए यह इस तरह के इंजेक्शन या electroporation के रूप में प्रयोगात्मक जोड़तोड़, के लिए ओवो में आसानी से सुलभ है, और रेटिना सेल और vivo में विकास जीव विज्ञान के बारे में ज्ञान हासिल करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण के रूप में कार्य करता है। प्रयोगों electroporations दोहराया, इंजेक्शन, या संयुक्त प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के साथ ही इस तरह के आक्रामक रहे हैं जब इन बड़े फायदे के बावजूद, भ्रूण के अस्तित्व कम हो सकता है।
ओवो में चिकन भ्रूण में डीएनए plasmids के electroporation एक महत्वपूर्ण और अच्छी तरह से स्थापित तकनीक 1 है। यह केंद्रीय nerv में सेल भाग्य के साथ-साथ न्यूरोनल इलाकों की ट्रेसिंग, न्यूरॉन्स की लेबलिंग के लिए अनुमति देता हैous प्रणाली और यह विवो में प्रोटीन समारोह का विश्लेषण करने के लिए अस्थानिक जीन अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है। तकनीक 3 hindbrain, और 4 रेटिना, न्यूरल ट्यूब 2 की पढ़ाई के लिए इस्तेमाल किया गया है। ओवो में भ्रूण रेटिना के electroporation vivo स्थिति से संबंधित हैं जो कुछ प्रयोगात्मक कठिनाइयों है। भ्रूण के कपाल तह के कारण आंख की स्थिति, दिल के लिए अपेक्षाकृत करीब है। इस निकटता इलेक्ट्रोपोरेशन निम्नलिखित हृदय की गिरफ्तारी का खतरा है, और भ्रूण की उम्र के साथ जोखिम बढ़ जाती है बढ़ जाती है। इसके अलावा, आंख का उपयोग करने के लिए है, यह है, जिससे खून बह रहा है, विकृतियों और बाद में कम हो व्यवहार्यता के लिए खतरा बढ़ रही है, भ्रूण झिल्ली को खोलने के लिए आवश्यक है। परीक्षण और एक ज्ञात प्ररूपी परिणाम के बिना अक्सर एक नई डीएनए प्लाज्मिड जब अनुकूलन, इन सीमाओं भी एक अनुभवी प्रयोगवादी के लिए विधि की प्रभावकारिता और शक्ति कम हो सकती है। इस प्रोटोकॉल, w की संस्कृति के रूप में पेशहटा दिया वर्णक उपकला के साथ पूरे तंत्रिका रेटिना के रूप में परिभाषित छेद रेटिना explant, ओवो दृष्टिकोण में पूरक है कि एक कारगर तरीका है।
रासायनिक अभिकर्मकों के intraocular इंजेक्शन ओवो में प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत आसान कर रहे हैं। हालांकि, तंत्रिका रेटिना के भीतर इंजेक्शन अभिकर्मकों के प्रभावी और सटीक एकाग्रता पूरी तरह से नियंत्रित करने के लिए मुश्किल हो सकता है। इंजेक्शन की मात्रा रिसाव के कारण भिन्न हो सकते हैं और इंजेक्शन की सटीक साइट आंख के भीतर अभिकर्मक के वितरण और कांच का शरीर के माध्यम से प्रसार दोनों को प्रभावित कर सकता है। परिवर्तनशीलता यानी, एक एंजाइम अवरोध करनेवाला के लिए एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र चुना गया है जब परिणामों की व्याख्या के लिए प्रमुख प्रभाव होगा; प्रभाव छोटा है और प्रभाव के अस्थायी खिड़की संकीर्ण है, खासकर अगर। ओवो प्रयोगों में प्रदर्शन कर इसके अलावा, जब केवल एक ही आंख की वजह से रक्त प्रवाह के माध्यम से संभावित प्रणालीगत प्रभाव के लिए प्रत्येक भ्रूण से इस्तेमाल किया जा सकताcontralateral आंख पर। विकास और इलाज और नियंत्रण भ्रूण अतिरिक्त प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के बीच व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता का अध्ययन करते समय उम्र मिलान महत्वपूर्ण है।
इन कारणों के लिए, चिकन भ्रूण से रेटिना explants पर आधारित पद्धति ओवो एक पूर्व में जो तंत्रिका रेटिना एक समान करने के लिए अवगत कराया जा सकता है और इन विट्रो में प्रयोगात्मक हालत नियंत्रित, विकसित किया गया था। वर्तमान प्रोटोकॉल पिछले प्रोटोकॉल 5-9 के आधार पर विकसित किया गया था। मंच से रेटिना explants (अनुसूचित जनजाति) st31 करने के लिए 20 (3 भ्रूण दिन [ई]) (E7) चिकन भ्रूण सुसंस्कृत, विच्छेदित और electroporated एक परिभाषित डीएनए प्लाज्मिड एकाग्रता के साथ या एक रासायनिक अभिकर्मक के एक परिभाषित एकाग्रता युक्त एक माध्यम से अवगत कराया गया। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक ऐसी KU55933, एस.बी. 218,078, और एनएससी 109,555 dito के रूप में डीएनए की क्षति मार्ग के नियामकों, सहित कई विभिन्न रासायनिक अभिकर्मकों का उपयोग, हाल के प्रकाशनों में लागू किया गया हैऐसे Cdk1 / 2 अवरोध करनेवाला तृतीय 10,11 के रूप में sylate, और सेल चक्र,।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
इस प्रोटोकॉल "दृष्टि और नेत्र विज्ञान के क्षेत्र में अनुसंधान के लिए एसोसिएशन की प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड" में सिफारिशों के अनुसार किया जाता है।
1. अंडा हैंडलिंग और नेत्र संग्रह
- एक सप्ताह से अधिक समय के लिए 12-14 डिग्री सेल्सियस पर सफेद लिवोमो अंडे की दुकान। यदि उपलब्ध है, निषेचित अंडे की दुकान के लिए एक प्रशीतित शराब कूलर का उपयोग करें।
नोट: कम तापमान मृत्यु दर बढ़ जाती है, जबकि उच्चतर दुकान तापमान, भ्रूण के असामान्य विकास के लिए नेतृत्व। विस्तारित भंडारण के समय मृत्यु दर और असामान्य विकास दोनों बढ़ जाती है। - कोमल 24 घंटा प्रति 5 गुना की एक आवृत्ति पर कमाल के साथ एक 37.5 डिग्री सेल्सियस में अंडे और 60% humidified अंडे इनक्यूबेटर सेते हैं।
- वांछित भ्रूण उम्र में अंडे इनक्यूबेटर से incubated अंडे निकालें।
नोट: चिकन भ्रूण की उम्र ऊष्मायन के समय के रूप में चुना गया है और भ्रूण दिन (ई) के रूप में या चरणों के रूप में चिह्नित है (अनुसूचित जनजाति), हैम्बर्गर और हैमिल्टन 12 से वर्णित विकास के चरणों की श्रृंखला के अनुसार। - लामिना का प्रवाह हुड में चयनित अंडे रखें। भ्रूण के संक्रमण से बचने के लिए 70% इथेनॉल के साथ खोल साफ कर लें।
नोट: बाँझ समाधान के साथ सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत सभी प्रक्रियाओं का संचालनhttp://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions और उपकरणों। - अंडा खुला दरार करने के लिए मजबूती से एक कठिन सतह के खिलाफ अंडे की ओर ठोकर। एक 100 मिमी पेट्री डिश में सामग्री रखें। सूखने से ऊतक को रोकने के लिए पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) 1x पीबीएस युक्त एक 35 मिमी पेट्री डिश के लिए भ्रूण हस्तांतरण करने के लिए एक छोटा चम्मच का प्रयोग करें।
- लामिना का प्रवाह हुड में एक दूरबीन stereovision विदारक माइक्रोस्कोप पर भ्रूण ऊतक युक्त 35 मिमी पेट्री डिश रखें। ठीक संदंश के साथ गर्दन pinching द्वारा भ्रूण सिर काटना और शरीर त्यागने।
- वें एक चीरा बनाने के लिए ठीक संदंश का प्रयोग करेंआंखों के लिए उदर किसी न किसी तरह मुंह,। चीरा की साइट पर शुरू, पूरे आंख के आसपास के ऊतक खुला आंसू। ऑप्टिक तंत्रिका चुटकी और थैली से बरकरार आंख को हटा दें। नियंत्रण या इलाज आंख के रूप में उपयोग के लिए एक ही भ्रूण से बाईं और दाईं आंख दोनों लीजिए।
- पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) 1x पीबीएस युक्त एक नया 35 मिमी पेट्री डिश के लिए आंखों के हस्तांतरण के लिए एक छोटा चम्मच का प्रयोग करें।
पूरे रेटिना explants की 2. तैयारी
- Scleral मूलरूप सहित आंख के आसपास सभी ऊतक निकालने के लिए ठीक संदंश का प्रयोग करें।
नोट: ऊतक आसानी वर्णक उपकला बरकरार (चित्रा 1 ए-बी) के साथ कांच का शरीर और लेंस पर रेटिना छोड़ने अलग होगा। - तंत्रिका रेटिना (चित्रा 1 सी) को नुकसान पहुँचाए बिना आंख के पृष्ठीय भाग में वर्णक उपकला में एक छोटा सा चीरा चुटकी ठीक संदंश का प्रयोग करें।
- धीरे वर्णक उपकला starti खोलने के आंसू ठीक संदंश का प्रयोगचीरा के स्थल पर एनजी लेंस और कांच का शरीर (चित्रा -1) से जुड़ी पूरे रेटिना को छोड़कर। वर्णक उपकला को हटाने की सुविधा के लिए गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) 1x पीबीएस में नजर रखें।
वर्णक उपकला आंख के पूर्वकाल क्षेत्र में, पुतली के आसपास सिलिअरी शरीर के साथ विशेष रूप से, दूर करने के लिए मुश्किल हो सकता है, और रंजित विदर साथ: ध्यान दें। इसलिए, वर्णक उपकला के कुछ तंत्रिका रेटिना (चित्रा 1E-एफ) पर छोड़ा जा सकता है।
पूरे रेटिना explants की 3. उपचार
- पूरे रेटिना explants के electroporation
नोट: पूरे रेटिना explants के electroporation चरण 2 के बाद सीधे किया जा सकता है।- 1 DMEM: F12 के पोषक तत्व मिश्रण, 10% FBS, 10 यू / एमएल पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन, 5 माइक्रोग्राम / एमएल इंसुलिन, और 2 मिमी एल glutamine 1 युक्त संस्कृति के माध्यम से तैयार करें।
- एक 1.5 मिलीलीटर डिस्पोजेबल प्लास्टिक क्युवेट कट (12.5 मिमी x 12.5 मिमी x 45 मीटरएम) (या एक ठीक-पंखों देखा का उपयोग तल से) लगभग 8 मिमी 300-400 μl समाधान धारण करने में सक्षम किसी भी छोटे कंटेनर।
- 0.1 माइक्रोग्राम / μl के अंतिम एकाग्रता के लिए 1xDPBS में पसंद की डीएनए प्लाज्मिड पतला।
- ST20 के लिए 15 वी तक electroporator और निर्धारित मापदंडों पर बारी - st25 (E3-इ 4) रेटिना और st26 के लिए 20 वी - st27 (ई 5) रेटिना। 1 सेकंड के अंतराल के साथ 50 मिसे नाड़ी-लंबाई के 5 दालों के लिए पल्स-दोहराता सेट करें। दोनों हाथों जगह में इलेक्ट्रोड धारण करने के लिए आवश्यक हो जाएगा के रूप में फर्श पर एक पैर पेडल द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है कि एक पल्स जनरेटर का प्रयोग करें।
- दो चप्पू के आकार का (फ्लैट, परिपत्र व्यास। 4 मिमी) से कनेक्ट प्लैटिनम इलेक्ट्रोड (2A चित्रा) पल्स जनरेटर पर उत्पादन सॉकेट करने के लिए।
नोट: इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल प्लैटिनम इलेक्ट्रोड विश्वविद्यालय कार्यशाला द्वारा किए गए थे। इलेक्ट्रोड 0.1 मिमी प्लैटिनम प्लेट "rondelles" (: 950 पं / 5 घन प्लेटिनम ग्रेड) से किए गए थे। को जोड़ने 0.8 मिमी वाईफिर से प्लास्टिक ट्यूबिंग का उपयोग कर अछूता था। - ध्यान से रेटिना explant के लिए सही टिप-उद्घाटन आकार प्राप्त करने के लिए काट टिप के साथ एक पॉलीथीन पाश्चर विंदुक का उपयोग क्युवेट (या समतुल्य छोटे कंटेनर) के लिए 2.3 कदम से पूरे रेटिना explant हस्तांतरण। रेटिना प्लास्टिक के लिए देते हैं और इसके अलावा आंसू जाता है के रूप में पिपेट युक्तियों का उपयोग करने से बचें।
- धीरे फाड़ से बचने के लिए रेटिना को छूने के लिए नहीं रेटिना explant देखभाल के आसपास के पूरे 1x पीबीएस दूर करने के लिए एक 100 μl पिपेट का प्रयोग करें।
- पूरे रेटिना explant कवर करने के लिए क्युवेट के लिए 100 μl प्लाज्मिड समाधान जोड़ें। यह शीर्ष करने के लिए मंगाई है, तो धीरे संदंश के साथ रेटिना explant नीचे धक्का। क्युवेट की तह तक क्युवेट और ऑप्टिक तंत्रिका में से किसी एक पक्ष का सामना करने के लिए लेंस की स्थिति के लिए संदंश या इलेक्ट्रोड का प्रयोग करें।
- ऊतक को छूने के बिना, लेंस और रेटिना (2A चित्रा) के पीछे नकारात्मक इलेक्ट्रोड के सामने सकारात्मक इलेक्ट्रोड रखें।
- पैर पेडल नीचे दबाकर वर्तमान लागू करें। सफल निर्वहन का संकेत इलेक्ट्रोड पर बुलबुले के लिए जाँच करें।
- रेटिना को नुकसान पहुँचाए बिना क्युवेट से सभी प्लाज्मिड मिश्रण को दूर करने के लिए एक 100 μl पिपेट का प्रयोग करें। प्लाज्मिड मिश्रण तीन से पांच बार पुन: उपयोग किया जा सकता है।
- पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) 1x पीबीएस के साथ क्युवेट भरें। धीरे क्युवेट की दीवार से रेटिना explant अलग करने के लिए संदंश का प्रयोग करें। Electroporation के बाद रेटिना कभी कभी यह क्युवेट की दीवार का पालन करता है, जो बुलबुले के साथ कवर किया जाता है।
- अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) संस्कृति के माध्यम से युक्त एक 24 अच्छी तरह से थाली में पूरे रेटिना explant हस्तांतरण करने के लिए पॉलीथीन पाश्चर विंदुक का प्रयोग करें। अच्छी तरह से प्रति एक रेटिना explant सेते हैं।
- 24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ एक सेल इनक्यूबेटर अंदर, 50 आरपीएम की एक स्थिर गति के साथ, एक रोटेटर प्रकार के बरतन पर 37 डिग्री सेल्सियस पर रेटिना explant सेते हैं। रोटेशन मध्यम करने के लिए और preve के लिए अधिकतम प्रदर्शन सुनिश्चित करने के लिए है24 अच्छी तरह से थाली के नीचे करने के लिए रेटिना के NT आसंजन।
- 4 कदम आगे बढ़ें।
- रासायनिक अभिकर्मकों के साथ पूरे रेटिना explants का उपचार
नोट: पूरे रेटिना explants का रासायनिक उपचार चरण 2 के बाद सीधे किया जा सकता है।- 1 DMEM: F12 के पोषक तत्व मिश्रण, 10% FBS, 10 यू / एमएल पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन, 5 माइक्रोग्राम / एमएल इंसुलिन, और 2 मिमी एल glutamine 1 युक्त संस्कृति के माध्यम से तैयार करें।
- अच्छी तरह से प्रति (37 डिग्री सेल्सियस) संस्कृति के माध्यम से पूर्व गर्म 1 मिलीग्राम से युक्त एक 24 अच्छी तरह से थाली में 2.3 कदम से रेटिना explant हस्तांतरण करने के लिए एक छोटा चम्मच का प्रयोग करें। अच्छी तरह से प्रति एक रेटिना explant सेते हैं।
- एक रासायनिक अभिकर्मक या वाहन को जोड़ने से पहले 5% सीओ 2 के साथ एक सेल इनक्यूबेटर अंदर, 50 आरपीएम की एक स्थिर गति के साथ, एक रोटेटर प्रकार के बरतन पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए पूरे रेटिना explant सेते हैं।
- उदाहरण के लिए, रासायनिक घोल तैयार करें Cdk1 / 2 अवरोध करनेवाला तृतीय, फाइनल में एम चरण प्रगति 13 के एक अवरोध,DMSO में 30 माइक्रोन की एकाग्रता।
- सेल इनक्यूबेटर से, पूरे रेटिना explant युक्त, 24 अच्छी तरह से थाली निकालें। 0.01% DMSO में 300 एनएम Cdk1 / 2 अवरोध करनेवाला तृतीय के अंतिम एकाग्रता, जिसके परिणामस्वरूप रेटिना मध्यम करने के लिए सीधे रासायनिक अभिकर्मक या वाहन (DMSO) के 10 μl जोड़ें। मैन्युअल समाधान में रासायनिक अभिकर्मक या वाहन का भी वितरण के लिए अनुमति देने के लिए 24 अच्छी तरह से थाली बारी बारी से।
- वांछित समय (अप करने के लिए 24 घंटे) के लिए 5% सीओ 2 के साथ एक मशीन के अंदर, 50 आरपीएम की एक स्थिर गति के साथ, एक रोटेटर प्रकार के बरतन पर 37 डिग्री सेल्सियस पर रेटिना explants सेते हैं।
- 4 कदम आगे बढ़ें।
4. फिक्सेशन और पूरे रेटिना Eexplants की ठंड
- सेल इनक्यूबेटर से इलाज पूरे रेटिना explant युक्त 24 अच्छी तरह से थाली निकालें।
- 1 मिलीलीटर 1xPBS में / अच्छी तरह से बर्फ के ठंडे 4% paraformaldehyde युक्त एक 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए रेटिना explant हस्तांतरण करने के लिए एक छोटा चम्मच का प्रयोग करें। Incuba15 मिनट के लिए बर्फ पर ते।
- रेटिना को धोने के लिए 1 मिलीग्राम / अच्छी तरह से बर्फ के ठंडे 1xPBS युक्त एक 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए पूरे रेटिना explant हस्तांतरण करने के लिए एक छोटा चम्मच का प्रयोग करें। 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
- 1 मिलीग्राम / 1xPBS में अच्छी तरह से बर्फ के ठंडे 30% सूक्रोज युक्त एक 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए पूरे रेटिना explant हस्तांतरण करने के लिए एक छोटा चम्मच का प्रयोग करें। 1-3 घंटे रेटिना के भ्रूण दिन के आधार पर लिए बर्फ पर सेते हैं। ST20 के लिए - st25 (E3) रेटिना, 1 घंटे के लिए सेते हैं, पुराने रेटिना सुक्रोज में अब ऊष्मायन समय की जरूरत है।
- लगभग 500 μl cryostat ठंड बढ़ते मध्यम युक्त एक आयल फिल्म पर पूरे रेटिना explant हस्तांतरण करने के लिए एक छोटा चम्मच का प्रयोग करें। धीरे छोटे चम्मच का उपयोग ठंड मध्यम में रेटिना explant ले जाकर के रूप में ज्यादा सुक्रोज संभव के रूप में निकालें।
- ठंड मध्यम युक्त एक embedding मोल्ड करने के लिए रेटिना explant स्थानांतरण। भविष्य सेक्शनिंग की सुविधा के लिए आंख की स्थिति। डॉ पर पूरे रेटिना explant युक्त embedding ढालना रखोमध्यम जब तक Y बर्फ ठोस जमे हुए है। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
इस प्रोटोकॉल चिकन भ्रूण से पूरे रेटिना explants की तैयारी (चित्रा 1 ए-एफ) और संवर्धन का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक st31 को ST20 (E3) के भ्रूण से पूरे रेटिना explants (E7) के लिए इस्तेमाल किया गया है।
पूरे रेटिना explants में डीएनए plasmids के electroporation रेटिना पूर्वज कोशिकाओं की लेबलिंग और पता लगाने के लिए या अधिक अभिव्यक्ति अलग जीन उत्पादों की अनुमति देता है। इलेक्ट्रोपोरेशन प्रयोगों के लिए, वर्णक उपकला ध्यान से एक st25 (इ 4 आधा) भ्रूण के enucleated आंख से हटा दिया गया था। पूरे रेटिना explant तो डीएनए प्लाज्मिड समाधान युक्त क्युवेट में रखा गया था, इलेक्ट्रोड (2A चित्रा) डूबे हुए थे और एक मौजूदा लागू किया गया था। संवर्धन के 24 घंटे के बाद, GFP सकारात्मक कोशिकाओं बरकरार रेटिना (चित्रा 2 बी) के एक बड़े हिस्से में दिखाई दे रहे थे। सेक्शनिंग के बाद, एकल GFP + कोशिकाओं को आसानी से रेटिना के apico-बेसल अक्ष (फाई के साथ पाया गयाGure -2)। Electroporation एक बड़ी रेटिना क्षेत्र प्लाज्मिड ले रही है और पत्रकार जीन को व्यक्त करने में हुई। एक electroporated क्षेत्र की कुल रेटिना के 1/5 से भी बड़ा है, के साथ रेटिना की संख्या से मापा सफलता की दर, 263 आँखों से बाहर 14% (37 की तुलना में, पूरे रेटिना explant electroporation के लिए (83 retinas के बाहर 62) 75% थी ) ओवो electroporation में के लिए। पूरे रेटिना explants पर electroporation प्रयोगों सफलतापूर्वक st27 (ई 5) भ्रूण के लिए ST20 (E3) पर प्रदर्शन किया गया है।
पूरे रेटिना explants लगभग 24 घंटा (चित्रा 3 ए और बी) के लिए संवर्धित किया जा सकता है। अब ऊष्मायन बार विकास में देरी, रूपात्मक विकृतियों, apoptosis और रेटिना (चित्रा 3 सी) के अंत में विघटन पैदा हो सकती है। पूरे explants के रूप में चिकन रेटिना संवर्धन जब रेटिना की वास्तुकला बरकरार है। इस apico-बास के साथ सेल चक्र के विभिन्न चरणों का वितरण शामिलअल अक्ष। सामान्य विकास के दौरान कोशिकाओं रेटिना 14,15 के शिखर की ओर पर बँटवारा द्वारा पीछा बेसल तरफ एस चरण से गुजरना। 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत एक पूरे रेटिना explant से एक अनुभाग, देर G2 / एम चरण (चित्रा 3 डी) में कोशिकाओं लेबलिंग, एक फास्फो-Histone 3 (PH3) एंटीबॉडी के साथ immunostained था। PH3 सकारात्मक कोशिकाओं को सामान्य रेटिना विकास के साथ संगत रेटिना, के शिखर की ओर पर पाए गए। नाभिक में एक सक्रिय cyclin बी 1-Cdk1 जटिल एम चरण संक्रमण 13 आरंभ हो जाएगा। Cdk1-काइनेज गतिविधि को अवरुद्ध बँटवारा में सेल चक्र प्रचार के लिए आवश्यक हैं कि डाउन स्ट्रीम की घटनाओं को रोकना होगा। स्टेज 29 (E6) पूरे रेटिना explants 4 घंटे के लिए Cdk1 / 2 एफडीए III के साथ incubated रहे थे और PH3 immunoreactivity विश्लेषण किया गया था। Cdk1 / 2 अवरोध करनेवाला तृतीय G2 / एम चरण संक्रमण के एक कुशल ब्लॉक का संकेत है, PH3 सकारात्मक कोशिकाओं (चित्रा 3E) की संख्या कम हो। treatme के बाद mitoses की संख्या में कमीCdk1 / 2 अवरोध करनेवाला के साथ NT उपचार प्रभावी था कि सत्यापित।
चित्रा वर्णक उपकला के 1. निकालना। एक भ्रूण दिन 6 (st29) चिकन आंख विच्छेदित और पूरे रेटिना explant के रूप में संवर्धन के लिए तैयार किया गया था। पुतली और लेंस और नीचे का सामना करना पड़ रंजित विदर के साथ पूर्वकाल आंख की (ए) देखें। वर्णक उपकला बरकरार है, लेकिन scleral मूलरूप और आसपास संयोजी ऊतक हटा दिया गया है। आंख के पीछे भाग (बी) देखें। ऑप्टिक तंत्रिका बाहर निकलें और रंजित विदर नीचे सामना कर रहे हैं। वर्णक उपकला में (सी) चीरा। (डी) वर्णक उपकला के अधिकांश हटा दिया गया है। (ई) कुछ वर्णक उपकला सिलिअरी शरीर और के रिम (साथ में छोड़ दिया जाता है एफ) रंजित विदर। ले: लेंस और सिलिअरी शरीर, सीएफ:ऑप्टिक तंत्रिका बाहर निकलें: पर रंजित विदर,। स्केल बार 0.5 मिमी है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरे रेटिना explants चित्रा 2. Electroporation। (ए) योजनाबद्ध प्लैटिनम इलेक्ट्रोड की प्रस्तुति और वे छोटा क्युवेट में डीएनए प्लाज्मिड समाधान में डूबे हुए है कि पूरे रेटिना explant के दोनों ओर तैनात कर रहे हैं कि कैसे। (बी) के बाद पूरे रेटिना explant 24 संवर्धन के मानव संसाधन, और (सी) रेटिना sectioned। पर: ऑप्टिक तंत्रिका बाहर निकलें। स्केल पट्टी (ए) 4 मिमी, (बी) के 0.5 मिमी, (सी) 50 माइक्रोन। एक बड़ा किया है देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा की rsion।
चित्रा 3. संवर्धित पूरे रेटिना explants, तय जमे हुए, cryosectioned, और immunohistochemistry द्वारा चिह्नित किया गया। 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत (ए) एक st29 पूरे रेटिना explant। (बी) 24 घंटा और (सी) 48 घंटे के बाद परमाणु धुंधला की प्रतिदीप्ति micrographs। (डी) एक PH3 एंटीबॉडी देर G2 / एम चरण में लेबल कोशिकाओं को इस्तेमाल किया गया था। (ई) के सापेक्ष घनत्व (PH3 + कोशिकाओं / 2 मिमी, Cdk1 / 2 अवरोध करनेवाला तृतीय उपचार 4 घंटे के लिए वाहन की तुलना में बाद st29 पर PH3 + कोशिकाओं के micrographs ± एसडी मतलब है) और प्रतिदीप्ति। अनुसूचित जनजाति: हैम्बर्गर और हैमिल्टन चरणों, छात्र के टी-परीक्षण, ** पी <0.01, एन ≥ 4 में इलाज आंख, आंख प्रति 4 वर्गों, एच: घंटे। स्केल पट्टी (ए) 0.5 मिमी, 10 माइक्रोन (इ) है।jove.com/files/ftp_upload/53202/53202fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस काम में विच्छेदन, electroporation या रासायनिक उपचार, और चिकन भ्रूण से पूरे रेटिना explants के संवर्धन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है। इस प्रोटोकॉल त्वरित, आसान है और दोनों एक उच्च सफलता दर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने के लिए अनुमति देता है परिणाम है।
पूरे रेटिना explants के electroporation ब्याज की जीन का निर्माण व्यक्त कि कोशिकाओं के बड़े क्षेत्रों पैदा करता है। यह सही ढंग से इलेक्ट्रोड की स्थिति के लिए और एक परिभाषित डीएनए प्लाज्मिड एकाग्रता के लिए रेटिना के एक विशिष्ट भाग को बेनकाब करने के लिए आसान है। यह दृष्टिकोण ओवो में electroporations की तुलना में एक आम तौर पर उच्च सफलता दर के साथ रेटिना में जीन समारोह की जांच के लिए एक विश्वसनीय विधि के लिए अनुमति देता है। पूरे रेटिना explant भी यह संभव देने के लिए एक रासायनिक अभिकर्मक के एक परिभाषित एकाग्रता युक्त मध्यम करने के लिए रेटिना को बेनकाब करने के लिए बनाता है तंत्रिका रेटिना में अभिकर्मक का एक समान वितरण। प्रोटोकॉल संयुक्त लिए अनुमति देता हैरेटिना पहले पदार्थों के साथ इलाज किया तो electroporated और है, जहां उपचार। इलाज और नियंत्रण आंख दोनों एक ही भ्रूण से प्राप्त किए जा सकते हैं और स्वतंत्र रूप से इलाज किया जा के बाद से व्यक्तिगत भ्रूण के बीच परिवर्तनशीलता के प्रभाव को कम किया जा सकता है।
रासायनिक पदार्थ उपचार के लिए st31 (E7) भ्रूण को electroporation और ST20 (E3) के लिए प्रोटोकॉल st27 को ST20 (E3) से पूरे रेटिना explants के लिए अनुकूलित किया गया है (E5) भ्रूण। युवा रेटिना चरणों में / ऑप्टिक कप प्रभावी ढंग से संभाल करने के लिए बहुत छोटा है और नाजुक है और electroporation ओवो में सबसे अधिक संभावना अधिक कुशल है। पूरे रेटिना explants पर electroporations st27 (ई 5) से अधिक उम्र के चरणों पर प्रदर्शन नहीं कर रहा था। यह पुराने भ्रूण से explants करने के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुकूल करने के लिए संभव होने की संभावना है। यही कारण है कि प्राप्त करने के लिए बड़ा cuvettes, ऊष्मायन के लिए बड़ा कुओं और रेटिना संस्कृति के माध्यम से की वृद्धि की मात्रा को शामिल किया जाएगा। हालांकि, E12-14 द्वारा वर्णक उपकला और के बाहरी खंडफोटोरिसेप्टर कोशिकाओं बारीकी से जुड़ा हो, और वर्णक उपकला को हटाने के रेटिना को नुकसान पहुंचा सकता है। रेटिना पूरे प्रयोगात्मक प्रक्रिया और गर्मी के दौरान बरकरार होना चाहिए।
इस विच्छेदन और संवर्धन के प्रोटोकॉल के साथ, रेटिना वास्तुकला के संरचनात्मक अखंडता सेल प्रकार विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति के आधार पर 24 घंटे के दौरान बरकरार है। उल्लेख किया है, हम explants में कोशिका चक्र प्रगति का अध्ययन किया है और रेटिना पूर्वज कोशिकाओं की interkinetic परमाणु प्रवास की प्रक्रिया सामान्य लग रहा है। प्रोटोकॉल किया जाता है, तो तेजी से explant में विकास प्रगति पर छोटे प्रभाव केवल देखते हैं। हालांकि, विकास थोड़ा गिरावट हो सकती है और 24 घंटे के लिए संवर्धित किया गया है कि एक explant सामान्य समकक्ष से 1-2 घंटा छोटी है कि एक विकासात्मक उम्र प्रदर्शन कर सकते हैं। यह उम्र से मिलान सामान्य रेटिना को explant की तुलना करने की सलाह दी है और यह एक प्रायोगिक EXPL रूप contralateral आंख का उपयोग करने की सलाह दी जाती हैचींटी नियंत्रण। यह रेटिना वर्णक उपकला को हटाने के बाहरी फोटोरिसेप्टर क्षेत्रों के विकास को प्रभावित कर सकता है कि बाहर की ओर इशारा किया जाना चाहिए। यह भी एक explant रेटिना axotomized रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के साथ एक घायल रेटिना का प्रतिनिधित्व करता है कि बताया जाना चाहिए।
इस प्रोटोकॉल सरल है और इसलिए प्रयोगात्मक त्रुटियों को कम कर देता है लेकिन स्थिति ओवो पूर्व कई प्रयोगात्मक नियंत्रण की मांग। विषय है कि एक विशिष्ट विकास की प्रक्रिया भी समानांतर में अध्ययन किया जा सकता है और ओवो स्थिति में सामान्य की तुलना में हो प्रोटोकॉल ओवो इस पूर्व का उपयोग कर अध्ययन किया जाना है। उचित प्रयोगात्मक नियंत्रण हमेशा ऐसे पदार्थों solubilize के लिए वाहनों का इस्तेमाल किया, के रूप में शामिल किया जाना चाहिए। संकेत मार्ग ब्लॉकर्स का उपयोग करते समय, एक ही प्रक्रिया के लिए कई अलग अलग अवरोधकों का उपयोग करें या अध्ययन किया जाता है कि विशिष्ट मार्ग की एक से अधिक स्तर पर एंजाइमों लक्ष्य है कि अलग अलग अवरोधकों का उपयोग करें। इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए, एक GFP व्यक्त डीएनए प्लाज्मिड उपयोगी एक हैSA सकारात्मक नियंत्रण। (-) गलत तरीके से तैनात कर रहे हैं इस तरह के प्लाज्मिड किसी भी रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति का उत्पादन नहीं करता है, यह कारण एनोड (+) और कैथोड कि करने के लिए सबसे अधिक संभावना है। डीएनए प्लाज्मिड तो दूर रेटिना से पलायन होगा। उपन्यास डीएनए plasmids जब परीक्षण यह इसलिए एक आंतरिक इलेक्ट्रोपोरेशन नियंत्रण के रूप में एक अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करता है कि एक डीएनए प्लाज्मिड शामिल करने के लिए सिफारिश की है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित इलेक्ट्रोपोरेशन मानकों को कोशिकाओं को व्यक्त पत्रकार जीन के एक उच्च संख्या के उत्पादन के लिए अनुकूलित किया गया है। वोल्टेज या दालों की संख्या कम झूठी नकारात्मक परिणामों का उत्पादन हो सकता है, जो कोशिकाओं की संख्या कम कर देता है। हालांकि, वोल्टेज या दालों की संख्या बढ़ती जा रही ऊतक के नुकसान और बढ़ सेल मौत का कारण हो सकता है। कस्टम मेड प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के तीन सेट किसी भी कम क्षमता दिखाने के बिना दो से अधिक वर्षों के दौरान सभी electroporations के लिए इस्तेमाल किया गया है। इलेक्ट्रोड ध्यान से साफ किया और इलेक्ट्रोड surfac किया जाना चाहिएई पॉलिश किया। वाणिज्यिक 4 मिमी चप्पू इलेक्ट्रोड उपलब्ध हैं।
इस प्रोटोकॉल डीएनए plasmids की electroporation और पूरे रेटिना explants का रासायनिक उपचार पर केंद्रित है। इसे आगे भी इस तरह के morpholino oligomers के उपयोग के साथ जीन की अभिव्यक्ति का एक तोड़े नीचे के रूप में अन्य प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं, शामिल करने के लिए इस प्रोटोकॉल का विस्तार करने के लिए संभव है। पूरे रेटिना explant प्रक्रिया एक आसान, त्वरित और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रास्ते में छोटी अवधि के प्रयोगों प्रदर्शन करने की संभावना के लिए खुल जाता है। यह लागत, समय, और प्रत्येक प्रयोग के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या कम कर देता है और सबसे महत्वपूर्ण बात यह ठोस डेटा प्राप्त करने की संभावना बढ़ जाती है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1xPBS (tablet) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10x DPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 734-0006 | |
| 100 μl pipette tips | VWR | 613-0798 | |
| 1.5 ml disposable plastic cuvette | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24-well plate | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm Petri dish | VWR | 391-1998 | |
| 70% ethanol | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inhibitor III | 217714 | Calbiochem | 300 nM in 0.01% DMSO |
| Cell culture incubator | Thermo Forma | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Electrodes | Platina, custom made | ||
| Electro square porator ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 Nutrient mix | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Forceps | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Freezing medium NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| GFP expressing DNA plasmid (pZGs) | |||
| Humidified incubator | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| Mounting medium ProLong Gold with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Paraffin film | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way embedding mold | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicillin streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| PhosphoHistone 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Dilution 1/4,000 |
| Platinum electrodes (custom made from "rondelles") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Dia: 4mm, 0.1 mm thickness |
| Platimun electrodes | Sonidel | CUY700P4L | Dia: 4 mm |
| Polyethylene pasteur pipette | VWR | 612-2853 | |
| Rotator shaker | VWR | 444-2900 | |
| Small spoon | VWR | 231-2151 | |
| Sucrose | VWR | 443815S | |
| White Leghorn eggs | Local supplier | ||
| Wine cooler | WineMaster 24, Caso, Berlin Germany |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Method. 24, 43-48 (2001).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain. J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. J Vis Exp. , (2012).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina. Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).
- Tomita, K., et al. Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis. Neuro. 16, 723-734 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).
- Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors. Exp eye re. 93, 556-564 (2011).
- Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway. Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).
- Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest. Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).
- Sauer, F.
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).
