Summary
이 프로토콜은, 해부 실험 조작과 닭의 배아에서 문화 전체 망막 외식하는 방법을 설명합니다. 높은 성공률, 효능 및 재현성은 전기 및 / 또는 시약의 물질, 즉, 효소 억제제 플라스미드의 효과를 테스트하기 위해 필요할 때 이식편 배양 물은 유용하다.
Abstract
망막은 개발 중추 신경계에 대한 좋은 모델입니다. OVO / 생체 내에서 실험 조작에 대한 눈의 큰 규모와 가장 중요한 것은 접근성은 닭 배아 망막 다양하고 매우 효율적인 실험 모델을 만든다. 닭 인공 망막은 주사 또는 일렉트로 포 레이션에 의한 오보 타겟팅하기 쉽지만, 망막 내의 시약의 정확한 농도 및 효과가 충분히 제어하는 것이 어려울 수있다. 이것은 눈 또는 물질의 요철 확산에서 정확한 주사 부위, 누설의 변화에 기인 할 수있다. 또한, 이러한 전기 천공 등 침습적 조작 후 기형 및 사망률의 주파수는 다소 높다.
이 프로토콜은 닭의 배아에서 전체 망막 외식을 배양하기위한 기술 비켜 예를 설명하고 시약에 망막의 제어 노출하는 방법을 제공한다. 프로토COL은 실험적으로, 해부 조작하고, 닭의 배아에서 문화 전체 망막 외식하는 방법에 대해 설명합니다. 이식편은 약 24 시간 동안 배양 될 수 있으며, 이러한 전기 천공과 같은 다른 조작을 실시한다. 주요 장점은 실험 배아의 생존 및 도입 시약의 농도가 다양하고 효과적인 농도를 결정하고 최적화하기 위해 제어 될 수 의존하지 않는 것이있다. 또한, 기술은 높은 실험 성공률과 함께 신속한 저렴하고, 그것을 재현 보장 결과. 그것은 비켜에서 수행 실험에 훌륭한 보완의 역할을 강조한다.
Introduction
망막은 중추 신경계의 일부이며 그 단순함과 잘 특성화 셀룰러 아키텍처, 중추 신경계 발달을 연구하기위한 인기있는 모델이다. 닭 배아의 눈은 배아의 나머지 부분에 비해 상대적으로 크다. 따라서 이러한 주사 또는 전기로 실험 조작에 대한 OVO에 쉽게 접근 할 수 있으며, 망막 세포와 생체 내에서 발생 생물학에 대한 지식을 얻을 수있는 훌륭한 도구 역할을한다. 실험 electroporations, 반복 주사, 또는 결합 된 실험 조작과 같은 침략 때 이러한 주요 장점에도 불구하고, 배아의 생존율이 낮을 수있다.
OVO에서 닭 배아에 DNA 플라스미드의 전기가 중요하고 잘 확립 된 기술 1입니다. 그것은 중앙 NERV에서 세포의 운명뿐만 아니라 신경 책자의 추적, 뉴런의 표시를 허용시스템의 OU하며 생체 내에서 단백질의 기능 분석 이소성 유전자 발현을 허용한다. 이 기술은 3 후뇌, 4 망막 신경 튜브 (2)의 연구에 사용되었다. OVO의 배아 망막의 전기는 생체 내 상황에 관련된 몇 가지 실험적인 어려움이있다. 태아의 뇌 폴딩으로 인한 눈의 위치, 중심에 비교적 가깝다. 이 근접 전기 다음 심장 마비의 위험 및 배아의 나이와 위험 증가를 증가시킨다. 또한, 눈에 액세스하기 위해서는 이에 출혈, 기형 및 후속 감소 가능성에 대한 위험을 증가 배아 멤브레인을 열 필요가있다. 테스트 및 공지 표현형 결과없이 종종 새로운 DNA 플라스미드를 최적화 할 때, 이러한 한계는 심지어 숙련 된 실험자 방법의 효능 및 전력을 감소시킬 수있다. 이 프로토콜, W의 문화에 제시된 바와 같이제거 색소 상피 세포와 전체 신경 망막으로 정의 구멍 망막 이식편은 비켜 접근 방식을 보완하는 효율적인 방법이다.
화학 시약의 안구 내 주사는 비켜에서 수행하기가 비교적 쉽다. 그러나, 신경 망막 내 시약의 주입 효과적이고 정확한 농도는 완전히 제어하기 어려울 수있다. 주입 된 부피는 누설에 따라 다를 수 있으며, 주사의 정확한 위치는 눈 내부의 시약의 유통 및 유리체를 통해 확산 모두에 영향을 미칠 수 있습니다. 가변성 즉, 효소 억제제에 대한 투여 량 반응 곡선을 결정 결과의 해석에 중요한 의미를 가질 것이다; 효과는 적고, 효과의 시간 창이 좁 경우 특히. 오보 실험에서 또한 수행 할 때, 단일 눈 인한 혈류를 통한 전신 효과 전위 각 배아에서 사용될 수있다반대편 눈 위에. 개발 및 처리 및 제어 배아 추가 실험 변동 될 수 있습니다 사이의 개별 변동을 연구 할 때 나이 일치가 중요하다.
이러한 이유로, 닭 배아 망막 이식편에 기초한 방법 오보 EX가되는 신경 망막을 균일하게 노출 될 수 있으며, 시험 관내에서의 실험 조건을 제어, 개발되었다. 본 프로토콜은 이전 프로토콜 5-9를 기반으로 개발되었다. 스테이지로부터 망막 이식편 (세인트) ST31 20 (3 배아 일 [E])을 (E7)는 닭 배아는 배양 해부 및 일렉트로 정의 DNA 플라스미드 농도 또는 화학 시약의 규정 농도를 함유하는 배지에 노출시켰다. 여기에 제시된 프로토콜은 성공적 KU55933, SB 218,078 및 109,555 NSC dito 같은 DNA 손상 경로의 레귤레이터를 포함하여 여러 가지 화학 시약을 사용하여, 최근의 간행물에서 구현 된이러한는 Cdk1 / 2 10,11 III 억제제로서 sylate 및 세포주기.
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Protocol
이 프로토콜은 "비전과 안과 연구 협회의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 가이드"의 권장 사항에 따라 수행된다.
1. 계란 취급과 눈 모음
- 일주보다 더 이상에 대해 12 ~ 14 ℃에서 흰색 레그혼 계란을 저장합니다. 가능한 경우, 수정란을 저장하는 냉장 와인 쿨러를 사용한다.
참고 : 낮은 온도가 사망률을 증가하면서 높은 저장 온도, 태아의 이상 개발로 이어집니다. 확장 된 저장 시간은 사망률과 이상 발생시 모두 증가. - 부드러운은 24 시간 당 5 배의 주파수에서 락으로 37.5 ° C 계란 60 % 가습 계란 인큐베이터를 품어.
- 원하는 배아 나이에 계란 인큐베이터에서 배양 알을 제거합니다.
주 : 닭 배아의 연령은 인큐베이션 시간으로 결정되고, 배아 일 (E) 또는 단계로 표시된다 (세인트을), 햄버거 해밀턴 (12)에 의해 설명 된 발달 단계의 일련의 제조 방법. - 층류 후드에서 선택한 알을 놓습니다. 배아의 오염을 방지하기 위해 70 %의 에탄올로 달걀 껍질을 닦습니다.
참고 : 멸균 솔루션을 무균 상태에서 모든 절차를 실시http://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions 및 악기. - 계란을 개방 균열 단단히 하드 표면에 계란의 측면을 누릅니다. 100mm 페트리 접시의 콘텐츠를 배치합니다. 마르지 않도록 조직 예열 (37 ° C) 1X PBS를 함유하는 35mm 페트리 접시에 배아를 전송할 작은 스푼을 사용한다.
- 층류 후드에서 양안 스테레오 비젼 해부 현미경에 배아 조직을 포함하는 35mm 페트리 접시를 놓습니다. 미세 집게로 목을 곤란하게하여 배아를 참살하고 시신을 버리십시오.
- 번째 절개를 만들기 위해 미세 집게를 사용하여눈에 복부 거친 입,. 절개 부위부터 전체 눈 주변 조직을 오픈 찢어. 시신경을 조이고 눈 소켓에서 그대로 눈을 제거합니다. 제어 또는 처리 중 눈으로 사용하기 위해 동일한 배아로부터 좌측 및 우측 눈 모두 모아서.
- 예열 (37 ° C) 1X PBS를 함유하는 새로운 35mm 페트리 접시에 눈을 전송할 작은 스푼을 사용한다.
전체 망막의 Explants 2. 준비
- 공막 anlage을 포함하여 눈 주위의 모든 조직을 제거하는 미세 집게를 사용합니다.
주 : 조직은 쉽게 색소 상피 손상 (도 1A-B)와 유리체 및 망막에 렌즈를두고 분리된다. - 신경 망막 (그림 1C)을 손상시키지 않고 눈의 지느러미 부분에 색소 상피 세포에 작은 절개를 끼지 미세 집게를 사용합니다.
- 부드럽게 색소 상피의 starti을 열고 눈물 미세 집게를 사용하여절개 부위에 겨 렌즈와 유리체 (도 1D)에 연결된 전체 망막을 떠나. 색소 상피 세포의 제거를 용이하게 따뜻한 (37 ℃)에서 1X PBS 주시.
색소 상피 세포는 눈의 전방 영역, 동공 주위 모양체 따라, 특히 분리하기가 어려울 수 있고, 맥락막 열창 따라 참고. 따라서, 색소 상피 세포의 일부가 망막 신경 (도 1E-F)에 남아있을 수있다.
전체 망막의 Explants 3. 치료
- 전체 망막 외식의 전기
참고 : 전체 망막 외식의 일렉트로는 2 단계 후 직접 수행 할 수 있습니다.- 1 DMEM : F12 영양소 혼합물, 10 % FBS, 10 U / ml의 페니실린 스트렙토 마이신, 5 μg의 / ㎖ 인슐린, 및 2 mM L- 글루타민을 함유 한 배양 배지를 준비한다.
- 1.5 ml의 일회용 플라스틱 큐벳을 잘라 (12.5 mm X 12.5 mm X 45mM) (또는 미세 블레이드 톱을 사용하여 바닥에서) 약 8mm를 300 ~ 400 μL 솔루션을 보유 할 수있는 작은 용기.
- 0.1 μg의 / μL의 최종 농도 1xDPBS 선택의 DNA 플라스미드를 희석.
- ST20 15 V에 electroporator 및 설정 매개 변수를 켜십시오 - ST25 (E3-E4) 망막 및 ST26 20 V - ST27 (E5) 망막. 1 초 간격으로 50 밀리 초 펄스 길이의 5 펄스 펄스 반복을 설정합니다. 양손 곳에 전극을 유지하는 데 필요한 것 같이 바닥에 발 페달에 의해 제어 될 수있는 펄스 발생기를 사용한다.
- 두 개의 패들 형 (평면, 원형 DIAM을. 4mm) 연결 백금 전극 (그림 2A)를 펄스 발생기의 출력 소켓에.
참고 :이 프로토콜에 사용되는 백금 전극 대학 워크샵에 의해 만들어졌다. 전극은 0.1 mm의 백금 판 "rondelles"(: 950 편 / 5 구리 백금 등급)에서 만들어졌다. 연결 0.8 mm 위스콘신재는 플라스틱 배관을 이용하여 절연 하였다. - 조심스럽게 망막 절편에 맞는 팁 개방 크기를 취득 잘라 끝 폴리에틸렌 파스퇴르 피펫을 사용하여 큐벳 (또는 이에 상응하는 작은 용기) 단계 2.3에서 전체 망막 절편을 전송합니다. 망막은 플라스틱에 부착 떨어져 눈물 경향이 피펫 팁을 사용하지 마십시오.
- 부드럽게 찢어지지 않도록 망막을 만지지 않도록 망막 절편 돌보는 주변 전체 1X PBS를 제거하기 위해 100 μL 피펫을 사용합니다.
- 전체 망막 절편을 충당하기 위해 큐벳에 100 μL 플라스미드 솔루션을 추가합니다. 그것은 정상에 수레 경우 부드럽게 집게로 망막 절편을 누릅니다. 큐벳의 바닥 큐벳 및 시신경의 어느 한 쪽을 향하도록 렌즈를 위치 시키거나 집게 전극을 사용한다.
- 조직을 건드리지 않고, 렌즈와 망막 (도 2A) 뒤에 부극 앞에 정극을 배치.
- 발 페달을 눌러 전류를 적용합니다. 성공적인 방전을 나타내는 전극에 거품이 있는지 확인합니다.
- 망막을 손상시키지 않고, 큐벳 모든 플라스미드를 제거하기 위해 믹스 100 ㎕를 피펫을 사용한다. 플라스미드 믹스 3-5 번 재사용 할 수 있습니다.
- 사전 예열 (37 ° C) 1X PBS로 큐벳을 입력합니다. 부드럽게 큐벳의 벽에서 망막 절편을 분리 집게를 사용합니다. 전기 천공 후 망막은 때때로 큐벳의 벽에 부착하게하는 거품으로 덮여있다.
- 웰 당 1ml를 예열 된 (37 ℃) 배양 배지를 함유하는 24- 웰 플레이트에 전체 망막 이식편을 전송 폴리에틸렌 파스퇴르 피펫을 사용한다. 물론 당 하나의 망막 절편을 품어.
- 24 시간 동안 5 % CO 2 세포 배양기 안에, 50 RPM의 일정한 속도로, 회전 진탕 기에서 37 ° C에서 배양 한 망막 이식편. 회전 매체와 preve에 노출을 최대화하는 것이다24- 웰 플레이트의 바닥에 망막의 NT 밀착성.
- 4 단계로 진행합니다.
- 화학 시약 전체 망막 외식의 치료
주 : 전체 망막 이식편의 화학적 처리는 2 단계 후 직접 수행 될 수있다.- 1 DMEM : F12 영양소 혼합물, 10 % FBS, 10 U / ml의 페니실린 스트렙토 마이신, 5 μg의 / ㎖ 인슐린, 및 2 mM L- 글루타민을 함유 한 배양 배지를 준비한다.
- 물론 당 (37 ° C를) 배지 예열 1 ml에 포함 된 24 웰 플레이트로 단계 2.3에서 망막 절편을 전송하는 작은 숟가락을 사용합니다. 물론 당 하나의 망막 절편을 품어.
- 화학 반응물 또는 비히클을 첨가하기 전에 5 % CO 2 세포 배양기 안에 50 RPM의 일정한 속도로, 회전 진탕 기에서 37 ℃에서 60 분 동안 전 배양 한 망막 이식편.
- 예를 들면, 화학 용액을 제조는 Cdk1 / 2 억제제 III, 최종 단계에서 M (13)의 진행 억제제,DMSO 30 μM의 농도.
- 세포 배양기에서, 전체 망막 절편을 포함, 24 웰 플레이트를 제거합니다. 0.01 % DMSO에서 300nm의는 Cdk1 / 2 억제제 III의 최종 농도 결과 망막 매체에 직접 화학 반응물 또는 비히클 (DMSO)의 10 μL를 추가한다. 수동 용액에서 화학 시약 또는 비히클의 균일 한 분포를 허용하도록, 24 웰 플레이트를 회전한다.
- 소정 시간 (최대 24 시간) 5 % CO 2 인큐베이터 안에 50 RPM의 일정한 속도로, 회전 진탕 기에서 37 ° C에서 배양 한 망막 이식편.
- 4 단계로 진행합니다.
4. 고정 및 전체 망막 Eexplants의 동결
- 세포 배양기에서 처리 된 전체 망막 절편을 포함하는 24 웰 플레이트를 제거합니다.
- 1 x PBS를 1 mL의 IN / 웰 빙냉 4 % 파라 포름 알데히드를 함유하는 24 웰 플레이트에 망막 이식편을 전송할 작은 스푼을 사용한다. Incuba15 분 동안 얼음에 테.
- 망막을 씻어 1 ㎖ / 잘 차가운 얼음 x PBS를 포함 된 24 웰 플레이트에 전체 망막 절편을 전송하는 작은 숟가락을 사용합니다. 10 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
- 1 ㎖ / x PBS를 잘 차가운 얼음 30 % 자당을 포함하는 24 웰 플레이트에 전체 망막 절편을 전송하는 작은 숟가락을 사용합니다. 1-3 시간이 망막의 배아 일에 따라 얼음 위에서 배양한다. ST20은 - ST25 (E3) 망막은, 1 시간 동안 품어, 이전 망막은 자당에 이상 배양 시간이 필요합니다.
- 약 500 μL 저온 유지 동결 설치 매체를 포함하는 파라핀 필름에 전체 망막 절편을 전송하는 작은 숟가락을 사용합니다. 부드럽게 작은 스푼을 사용하여 동결 배지에서 망막 이식편을 이동시킴으로써만큼 수크로오스 최대한 제거한다.
- 동결 배지를 함유하는 주형에 매립 망막 이식편 옮긴다. 미래의 단면을 용이하게하기 위해 눈을 놓습니다. DR에 전체 망막 이식편을 함유하는 틀 매립 넣어매체까지 Y 얼음이 얼어있다. -80 ° C에서 보관하십시오.
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Representative Results
이 프로토콜은 닭의 배아에서 전체 망막 외식의 준비 (그림 1A-F)과 배양에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 성공적으로 ST31에 ST20 (E3)의 배아에서 전체 망막 외식 (E7) 사용되어왔다.
전체 망막 이식편으로 플라스미드 DNA의 전기 망막 전구 세포의 표지 및 추적 또는 과발현 다른 유전자 생성물의 허용한다. 전기 실험의 경우, 색소 상피 신중 ST25 (E4 ½) 배아의 세포핵이 제거 된 눈에서 제거되었습니다. 전체 망막 이식편이어서 플라스미드 DNA 용액을 함유하는 큐벳에 넣고, 전극 (도 2A) 침지하고, 전류를인가 하였다. 배양 24 시간 후, GFP 양성 세포가 망막 손상 (도 2b)의 큰 부분에서 볼 수 있었다. 단면 처리 한 후, 단일 세포를 GFP + 쉽게 망막 apico - 기저 축 (FI 따라 검색된gure 2C). 전기 큰 망막 영역이 플라스미드를 복용하고 리포터 유전자를 발현 결과. 전기 천공 영역 전체 망막의 1/5보다 큰와 망막의 수에 의해 측정 성공률은 263 눈의 14 % (37에 비해, 전체 망막 이식편의 전기 천공을위한 (83 망막 중 62) 75 %였다 ) 비켜 전기에 대한. 이식편 전체 망막에 전기 천공 실험 성공적 ST27 (E5) 배아 ST20 (E3)에서 수행되었다.
전체 망막 이식편은 약 24 시간 (도 3A와 B) 동안 배양 될 수있다. 긴 배양 시간은 발달 지연, 형태 학적 기형, 세포 사멸 및 망막 (그림 3C)의 결국 붕괴로 이어질 수있다. 전체 이식편으로서 닭 망막를 배양하면, 망막의 구조는 그대로 유지된다. 이것은 apico-BAS 따라 세포주기의 상이한 위상의 분포를 포함알 축. 정상적인 발달 동안 세포가 망막 14,15의 정점 측에 유사 분열 이어 기저 측에 S 상을 겪는다. 24 시간 동안 배양 전체 망막 이식편에서 섹션은, 늦게 G2 / M 상 (그림 3D)에 세포를 라벨, 포스 포 히스톤 3 핀 (PH3) 항체와 면역 염색했다. PH3 양성 세포는 정상 망막의 발달과 일관된 망막의 선단 측에 발견되었다. 핵의 활성 사이클린 B1-는 Cdk1 단지는 M-상전이 (13)를 시작합니다. 는 Cdk1 키나아제 활성을 차단하면 유사 분열로 세포주기의 전파에 필요한 다운 스트림 이벤트를 억제합니다. 단계 29 (E6) 전체 망막 이식편을 4 시간 동안는 Cdk1 / 2 III 억제제와 함께 배양시키고, PH3 면역 분석 하였다. 는 Cdk1 / 2 억제제 III는 G2 / M 상전이의 효율을 나타내는 블록, PH3 양성 세포 (도 3e)의 수를 감소시켰다. 자원 처리 후 유사 분열의 수의 감소는 Cdk1 / 2 억제제와 NT는 치료가 효과적이라는 것을 확인.
그림 색소 상피 1. 제거. 배아 일 6 (ST29) 닭 눈 해부 및 전체 망막 절편 등의 배양을 위해 준비했다. 학생 및 렌즈와 아래로 향하게 맥락막의 균열과 전방 눈의 (A)보기. 색소 상피 그대로이지만 공막 anlage 주변 결합 조직을 제거하고있다. 눈의 후방 부 (B)보기. 시신경 종료 및 맥락막 균열이 아래로 향하게된다. 색소 상피 (C) 절개를. (D) 색소 상피 세포의 대부분은 제거되었습니다. (E) 일부 색소 상피가 모양체와의 림 (함께에 남아 F) 맥락막 균열. 르 : 렌즈와 모양체, CF :시신경 출구 : ON 맥락막 균열. 스케일 바는 0.5 mm이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
전체 망막 이식편의도 2 일렉트로. (A) 도식 백금 전극을 제시하고는 절두 큐벳에서 DNA 플라스미드 용액에 잠기 전체 망막 이식편의 양측에 배치되는 방법. (B) 후 전체 망막 이식편 24 시간 배양하고, (C)는 망막을 절단. ON : 시신경 종료합니다. 스케일 바 (A) 4mm, (B) 0.5 mm, (C) 50 μm의. 큰 VE를 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 rsion.
그림 3. 교양 전체 망막 외식은 고정 냉동, 저온 절단 및 면역 조직 화학 염색에 의해 표시했다. 24 시간 동안 배양 (A) ST29 전체 망막 절편을. (B) 24 시간 그리고 (C) (48)의 시간 후에 핵 염색의 형광 현미경 사진. (D) PH3 항체 늦은 G2 / M 단계에서 라벨 세포에 사용 하였다. (E)의 상대 밀도 (PH3 + 세포 / mm 2, 는 Cdk1 / 2 억제제 III 치료 4 시간 동안 차량에 비해 후 ST29에서 PH3 + 세포의 현미경 사진을 평균 ± SD)과 형광. ST : 햄버거와 해밀턴 단계, 학생의 t-test를, ** P <0.01, N ≥ 4 취급 눈, 눈 당 4 개의 섹션, H : 시간. 스케일 바 (A) 0.5 MM은 10 μm의 (BE)입니다.jove.com/files/ftp_upload/53202/53202fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 작품에서 해부, 전기 또는 화학 처리, 닭 배아에서 전체 망막 외식의 배양을위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 빠르고 용이하고 모두 높은 성공률을 허용하고 재현성 결과.
전체 망막 이식편의 전기 천공은 관심 유전자 구조를 발현하는 세포의 큰 영역을 생성한다. 올바르게 전극을 배치하고, 정의 된 플라스미드 DNA 농도 망막의 특정 부분을 노출시키기 쉽다. 이 접근법은 오보에 electroporations에 비해 일반적으로 더 높은 성공률과 망막에서 유전자 기능을 연구하기위한 신뢰할 수있는 방법을 허용한다. 전체 망막 이식편도 가능주는 화학 시약의 규정 농도를 함유하는 배지에 망막을 노출 할 수있다 신경 망막에서 시약의 균일 한 분포. 프로토콜 조합을 허용망막은 제 물질로 처리 한 다음 일렉트로되고먼트. 처리 및 제어 눈 모두 동일한 배아로부터 수집 될 수 있고, 독립적으로 처리 이후 개별 배아 간 변동성의 영향이 최소화 될 수있다.
화학 물질 처리를위한 ST31 (E7) 배아에 전기 및 ST20 (E3)에 대한 프로토콜 ST27에 ST20 (E3)에서 전체 망막 외식에 최적화 된 (E5) 배아. 젊은는 망막 단계에서 / 광학 컵 효과적으로 처리하기에 너무 작고 허약 및 전기 OVO에서 가장 가능성이 더 효율적입니다. 전체 망막 외식에 Electroporations은 ST27 (E5)보다 이전 단계에서 수행되지 않았습니다. 그것은 이전의 배아에서 외식이 프로토콜을 적용 할 수 가능성이 높습니다. 즉 취득 큰 큐벳, 배양을위한 더 큰 우물과 망막 문화 매체의 증가 볼륨을 포함 할 것이다. 그러나, E12-14에 의한 색소 상피의 외부 세그먼트시각 세포는 밀접하게 관련되고, 색소 상피 세포를 제거하여 망막을 손상시킬 수있다. 망막은 전체 실험 절차 및 배양 동안 그대로 있어야한다.
이 해부 및 배양 프로토콜, 망막 구조의 구조적 무결성은 세포 유형 특이 마커의 발현에 기초하여, 24 시간 동안 그대로 남아있다. 언급 한 바와 같이, 우리는 체외 이식편의 세포주기 진행을 연구 한 망막 전구 세포의 핵 interkinetic 이주의 방법은 정상 보인다. 프로토콜이 수행되면 신속 이식편의 발달 진행 작은 효과 만이있다. 그러나, 개발은 약간 감속 될 수 있으며, 24 시간 동안 배양 된 절편은 보통 상대보다 1 ~ 2 시간 어리다 발달 연령을 나타낼 수있다. 그것은 연령대 정상 망막에 절편을 비교하는 것이 좋습니다 그것은 실험 폭발물로 반대편 눈을 사용하는 것이 좋습니다개미 제어 할 수 있습니다. 이는 망막 색소 상피 세포의 제거가 외측 감광체 세그먼트들의 발달에 영향을 미칠 수 있음을 지적한다. 또한 이식편의 망막이 axotomized 망막 신경절 세포와 손상된 망막을 나타낸다는 것을 지적한다.
이 프로토콜은 간단하기 때문에 실험 오류를 줄일 수 있지만, 상황 비켜 전 몇 가지 실험 컨트롤을 요구한다. 대상이되는 특정 개발 프로세스는 병렬로 연구 할 수 있으며, 비켜 상황에서 정상으로 비교 될 프로토콜 비켜이 예를 사용하여 공부한다. 적절한 실험 컨트롤은 항상 이러한 물질을 용해하는 데 사용되는 차량으로, 포함되어야합니다. 신호 전달 경로 차단제를 사용할 경우, 동일한 처리에 여러 가지 저해제를 사용하거나 검토되고 특정 경로의 하나 이상의 레벨에서 효소를 표적 다른 억제제를 사용한다. 일렉트로 들어, GFP 발현 DNA 플라스미드는 유용하다SA 양성 대조군. (-)이 잘못 배치되는 이러한 모든 플라스미드 리포터 유전자 발현을 얻을 수없는 경우에는, 그 때문에 양극 (+)과 음극 것이 가장 쉽다. DNA 플라스미드는 떨어져 망막에서 마이그레이션합니다. 신규 한 플라스미드 DNA를 테스트 할 때 따라서 내부 전기 제어와 같은 다른 형광 단백질을 발현하는 DNA 플라스미드를 포함하는 것을 권장한다. 이 프로토콜에 설명 된 전기 매개 세포를 발현하는 리포터 유전자의 높은 수를 생성하기 위해 최적화되었다. 전압 또는 펄스의 수를 줄이면 위음성 결과를 얻을 수 형질 감염된 세포의 수를 감소시킨다. 그러나, 전압 또는 펄스의 수를 증가시키는 것은 조직의 손상과 증가 된 세포 사멸을 초래할 수있다. 맞춤 제작 한 백금 전극의 세 세트는 용량 감소를 나타내지 않고 2 년 이상 동안 모든 electroporations 사용되고있다. 조심스럽게 세척 전극과 전극 SURFAC해야전자는 연마. 상업 4mm 패들 전극을 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 플라스미드 DNA의 전기 및 전체 망막 이식편의 화학적 처리에 초점을 맞추고있다. 또한 상기와 같은 폴리 노 올리고머의 사용을 가진 유전자 발현의 녹다운 다른 실험 절차를 포함하는이 프로토콜을 확장 할 수있다. 전체 망막 이식편 절차는 쉽고 신속하고 높은 재현성 방식으로 단기간의 실험을 수행 할 수있는 가능성을 연다. 이는 비용, 시간 및 각 실험에 필요한 동물의 수를 감소시키고, 가장 중요한 것은 고체 데이터를 얻을 가능성이 증가한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1xPBS (tablet) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10x DPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 734-0006 | |
| 100 μl pipette tips | VWR | 613-0798 | |
| 1.5 ml disposable plastic cuvette | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24-well plate | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm Petri dish | VWR | 391-1998 | |
| 70% ethanol | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inhibitor III | 217714 | Calbiochem | 300 nM in 0.01% DMSO |
| Cell culture incubator | Thermo Forma | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Electrodes | Platina, custom made | ||
| Electro square porator ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 Nutrient mix | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Forceps | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Freezing medium NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| GFP expressing DNA plasmid (pZGs) | |||
| Humidified incubator | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| Mounting medium ProLong Gold with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Paraffin film | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way embedding mold | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicillin streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| PhosphoHistone 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Dilution 1/4,000 |
| Platinum electrodes (custom made from "rondelles") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Dia: 4mm, 0.1 mm thickness |
| Platimun electrodes | Sonidel | CUY700P4L | Dia: 4 mm |
| Polyethylene pasteur pipette | VWR | 612-2853 | |
| Rotator shaker | VWR | 444-2900 | |
| Small spoon | VWR | 231-2151 | |
| Sucrose | VWR | 443815S | |
| White Leghorn eggs | Local supplier | ||
| Wine cooler | WineMaster 24, Caso, Berlin Germany |
References
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- Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway. Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).
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