Summary
このプロトコルは、解剖実験的に操作し、ニワトリ胚の培養全体の網膜外植する方法について説明します。高い成功率、有効性と再現性をエレクトロポレーションおよび/ または試薬物質、 すなわち、酵素阻害剤のためのプラスミドの効果をテストするために必要な場合、外植片培養は便利です。
Abstract
網膜は、発展途上の中枢神経系のための優れたモデルです。 OVO / in vivoでの実験操作のための目のサイズが大きいと、最も重要なアクセシビリティ鶏胚網膜汎用性と非常に効率的な実験モデルを作成します。鶏の網膜は眼内注射またはエレクトロポレーションによって卵内標的にするのは簡単ですが、網膜内の試薬 の効果的かつ正確な濃度は、完全に制御することが困難な場合があります。これは、眼または物質の不均一な拡散の正確な注射部位、漏れの変動に起因し得ます。さらに、このようなエレクトロポレーションなどの侵襲的な操作後の奇形や死亡の頻度はかなり高いです。
このプロトコルは、ニワトリ胚から全網膜の外植片を培養する技術OVO EXを記述し、試薬に網膜の制御された露光のための方法を提供します。プロトcolが実験的に、解剖操作、ニワトリ胚の培養全体の網膜の外植する方法について説明します。外植片は、約24時間培養することができ、例えば、エレクトロポレーションのような別の操作に付すこと。主な利点は、実験は、胚の生存に導入試薬の濃度を変化させると効果的な濃度を決定し、最適化するために制御することができる依存しないことです。さらに、この技術は、その高い実験成功率とともに、迅速、安価であり、それは再現性を保証します 結果。それは卵内行われた実験に優れた補完するものとして機能していることを強調すべきです。
Introduction
網膜は中枢神経系の一部であり、その相対的な簡単さと十分に特徴付け細胞構造、中枢神経系の発達を研究するための人気のあるモデルです。ニワトリ胚の眼は、胚の残りの部分に比べて相対的に大きいです。従って、このような注射またはエレクトロポレーションなどの実験操作のための卵内に容易にアクセスでき、網膜細胞や生体内で発生生物学に関する知識を得るための優れたツールとして機能します。実験は、エレクトロポレーション、反復注射、または組み合わせた実験操作と同様に侵襲的であるとき、これらの主要な利点にもかかわらず、胚の生存率は低くすることができます。
卵内ニワトリ胚へのDNAプラスミドのエレクトロポレーションは重要であり、十分に確立された技術1です。これは、神経細胞の標識化を可能にする細胞の運命の追跡だけでなく、中央NERVにおける神経管OUのシステムは、それがインビボでタンパク質機能を解析するための異所性の遺伝子発現を可能にします。技術は、3後脳、および4網膜、神経管2の研究のために使用されてきました。 卵内胚網膜のエレクトロポレーションは、in vivoでの状況に関連したいくつかの実験の困難を持っています。胚の頭蓋折りたたみに起因する目の位置は、心臓に比較的近いです。この接近は、エレクトロポレーション後の心停止のリスク、および胚の年齢とともにリスク増加が増加します。また、目にアクセスするために、それによって出血、奇形およびその後の生存率減少のリスクを増加させる、胚の膜を開くことが必要です。既知の表現型の結果なしで、多くの場合、新たなDNAプラスミドをテストし、最適化する場合、これらの制限はあっても、経験豊富な実験者のための方法の有効性とパワーを減少させることができます。このプロトコルは、Wの文化の中で提示したよう削除色素上皮と神経網膜全体として形成された孔網膜外植は、OVOのアプローチで補完する効率的な方法です。
化学試薬の眼内注射は 、OVO で実行するのが比較的容易です。しかし、神経網膜内注射、試薬の有効かつ正確な濃度は、完全に制御することが困難な場合があります。注入量は、漏れに変えることができ、注射の正確な部位は、眼内の試薬の分布と硝子体を通して拡散の両方に影響を与える可能性があります。酵素阻害剤のための、すなわち、用量応答曲線を決定する際の変動は、結果の解釈のために主要な影響を有することになります。特に効果が小さく、効果の時間窓が狭い場合。血流を介し潜在的な全身作用のために、OVOの実験で行うときにまた、唯一の目には、各胚から使用することができます反対側の眼へ。開発および処置および対照胚は、追加実験の変動につながる可能性の間の個体差を検討する際に年齢のマッチングが重要です。
これらの理由のために、ニワトリ胚の網膜外植片に基づく方法卵EXは、神経網膜を均一に露出し、 インビトロで実験条件を制御することが可能で、開発されました。現在のプロトコルは、以前のプロトコル5-9に基づいて開発されました。ステージからの網膜外植体（ST）、ST31〜20（3胚日[E]）は、（E7）は、ニワトリ胚を培養し、解剖し、エレクトロポレーション定義DNAプラスミドの濃度または化学試薬の規定された濃度を含有する培地に曝露しました。ここで紹介するプロトコルは成功し、このようなKU55933、SB 218078、およびNSC 109555 DITOなどのDNA損傷経路の調節因子を含む、いくつかの異なる化学試薬を使用して、最近の出版物に実装されましたこのようするCdk1 / 2阻害剤III 10,11としてsylate、および細胞周期、。
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Protocol
このプロトコルは、「ビジョンと眼科での研究のための協会の実験動物の管理と使用に関する指針」の推奨事項に従って行われます。
1.卵取り扱いとアイコレクション
- 1週間以上、もはや用に12〜14℃の白色レグホン卵を保管してください。可能な場合は、受精卵を保存する冷蔵ワインクーラーを使用しています。
注意：より低い温度では死亡率を増加させながら、高い店の温度は、胚の異常な開発につながります。拡張ストレージ時間が死亡し、異常な開発の両方を向上させます。 - 穏やかに24時間あたり5回の頻度でロッキングと37.5°Cで卵と60％の加湿卵インキュベーターをインキュベートします。
- 希望胚年齢で卵のインキュベーターから培養した卵を削除します。
注：ニワトリ胚の年齢は、インキュベーションの時間として決定され、胚日（E）として、または段階として示される（ST）、ハンバーガーとハミルトン12で説明した発達段階の一連に従って。 - 層流フード内で選択された卵を置きます。胚の汚染を避けるために70％エタノールで卵殻を拭きます。
注：滅菌溶液を無菌条件下ですべての手順を実施http://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions そして、楽器。 - 卵を開いてクラックするのは難しい表面に対してしっかりと卵の側をタップします。 100ミリメートルペトリ皿内のコンテンツを配置します。乾燥から組織を防止するために、予め温めた（37℃）1×PBSを含む35 mmのペトリ皿に胚を転送する小スプーンを使用します。
- 層流フード内で両眼立体視の解剖顕微鏡上に胚組織を含む35ミリメートルペトリ皿を置きます。細かい鉗子で首をつまんで胚を刎ねると体を捨てます。
- 切開目を作るために細かい鉗子を使用して、ラフ、口、目に腹。切開部位から開始し、全体の眼の周囲の組織を開いて涙。視神経をピンチオフし、目のソケットからそのまま目を削除します。制御または処置した眼のいずれかとして使用するために同じ胚からの左と右眼の両方を収集します。
- 予め温めた（37℃）1×PBSを含む新しい35ミリメートルペトリ皿に目を転送するために、小さなスプーンを使用してください。
全網膜外植片の作製
- 強膜原基を含む眼の周りのすべての組織を除去するために微細な鉗子を使用してください。
注：組織は、色素上皮そのまま（ 図1A-B）と硝子体とレンズで網膜を残して簡単に取り外します。 - 神経網膜（ 図1C）を損傷することなく、眼の背側部分の色素上皮に小さな切開を挟ま細かい鉗子を使用してください。
- 優しく色素上皮startiを開き引き裂く細かい鉗子を使用して、レンズと硝子体（ 図1D）に接続されている網膜全体を残して、切開部位でngの。色素上皮の除去を容易にするために、温かい（37℃）1×PBS中で目を離さありません。
注：色素上皮は、眼の前方領域であり、脈絡膜の亀裂に沿って、瞳孔の周りの毛様体に沿って具体的には、除去するのが困難な場合があります。したがって、色素上皮の一部が神経網膜（ 図1E-F）上に残してもよいです。
全網膜外植片の3治療
- 全体の網膜の外植片のエレクトロポレーション
注：全体の網膜外植片のエレクトロポレーションはステップ2の後に直接実行することができます。- 1 DMEM：F12の栄養ミックス、10％のFBS、10 U / mlペニシリンストレプトマイシン、5μg/ mlのインスリン、および2mM L-グルタミン1を含む培地を準備します。
- 1.5ミリリットル使い捨てプラスチックキュベットをカット（12.5ミリメートル×12.5ミリメートルのx 45メートルM）（または微ブレードソーを用いて底部から）約8mmの300-400μlの溶液を保持することが可能な任意の小容器。
- 0.1μgの/μlの最終濃度に1xDPBSにおける選択肢のDNAプラスミドを希釈します。
- ST20のために15 Vにエレクトロと設定パラメータをオンにします - ST25（E3-E4）網膜とST26のための20のV - ST27（E5）網膜。 1秒間隔で50ミリ秒パルス長の5パルスにパルス繰り返しを設定します。両手が所定の位置に電極を保持するために必要とされるように床に足ペダルで制御することができるパルス発生器を使用してください。
- 形の2パドル（フラット、円形DIAM 4 mm）の白金電極（ 図2A）は 、パルス発生器の出力ソケットに接続します。
注：このプロトコルで使用される白金電極は、大学のワークショップによって作られました。電極は、0.1ミリメートルの白金板」rondelles」（：950のPt / 5銅プラチナグレード）から作られました。接続0.8ミリメートルののwi再プラスチックチューブを用いて絶縁しました。 - 慎重に網膜の外植片のための右先端開口サイズを取得するためにカットオフ先端を有するポリエチレンパスツールピペットを用いて、キュベット（または同等の小型容器）へのステップ2.3からの全網膜外植片を移します。網膜は、プラスチックに付着し、引き裂くする傾向があるとして、ピペットチップを使用しないでください。
- 優しく引き裂きを回避するために、網膜に触れないように注意して網膜の外植片を取り巻く全体の1×PBSを除去するために、100μlのピペットを使用してください。
- 全体の網膜の外植片をカバーするためにキュベットに100μlのプラスミド溶液を追加します。それがトップに浮上する場合は慎重にピンセットで網膜の外植片を押し下げます。キュベットの底にキュベットおよび視神経のいずれかの側を向くようにレンズを配置する鉗子又は電極を使用してください。
- 組織に触れることなく、レンズと網膜（ 図2A）の背後にある負極の前で正極を配置します。
- フットペダルを押し下げて電流を適用します。成功した放電を示す電極での泡のために確認してください。
- 網膜を損傷することなく、キュベットからすべてのプラスミドミックスを除去するために、100μlのピペットを使用してください。プラスミド混合物は、3〜5回再利用することができます。
- 予め温めた（37℃）1×PBSでキュベットを埋めます。優しくキュベットの壁から網膜外植片を分離するために鉗子を使用してください。エレクトロポレーション後、網膜は、時にはそれがキュベットの壁に付着させる泡で覆われています。
- ウェルあたり1ミリリットル予め温め（37℃）培地を含む24ウェルプレートに全体の網膜の外植片を転送するためにポリエチレンパスツールピペットを使用してください。ウェルあたり1網膜外植片をインキュベートします。
- 24時間、5％CO 2で細胞インキュベーターの内部で、毎分50回転の一定速度で、回転子シェーカー上で37℃での網膜外植をインキュベートします。回転を培地にし、preveに最大の露出を確保することです24ウェルプレートの底に網膜のNT接着。
- ステップ4に進みます。
- 化学試薬を用いた全網膜外植片の治療
注意：全体の網膜の外植片の化学的処理は、ステップ2の後に直接実行することができます。- 1 DMEM：F12の栄養ミックス、10％のFBS、10 U / mlペニシリンストレプトマイシン、5μg/ mlのインスリン、および2mM L-グルタミン1を含む培地を準備します。
- 1ミリリットルにウェル当たり予め温め（37℃）培地を含む24ウェルプレートにステップ2.3から網膜外植片を転送するために、小さなスプーンを使用してください。ウェルあたり1網膜外植片をインキュベートします。
- 化学試薬またはビヒクルを添加する前に5％CO 2での細胞培養器の内部で、50 rpmの一定速度で、回転子シェーカー上で37℃で60分間、全網膜外植片をインキュベートします。
- 例えば、薬液を調製するCdk1 / 2阻害剤III、最終的にM期の進行13の阻害剤DMSO中、30μMの濃度。
- 細胞インキュベーターから、全体の網膜の外植片を含む、24ウェルプレートを取り外します。 0.01％DMSO中300 nMのCdk1の/ 2阻害剤IIIの最終濃度で、その結果、網膜の中に直接化学試薬またはビヒクル（DMSO）の10μLを追加します。手動で、溶液中の化学試薬または車両の均一な分布を可能にするために、24ウェルプレートを回転させます。
- 希望の時間（最大24時間）、5％CO 2のインキュベーターの内側に、毎分50回転の一定速度で、回転子シェーカー上で37℃での網膜外植片をインキュベートします。
- ステップ4に進みます。
4.固定全体網膜Eexplantsの凍結
- 細胞インキュベーターから治療全体の網膜外植片を含む24ウェルプレートを取り外します。
- 1×PBSで1ミリリットル/ウェルの氷冷4％パラホルムアルデヒドを含む24ウェルプレートに網膜外植片を転送するために、小さなスプーンを使用してください。 Incuba15分間氷上でTE。
- 網膜を洗浄するために1ミリリットル/ウェルの氷冷を1×PBSを含む24ウェルプレートに全体の網膜の外植片を転送するために、小さなスプーンを使用してください。氷上で10分間インキュベートします。
- 1ミリリットル/を1×PBSでよく氷冷30％スクロースを含む24ウェルプレートに全体の網膜の外植片を転送するために、小さなスプーンを使用してください。網膜の日胚に応じて1〜3時間、氷上でインキュベートします。 ST20について - ST25（E3）網膜は、1時間インキュベート、古い網膜は、スクロースより長いインキュベーション時間を必要としています。
- 約500μlのクライオスタット凍結マウンティング培地を含むパラフィンフィルム上に全体の網膜の外植片を転送するために、小さなスプーンを使用してください。そっと小さなスプーンを使用して、凍結培地の網膜外植片を移動させることにより、できるだけ多くのショ糖、できるだけ削除します。
- 凍結培地を含む埋め込む型に網膜外植を転送します。将来の切片を容易にするために、目の位置を調整します。 DRの全網膜外植片を含む埋め込む型を入れて中までのy氷は固体凍結されます。 -80℃で保存してください。
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Representative Results
このプロトコルは、ニワトリ胚からの全体の網膜の外植片の準備（ 図1A-F）および培養について説明します。このプロトコルが正常にST31にST20（E3）の胚からの全体の網膜外植（E7）のために使用されています。
全網膜外植片へのDNAプラスミドのエレクトロポレーションは、網膜前駆細胞の標識および追跡のためにまたは過剰発現の異なる遺伝子産物のことができます。エレクトロポレーション実験のために、色素上皮を慎重ST25（E4 1/2）胚の除核眼から削除されました。全網膜外植片を、次いでDNAプラスミド溶液を含むキュベットに入れ、電極（ 図2A）に沈めた後、電流を印加しました。培養の24時間後、GFP陽性細胞は、無傷の網膜（ 図2B）の大部分が見えました。切片後、単一のGFP +細胞を簡単に網膜（FIのapico-基底軸に沿って検出されましたグレ2C）。エレクトロポレーションは、プラスミドを占有し、レポーター遺伝子を発現する大網膜の領域をもたらしました。エレクトロポ面積合計網膜の1/5よりも大きい、と網膜の数で測定された成功率は、263目のうち14％（37と比較すると、全体の網膜の外植片のエレクトロポレーション用（83網膜のうち62）75％でした）OVOエレクトロポレーションでため。全体の網膜外植片のエレクトロポレーション実験は成功したST27（E5）の胚にST20（E3）で行われています。
全体の網膜の外植片を、約24時間（ 図3AおよびB）のために培養することができます。より長いインキュベーション時間は、発育遅延、形態学的奇形、アポトーシスおよび網膜（ 図3C）の最終的な崩壊につながる可能性があります。全体外植片として鶏の網膜を培養すると、網膜の構造はそのまま残ります。これはapico-BASに沿って細胞周期の異なる位相分布を含みますアル軸。正常な発達の間に細胞が網膜14,15の頂端側の有糸分裂に続いて、基底側のS期を経ます。 24時間培養全体の網膜の外植片からのセクションは、後期G2 / M期（ 図3D）で細胞を標識し、ホスホ-ヒストン3（PH 3）抗体で免疫染色しました。 PH 3陽性細胞は正常な網膜の開発と一致し、網膜の頂端側に発見されました。核内のアクティブなサイクリンB1-Cdk1の複合体は、M-相転移13を開始します 。 Cdk1のキナーゼ活性をブロックすると、有糸分裂への細胞周期の増殖のために必要なダウンストリームイベントを阻害します。ステージ29（E6）全体の網膜外植片を4時間するCdk1 / 2阻害剤IIIと共にインキュベートし、PH3免疫反応性を分析しました。するCdk1 / 2阻害剤IIIは、G2 / M期移行の効率的なブロックを示し、PH3陽性細胞（ 図3E）の数を減少させました。下水処理後の有糸分裂数の削減NTするCdk1 / 2阻害剤による治療が有効であったことを確認しました。
色素上皮の図1.除去。胎生6（ST29）鶏の目を解剖し、全体の網膜外植片として培養のために調製した。瞳孔とレンズと下向きに脈絡膜の亀裂と前眼の（A）の表示。色素上皮は無傷であるが、強膜原基と周囲の結合組織が 削除されました。眼の後方部分の（B）の表示。視神経出口と脈絡膜の亀裂が下を向いている。色素上皮における（C）切開を。（D）色素上皮のほとんどが削除されました。（E）一部の色素上皮は、毛様体の縁に沿ってのままにし、（されていますF）脈絡膜亀裂。 LE：レンズと毛様体、CF：視神経出口：ON脈絡膜亀裂、。スケールバーは0.5mmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
全網膜外植片の図2エレクトロ。（A）は概略白金電極の提示、それらは切り捨てキュベットにおけるDNAプラスミド溶液中に浸漬されている全体の網膜外植片の両側に配置されている方法（B）の後に全網膜外植24培養の時間、および（C）は 、網膜を切断しました。 ON：視神経終了。スケールバーは、（A）4ミリメートル、（B）（C）50μmの0.5ミリメートル、である。 大きなを見るにはこちらをクリックしてくださいましこの図のrsion。
図3.培養全体の網膜の外植片を、固定凍結、凍結切片、および免疫組織化学によって標識した。24時間培養（A）ST29全体網膜外植片を。 （B）24時間及び（C）の後に核染色の蛍光顕微鏡写真を48時間（D）PH3抗体は後期G2 / M期の細胞を標識するために使用した。（E）相対密度（PH3 +細胞/ mm 2、車両に比べて4時間するCdk1 / 2阻害剤III処理の後にST29で平均±SD）とPH 3 +細胞の蛍光顕微鏡写真。 ST：ハンバーガーとハミルトンのステージ、スチューデントのt検定、** P <0.01、N≥4処理した眼、目あたり4つのセクション、H：時間。スケールバーは、（A）0.5ミリメートルは、（BE）は10μmです。jove.com/files/ftp_upload/53202/53202fig3large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
この作品では、切開、エレクトロポレーションまたは化学的処理、およびニワトリ胚からの全体の網膜の外植片を培養するための詳細なプロトコルが提示されています。このプロトコルは、迅速、簡単であり、高い成功率と再現性の両方を可能にします 結果。
全網膜外植片のエレクトロポレーションは、対象の遺伝子構築物を発現する細胞の大部分を生成します。これは、正確に電極を配置することと定義されるDNAプラスミド濃度に網膜の特定の部分を露出することが容易です。このアプローチは、 卵内電気穿孔と比べて一般的に高い成功率と網膜における遺伝子機能を研究するための信頼性の高い方法を可能にする。全体の網膜外植も与える化学試薬の規定された濃度を含む培地に網膜を露出させることが可能となります神経網膜中の試薬 の均一な分布。プロトコルを組み合わせを可能にします網膜が最初にエレクトロポレーションした後の物質で処理するトリートメント。処置群および対照眼の双方が同一の胚から収集することができ、独立して扱われるので、個々の胚間の変動の影響を最小化することができます。
化学物質の治療のためのST31（E7）の胚にエレクトロポレーションおよびST20（E3）のためのプロトコルはST27にST20（E3）から全体の網膜外植用に最適化されている（E5）の胚。若い段階で網膜/オプティックカップを効果的に処理するには小さすぎると壊れやすく、エレクトロポレーション卵内には、最も可能性の高い、より効率的です。全体の網膜外植片のエレクトロポレーションは、ST27（E5）より古い段階で実行されませんでした。それは古い胚から外植片に、このプロトコルを適合させることが可能と思われます。それが取得大きいキュベット、インキュベーションのためのより大きなウェルおよび網膜培養液量の増加が含まれるであろう。しかし、E12-14によって色素上皮との外側のセグメント光受容細胞は、密接に関連するなり、色素上皮の除去は、網膜を損傷することがあります。網膜は、全体の実験手順およびインキュベーションの間、無傷でなければなりません。
この解剖培養プロトコルで、網膜の構造の構造的完全性は、細胞型特異的マーカーの発現に基づいて、24時間の間、無傷のままです。述べたように、我々は、外植片に細胞周期の進行を研究しており、網膜前駆細胞のinterkinetic核移行のプロセスは正常に見えます。プロトコルが迅速に行われた場合、外植片における発達の進行上のわずかな効果があります。しかし、開発がわずかに減速することができ、24時間培養した外植片は正常対応物より1~2時間若い発育年齢を示してもよいです。これは、年齢をマッチさせた正常な網膜の外植片を比較することをお勧めします、それは実験が正しくありませんように反対側の眼を使用することをお勧めしますアリ防除。これは、網膜色素上皮の除去は、外光受容体セグメントの発達に影響を及ぼし得ることを指摘しておきます。また、外植網膜が軸索切断網膜神経節細胞で負傷した網膜を表していることが指摘されるべきです。
このプロトコルは、シンプルであるため、実験誤差を減少させるが、 元のOVOの状況は、いくつかの実験のコントロールが求められています。対象となる具体的な発達過程も並行して研究することができると OVO 状況で正常と比較しても、プロトコルOVOこのEXを用いて研究します。適切な実験的なコントロールは、常にこのような物質を可溶化するために使用される車両として、含まれている必要があります。信号経路の遮断薬を使用する場合は、同じプロセスのために、いくつかの異なる阻害剤を使用するか検討されている特定の経路の複数のレベルでの酵素を標的とする別の阻害剤を使用しています。エレクトロポレーションのために、GFPを発現するDNAプラスミドは便利aはSA陽性対照。 （ - ）が誤って配置されているそのようなプラスミドは、任意のレポーター遺伝子発現を生成しない場合、それが原因の陽極（+）と陰極がその可能性が最も高いです。 DNAプラスミドはその後、網膜から離れて移行します。新規DNAプラスミドをテストするときには、そのための内部エレクトロポレーション制御などの異なる蛍光タンパク質を発現するDNAプラスミドを含むことが推奨されます。このプロトコルに記載のエレクトロポレーションパラメータは、細胞を発現するレポーター遺伝子の多数を生成するように最適化されています。電圧またはパルス数を減少させることは、偽陰性の結果を生じることができるトランスフェクトされた細胞の数を減少させます。しかし、電圧またはパルス数を増加させることは、組織の損傷および細胞死の増加をもたらし得ます。カスタムメイド白金電極3組の任意の容量低下を示すことなく、二年以上の間、すべての電気穿孔のために使用されています。電極は慎重に清掃し、電極surfacする必要がありますeは研磨されます。市販の4ミリメートルのパドル電極が使用可能です。
このプロトコルは、DNAプラスミドのエレクトロポレーションおよび全体の網膜の外植片の化学的処理に焦点を当てています。さらに、このようなモルホリノオリゴマーを用いた遺伝子発現のノックダウンのような他の実験手順を含むように、このプロトコルを拡張することが可能です。全体の網膜の外植手順は、簡単、迅速かつ再現性の高い方法で、短期的な実験を行うための可能性を開きます。これは、コスト、時間、および各実験に必要な動物の数を減少させ、最も重要なことは、固体のデータを取得する可能性を増大させます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1xPBS (tablet) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10x DPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 734-0006 | |
| 100 μl pipette tips | VWR | 613-0798 | |
| 1.5 ml disposable plastic cuvette | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24-well plate | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm Petri dish | VWR | 391-1998 | |
| 70% ethanol | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inhibitor III | 217714 | Calbiochem | 300 nM in 0.01% DMSO |
| Cell culture incubator | Thermo Forma | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Electrodes | Platina, custom made | ||
| Electro square porator ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 Nutrient mix | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Forceps | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Freezing medium NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| GFP expressing DNA plasmid (pZGs) | |||
| Humidified incubator | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| Mounting medium ProLong Gold with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Paraffin film | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way embedding mold | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicillin streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| PhosphoHistone 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Dilution 1/4,000 |
| Platinum electrodes (custom made from "rondelles") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Dia: 4mm, 0.1 mm thickness |
| Platimun electrodes | Sonidel | CUY700P4L | Dia: 4 mm |
| Polyethylene pasteur pipette | VWR | 612-2853 | |
| Rotator shaker | VWR | 444-2900 | |
| Small spoon | VWR | 231-2151 | |
| Sucrose | VWR | 443815S | |
| White Leghorn eggs | Local supplier | ||
| Wine cooler | WineMaster 24, Caso, Berlin Germany |
References
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