Summary
Bu protokol, teşrih deneysel işlemek ve tavuk embriyo kültür bütün retinal eksplantlar için bir yöntem tarif eder. Yüksek başarı oranı, etkinlik ve tekrarlanabilirlik elektroporasyon ve / veya reaktif maddelerin, örneğin, enzimatik inhibitörleri için plasmidlerin etkilerini test etmek için gerekli olduğunda eksplant kültürleri yararlıdır.
Abstract
Retina gelişen santral sinir sistemi için iyi bir modeldir. Ovo / in vivo deneysel manipülasyonlar için gözün büyük boy ve en önemlisi erişilebilirlik tavuk embriyonik retina çok yönlü ve çok verimli deneysel bir model yapar. Tavuk retina göz içi enjeksiyonlar veya elektroporasyon ile ovo hedef kolay olmasına rağmen, retinada reaktiflerin etkili ve tam konsantrasyonu, tam olarak kontrol edilmesi zor olabilir. Bu göz veya maddelerin dengesiz difüzyon tam enjeksiyon yerinde, kaçak varyasyonları nedeniyle olabilir. Ayrıca, bu tür elektroporasyon gibi invaziv manipülasyonlara sonra malformasyonlar ve ölüm sıklığı oldukça yüksektir.
Bu protokol, tavuk embriyolarından bütün retinal eksplantlar kültürlenmesi için tekniğin ovo bir eski açıklar ve reaktifler retinanın kontrol maruz için bir yöntem sağlar. Protocol deneysel, incelemek işlemek ve tavuk embriyoları kültür bütün retina eksplantlar açıklamaktadır. Eksplantlar, yaklaşık 24 saat boyunca kültüre edilebilir ve elektroporasyon gibi farklı manipülasyonlara tabi. Önemli avantajları Deney embriyo hayatta kalma ve katılan reaktif maddenin konsantrasyonu değişebilir ve etkili konsantrasyonunu tespit etmek ve optimize etmek için kontrol edilebilir bağımlı değildir vardır. Ayrıca, teknik, yüksek deneysel bir başarı oranı ile birlikte, hızlı, ucuz ve, bu tekrarlanabilir sağlar Sonuçlar. O ovo yapılan deneyler için mükemmel bir tamamlayıcı olarak hizmet ettiği vurgulanmalıdır.
Introduction
Retina, merkezi sinir sisteminin bir parçasıdır ve göreli olarak basit ve iyi karakterize edilmiş hücre mimarisi, merkezi sinir sistemi gelişme eğitim için uygun bir model ile, bir. Tavuk embriyo göz embriyo geri kalanına kıyasla nispeten büyüktür. Bu nedenle bu tür enjeksiyonlar veya elektroporasyon gibi deneysel manipülasyonlar için ovo kolayca erişilebilir ve retina hücre ve in vivo gelişimsel biyoloji hakkında bilgi sahibi için mükemmel bir araç olarak hizmet vermektedir. Deneyler elektroporasyon, tekrar enjeksiyonları ya da kombine deneysel manipülasyonlar ile olduğu gibi invazif zaman bu büyük avantajlara rağmen, embriyoların sağkalım düşük olabilir.
Ovo tavuk embriyo DNA plazmid Elektroporasyon önemli ve iyi bilinen bir tekniktir 1'dir. Bu merkezi nerv hücre kaderinin yanı sıra nöronal yolları izleme, nöronların etiketlenmesi için izin verirlı sistemi ve in vivo proteinin fonksiyonunu analiz etmek için ektopik gen ifadesi için izin verir. Tekniğin 3 arka beyin ve 4 retina, nöral tüp 2 çalışmaları için kullanılmıştır. Ovo embriyonik retinanın Elektroporasyon in vivo durumla ilgili bazı deneysel zorlukları vardır. Embriyonun kranyal katlama nedeniyle göz konumu, kalpten nispeten yakındır. Bu yakınlık elektroporasyon aşağıdaki kardiyak arrest riskini ve embriyonun yaşla birlikte riski de artmaktadır. Ayrıca, göz erişmek için, bu suretle kanama, malformasyonlar ve sonraki azaltılmış canlılığı riskini artırarak, embriyonik zarlar açmak için gereklidir. Test ve bilinen bir fenotipik sonuç olmadan sık sık yeni bir DNA plazmid optimize ederken, bu sınırlamalar bile deneyimli bir deneye ilişkin yöntemin etkinliğini ve gücünü azaltabilir. Bu protokol, w kültüründe görüldüğü gibikaldırıldı pigment epiteli ile tüm nöral retina olarak tanımlanan deliğin retina eksplant, ovo yaklaşımda tamamlar verimli bir yöntemdir.
Kimyasal reaktifler Göz içi enjeksiyonları ovo gerçekleştirmek için göreceli olarak kolaydır. Ancak, sinir retinada enjekte reaktiflerin etkili ve tam konsantrasyonu, tam olarak kontrol etmek zor olabilir. Enjekte edilen hacim kaçak nedeniyle değişebilir ve enjeksiyon tam site gözün içindeki reaktif dağılımı ve vitreus yoluyla yayılmasını hem de etkileyebilir. Değişkenlik, yani bir enzim inhibitörü bir doz-yanıt eğrisi belirlenir sonuçların yorumlanması için önemli etkileri olacaktır; etkisi küçük ve etkisi zamansal pencere dar özellikle. Ovo deneylerde yaparken Üstelik, yalnızca tek göz, kan akışı yoluyla sistemik potansiyel etkilerine her embriyo kullanılabilirkontralateral gözün üzerine. Geliştirilmesi ve tedavi ve kontrol embriyolar ek deneysel değişkenliği yol açabilir arasındaki bireysel değişkenliği çalışılırken yaş eşleştirme önemlidir.
Bu nedenlerden dolayı, tavuk embriyolarından retina eksplantlar göre yöntem ovo eski bir nöral retinanın tekbiçimli maruz kalabilir ve in vitro deney koşullarını kontrol geliştirilmiştir. Mevcut protokol önceki protokollere 5-9 dayanarak geliştirilmiştir. Aşamasından Retina eksplantlar (st) st31 20 (3, embriyonik gün [E]) (E7) tavuk embriyoları kültürlendi, parçalara ayrıldı ve elektroporasyona tanımlanmış bir DNA plazmid konsantrasyonu veya bir kimyasal madde belirli bir konsantrasyonunu içeren bir ortama maruz bırakıldı. Burada sunulan protokol başarılı şekilde KU55933, SB 218078 ve NSC 109555 dito gibi DNA hasar yolağının regülatörleri de dahil olmak üzere, pek çok farklı kimyasal reaktif maddeler kullanılarak son yayınlarda uygulanmıştırBöyle CDK1 / 2 inhibitörü III 10,11 olarak mesilattır ve hücre döngüsü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol "vizyonu ve Oftalmoloji araştırma Derneği Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu" nda tavsiyeleri doğrultusunda yapılır.
1. Yumurta Taşıma ve Göz koleksiyonu
- 1 hafta daha uzun süre 12-14 ° C'de beyaz Livorno yumurta saklayın. Varsa, döllenmiş yumurta saklamak için buzdolabında şarap soğutucu kullanın.
Not: düşük sıcaklıklar mortaliteyi artırırken yüksek mağaza sıcaklıkları, embriyo anormal gelişmesine yol açar. Genişletilmiş depolama süresi, mortalite ve anormal gelişimi hem de artırır. - Yumuşak, 24 saat başına 5 kez sıklıkta sallanan bir 37.5 ° C ve% 60 yumurta nemlendirilmiş kuluçka inkübe edin.
- İstenilen embriyonik yaşta yumurta inkübatör kuluçkaya yumurta çıkarın.
Not: Tavuk embriyo yaşı fırınlama süresi olarak belirlenir ve embriyonik gün (E) ya da aşamaları olarak ifade edilmektedir (st), Hamburger ve Hamilton 12 tarafından açıklanan gelişim evrelerinin serilere göre. - Laminer akış kaputu seçilen yumurta yerleştirin. Embriyonun kirlenmesini önlemek için% 70 etanol ile yumurta kabuğu silin.
Not: Steril çözümleri ile aseptik şartlarda tüm işlemleri yürütmekhttp://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions ve aletleri. - Yumurta açık çatlamak sıkıca sert bir yüzeye karşı yumurtanın yan dokunun. 100 mm Petri kabındaki içeriği yerleştirin. Kurumasını önlemek için doku önceden ısıtılmış (37 ° C) 1x PBS içeren 35 mm Petri kabı embriyo transferi için küçük bir kaşık kullanın.
- Laminer akış kaputu bir binoküler mikroskop stereovision üzerine embriyonik doku içeren 35 mm Petri kabı yerleştirin. Ince forseps ile boyun sıkıştırarak embriyo başını kesmek ve vücudu atın.
- Inci bir kesi yapmak için ince forseps kullanınGöze ventral kaba ağız. Kesi yerinde başlayan, tüm göz çevreleyen doku yırtarak açın. Optik siniri çimdik ve göz prizden sağlam gözü kaldırın. Kontrol veya tedavi göz ya da kullanım için aynı embriyodan sol ve sağ göz hem de toplayın.
- Önceden ısıtılmış (37 ° C) 1 x PBS içeren yeni bir 35 mm Petri kabı gözleri aktarmak için küçük bir kaşık kullanın.
Tüm Retina Eksplantlarından 2. Hazırlık
- Skleral anlage dahil gözün çevresindeki tüm doku kaldırmak için ince forseps kullanın.
Not: Doku kolayca pigment epiteli bozulmamış (Şekil 1A-B) ile vitreus ve retina mercek üzerinde bırakarak ayırmak olacaktır. - Nöral retina (Şekil 1C) zarar vermeden, gözün dorsal kısmında pigment epiteli içine küçük bir kesi tutam ince forseps kullanın.
- Yavaşça pigment epitel starti açmak gözyaşı ince forseps kullanın, kesi yerinde ng lens ve vitreus (Şekil 1D) bağlı tüm retina bırakarak. Pigment epitelinin çıkarılmasını kolaylaştırmak için sıcak (37 ° C) 1 x PBS içinde göz tutun.
Pigment epitel, gözün ön bölgesinde, öğrenci etrafında siliyer cisim boyunca, özellikle çıkarılması zor olabilir ve koroid fissür boyunca Not:. Bu nedenle, pigment epitel bazı nöral retina (Şekil 1E-F) bırakılabilir.
Tüm Retina Eksplantlarından 3. Tedavi
- Bütün retina eksplantlar Elektroporasyon
Not: Bütün retina eksplantlar Elektroporasyon aşama 2'de hemen sonra gerçekleştirilebilir.- 1 DMEM: F12 Besin karışımı,% 10 FBS, 10 U / ml penisilin streptomisin, 5 ug / ml insülin, 2 mM L-glutamin ihtiva eden 1 kültür ortamı hazırlayın.
- 1.5 ml tek kullanımlık plastik küvetini kesti (12.5 mm x 12.5 mm x 45 mm) (ya da ince bir testere kullanmak sureti alttan olarak) yaklaşık 8 mm 300-400 ul çözelti tutma kapasitesine sahip herhangi bir küçük kap.
- 0.1 ug / ul son konsantrasyon 1xDPBS tercih edilen bir DNA plazmidi seyreltilir.
- ST20 için 15 V Electroporator ve ayarlanan parametreler açın - ST25 (E3-E4) retina ve st26 20 V - st27 (E5) retinanın. 1 sn aralıklarla 50 msn darbe uzunluğu 5 darbeleri darbe tekrarlar ayarlayın. Her iki elin yerine Elektrotları tutmak için gerekli olacak şekilde kat bir ayak pedalı, edilebilir bir puls jeneratörü kullanın.
- İki kürek biçimli (düz, yuvarlak diam. 4 mm) bağlayın platin elektrotlar (Şekil 2A) puls üreteci üzerine çıkış soketine.
Not: Bu protokolde kullanılan platin elektrot üniversite atölyesi tarafından yapılmıştır. Elektrotlar 0.1 mm platin plak "rondelles" (: 950 Pt / 5 Cu platin notu) yapılmıştır. Bağlanma 0,8 mm wiyeniden plastik boru kullanılarak izole edilmiştir. - Dikkatle retina eksplant için doğru ucu açılma boyutunu elde etmek kesilmiş ucu ile bir polietilen Pasteur pipeti kullanarak küvete (veya eşdeğer küçük kap) Adım 2.3 kadar tüm retina eksplant aktarın. Retina plastik eklemek ve parçalıyorlar eğilimi pipet uçları kullanmaktan kaçının.
- Yavaşça yırtılmasını önlemek için retina dokunmamaya retina eksplant özen çevreleyen tüm 1x PBS kaldırmak için 100 ul pipet kullanın.
- Bütün retina eksplant kapsayacak şekilde küvete 100 ul plazma çözeltisi ekleyin. O üstüne yüzen eğer hafifçe forseps ile retina eksplant aşağıya doğru bastırın. Küvete altına beher ve optik sinir herhangi bir tarafı yüz merceği için forseps veya elektrotlar kullanın.
- Doku dokunmadan, lens ve retina (Şekil 2A) arkasına negatif elektrodun karşısında pozitif elektrot yerleştirin.
- Ayak pedalına basarak akımı uygulayın. Başarılı akıntı belirten elektrotlarda baloncuklar için kontrol edin.
- Retina zarar vermeden küvetin tüm plazmid karışımı kaldırmak için 100 ul pipet kullanın. Plazmid karışımı üç beş kez tekrar edilebilir.
- Önceden ısıtılmış (37 ° C) 1x PBS ile küveti doldurun. Yavaşça küvetin duvardan retina eksplant ayırmak için forseps kullanabilir. Elektroporasyondan sonra retina bazen küvetin çeperine bağlı yapan, kabarcıkları ile kaplıdır.
- Oyuk başına 1 mi, önceden ısıtılmış (37 ° C) ihtiva eden bir kültür ortamı, 24 oyuklu bir plaka içine bütün retinal eksplant aktarmak için polietilen bir Pasteur pipeti kullanarak. Kuyu başına bir retina eksplant inkübe edin.
- 24 saat boyunca% 5 CO2 ile bir hücre kuluçka makinesi içinde, 50 rpm'lik sabit bir hızla, bir döndürücü çalkalayıcı üzerinde 37 ° C'de retina eksplant inkübe edin. Rotasyon orta ve Preve için maksimum etkiyi sağlamak için24 oyuklu plakanın alt retinanın nt yapışır.
- 4. adıma geçin.
- Kimyasal reaktifler ile bütün retinal eksplantlar tedavisi
Not: Bütün retina eksplantlar kimyasal işleme aşamasının 2 hemen sonra gerçekleştirilebilir.- 1 DMEM: F12 Besin karışımı,% 10 FBS, 10 U / ml penisilin streptomisin, 5 ug / ml insülin, 2 mM L-glutamin ihtiva eden 1 kültür ortamı hazırlayın.
- Oyuk başına (37 ° C) kültür ortamı önceden ısıtılmış 1 ml ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka içine adım 2.3 retina eksplant aktarmak için küçük bir kaşık kullanın. Kuyu başına bir retina eksplant inkübe edin.
- Kimyasal reaktif veya aracına ilave edilmeden önce% 5 CO2 ile bir hücre kuluçka makinesi içinde, 50 rpm'lik sabit bir hızla, bir döndürücü çalkalayıcı üzerinde 37 ° C'de 60 dakika boyunca, tüm retina eksplant inkübe edin.
- Örneğin, kimyasal çözelti hazırlayın Cdk1 / 2 inhibitörü III, nihai olarak M faz ilerlemesi 13 inhibitörü,DMSO içinde 30 uM konsantrasyonu.
- Hücre inkübatör, tüm retina eksplant içeren 24 kuyu plakasını sökün. % 0.01 DMSO içinde 300 nM CDK1 / 2 inhibitörü III'ün bir nihai konsantrasyonu elde retina ortamı doğrudan kimyasal reaktif ya da araç (DMSO), 10 ul ekle. El ile çözelti içinde kimyasal reaktif veya aracın eşit dağılımını sağlamak için 24 oyuklu plaka döndürün.
- İstenen süre (en fazla 24 saat) süreyle% 5 CO2 ile bir inkübatör içinde 50 rpm sabit bir hızla, bir döndürücü çalkalayıcı üzerinde 37 ° C'de retina eksplantlar inkübe edin.
- 4. adıma geçin.
4. Tespit ve Tüm Retina Eexplants dondurulması
- Hücre inkübatör tedavi bütün retina eksplant içeren 24 kuyu plakasını sökün.
- 1 ml 1xPBS bölgesindeki / oyuk buz soğuğu% 4 paraformaldehid içeren bir 24-çukurlu plaka retina eksplant aktarmak için küçük bir kaşık kullanın. Incuba15 dakika süreyle buz üzerinde te.
- Retina yıkamak için 1 ml / oyuk buz soğuğu 1xPBS ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka bütün retinal eksplant aktarmak için küçük bir kaşık kullanın. 10 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- 1 ml / 1xPBS iyi buz soğukluğunda% 30 sukroz ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka bütün retinal eksplant aktarmak için küçük bir kaşık kullanın. 1-3 saat retinanın embriyonik gün bağlı buz üzerinde kuluçkaya yatmaktadır. ST20 için - ST25 (E3) retinalar, 1 saat süre ile inkübe edilir, daha eski retinalar sukroz uzun inkübasyon süresi gerekir.
- Yaklaşık 500 ul kriyostat dondurma montaj orta içeren bir parafin film üzerine tüm retina eksplant aktarmak için küçük bir kaşık kullanın. Yavaşça küçük kaşık kullanarak dondurma ortamda retina eksplant hareket ettirerek kadar sakaroz mümkün olduğunca kaldırın.
- Donma orta içeren bir gömme kalıp retina eksplant aktarın. Gelecekteki bölümlendirilmeleri kolaylaştırmak için göz yerleştirin. Dr üzerinde tüm retina eksplant içeren gömme kalıp koyunorta kadar y buz katı dondurulur. -80 ° C saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, tavuk embriyolarından bütün retinal eksplantların preparasyonu (Şekil 1A-F) kültürlenmesini tarif eder. Bu protokol, başarılı bir şekilde st31 için ST20 (E3) embriyolardan tam retina eksplantlar (E7) kullanılmaktadır.
Bütün retina eksplantlar, DNA plazmidleri Elektroporasyon retina progenitör hücrelerin etiketlenmesi ve izleme ya da aşırı ifadesi, farklı gen ürünlerinin sağlar. Elektroporasyon deneyleri için, pigment epitel dikkatle ST25 (E4 ½) embriyosunun enüklee göz çıkarıldı. Bütün retina eksplant daha sonra DNA plazmid çözeltisi ihtiva eden bir küvete konuldu, elektrotlar (Şekil 2A) daldırılmış ve bir akım uygulanmıştır. Kültürlemeden 24 saat sonra GFP pozitif hücreler sağlam retina (Şekil 2B) büyük bir bölümünde görünür. Kesit sonra tek bir GFP + hücreleri kolayca retinanın apico-bazal eksen (Fi boyunca tespit edildişekil 2C). Elektroporasyon geniş retina alan plazmid alarak ve raportör genini ifade sonuçlandı. Bir Electroporated alanın toplam retina 1/5 daha büyük olan retina sayısına göre ölçülen başarı oranı, 263 gözlerin dışarı% 14 (37 oranla, tüm retina eksplant elektroporasyon için (83 retina dışarı 62)% 75 idi ) ovo elektroporasyon için. Bütün retina eksplant üzerinde Elektroporasyon deneyleri başarıyla st27 (E5) embriyolar ST20 (E3) üzerine yapılmıştır.
Bütün retina eksplantlar yaklaşık 24 saat (Şekil 3A ve B) kültürlenebilir. Daha uzun inkübasyon süreleri gelişme geriliği, morfolojik malformasyonlar, apoptoz ve retina (Şekil 3C) en sonunda parçalanmasına yol açabilir. Bütün eksplant olarak tavuk retina kültüre zaman retinanın mimarisi bozulmadan kalır. Bu apico-bas boyunca hücre döngüsünün farklı aşamalarında dağılımını içeriral ekseni. Normal gelişim sırasında hücrelerin retina 14,15 apikal tarafında mitoz ardından bazal tarafında S-fazı, tabi. 24 saat süre ile kültüre bir bütün retinal eksplanttan bir bölümü, geç G2 / M-faz (Şekil 3D) 'de hücrelerin etiketlenmesi, fosfo-Histon 3 (PH3) antikoru ile immüno-lekelendi. PH3 pozitif hücreler normal retina gelişimi ile tutarlı retinanın, apikal tarafında bulundu. Çekirdekte aktif siklin B1-Cdk1 kompleksi M faz geçişi 13 başlatacaktır. Cdk1-kinaz aktivitesini bloke etme mitoz hücre döngüsü içine yayılması için gerekli olan aşağı akım olayları inhibe eder. Aşama 29 (E6) tüm retina eksplantlar 4 saat CDK1 / 2 Inhibitor III ile inkübe edildi ve PH3 immünoreaktivitesi analiz edilmiştir. Cdk1 / 2 inhibitörü III G2 / M faz geçişi etkili bir blok belirten PH3 pozitif hücreler (Şekil 3E) sayısını azalttı. Yapıları temizleme sonrası mitoz sayısının azaltılmasıCdk1 / 2 inhibitörü ile nt tedavinin etkili olduğunu doğruladı.
Şekil pigment epitel 1. çıkarılması. Bir embriyonik gün 6 (st29) tavuk göz disseke ve tüm retina eksplant olarak kültür için hazırlanmıştır. Öğrenci ve lens ve aşağı bakacak şekilde koroid fissür ile ön gözün (A) Görünüm. Pigment epitel sağlam ama skleral anlage ve çevresindeki bağ dokusu kaldırıldı. Gözün arka kısmının (B) Görünüm. Optik sinir çıkış ve koroid fissür aşağıya bakacak. Pigment epiteli (C) Kesi. (D) pigment epiteli çoğu kaldırılmıştır. (E) Bazı pigment epiteli siliyer cisim ve RIM (boyunca bırakılır F) koroid fissür. LE: Objektif ve siliyer cisim, CF:Optik sinir çıkışında: AÇIK koroid fissür. Ölçek çubuğu 0.5 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bütün retina eksplant Şekil 2. elektroporasyonu. (A) şematik platin elektrot sunumu ve tepe bölümü kesik küvet içinde DNA plazmid çözeltisi içine batırılmış durumda bütün retinal eksplant iki tarafında konumlandırılmış kadar. (B) sonra, bütün retinal eksplant 24 Kulturleme hr ve (C) retina kesitli. ON: Optik sinir çıkmak. Ölçek çubuğu (A) 4 mm, (B) 0,5 mm, (C) 50 mikron. Daha büyük bir ettik görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın rsion.
Şekil 3. Kültürlenmiş bütün retinal eksplantlar, sabit dondurulmuş, cryosectioned ve immünohistokimya vasıtasıyla ayrıca etiketlenmiştir. 24 saat süre ile kültüre (A) st29 bütün retinal eksplant. (B) 24 saat ve (C) 48 saat sonra nükleer boyama Floresan mikrograflan. (D) Bir PH3 antikoru geç G2 / M fazında etiketli hücreler için kullanıldı. (E) nispi yoğunluk (PH3 + hücre / mm2, Cdk1 / 2 inhibitörü III tedavi 4 saat araca kıyasla sonra st29 de PH3 + hücrelerinin mikrograflannı ortalama ± SD) ve floresan. st: Hamburger ve Hamilton aşamaları, Student t-testi, ** p <0.01, n ≥ 4 muamele gözler, göz başına 4 bölüm, h: saat. Ölçek çubuğu (A) 0,5 mm, 10 mm (BE) 'dir.jove.com/files/ftp_upload/53202/53202fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada diseksiyon, elektroporasyon veya kimyasal arıtma ve tavuk embriyoları tüm retina eksplant kültür için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Bu protokol, hızlı, kolay ve hem de yüksek bir başarı oranı ve tekrarlanabilir sağlar Sonuçlar.
Bütün retina eksplantlar Elektroporasyon söz konusu gen yapısını eksprese eden hücrelerin büyük bir kısmını oluşturur. Bu doğru elektrotları konumlandırmak için ve tanımlanmış bir DNA plazmid konsantrasyonuna retinanın belirli bir bölümünü açığa çıkarmak için kolaydır. Bu yaklaşım, ovo elektroporasyon kıyasla genellikle daha yüksek bir başarı oranı ile retina gen fonksiyonu araştırmak için güvenilir bir yöntem sağlar. Bütün retina eksplant de mümkün veren bir kimyasal madde belirli bir konsantrasyonunu içeren bir ortama maruz retina kolaylaştırır nöral retinanın ayıraçla muntazam bir dağılımı. protokolü kombine sağlarRetina, ilk madde ile muamele edilmiş, sonra elektroporasyona ve bakımı. Tedavi ve kontrol gözü aynı embriyo alınabilir ve bağımsız olarak tedavi edilebilir itibaren bireysel embriyolar arasında değişkenlik etkisi en aza indirilebilir.
Kimyasal madde tedavisi için st31 (E7) embriyo elektroporasyon ve ST20 (E3) için protokol st27 için ST20 (E3) 'ün tüm retina eksplantlar için optimize edilmiştir (E5) embriyolar. Genç retina aşamaları At / optik fincan etkin bir işlemek için çok küçük ve kırılgan olduğu ve elektroporasyon ovo büyük olasılıkla daha etkilidir. Bütün retina eksplant üzerinde electroporations st27 (E5) daha eski sahnelerinde değildi. O eski embriyolardan eksplantlar bu protokol uyarlamak mümkün muhtemeldir. Yani elde büyük küvetleri, inkübasyon için büyük kuyular ve retina kültür ortamına artan hacmi içerecektir. Ancak, E12-14 tarafından pigment epiteli ve dış segmentifotoreseptör hücreleri yakından ilişkili hale gelir ve pigment epiteli çıkarılması retinaya zarar verebilir. Retina tüm deneysel prosedür ve inkübasyon sırasında sağlam olmalıdır.
Bu diseksiyon ve kültürleme protokolü ile, retina mimari yapısal bütünlüğü hücre tipi özel markörlerin ifadesine dayalı, 24 saat boyunca aynı kalır. Belirttiğimiz gibi, eksplantlar, hücre döngüsü ilerleyişini inceledik ve retina progenitör hücrelerin interkinetic çekirdek göç işlemi normal görünüyor. Protokol yapılırsa hızla eksplant gelişimsel ilerlemesi küçük etkileri sadece vardır. Ancak, kalkınma biraz yavaşlamış olabilir ve 24 saat süreyle kültüre edilmiş bir eksplant, normal meslektaşı daha 1-2 saat genç bir gelişimsel yaş gösterebilir. Bu yaştaki normal retina eksplant karşılaştırmak için tavsiye edilir ve deneysel expl olarak kontralateral göz kullanılması tavsiye edilirkarınca kontrolü. Bu retina pigment epiteli kaldırılması dış fotoreseptör segmentleri gelişimini etkileyebilir işaret edilmelidir. Aynı zamanda bir eksplant retinanın axotomized retinal ganglion hücreleri ile yaralı bir retina temsil ettiği belirtilmelidir.
Bu protokol, basit ve bu nedenle deneysel hataları azaltır, ancak durumun ex ovo birkaç deneysel kontroller gerektirir. Tabi özel bir gelişim süreci de paralel okudu olabilir ve ovo durumda normal karşılaştırılabilir protokolü ovo bu ex kullanılarak incelenecek. Uygun deney kontroller, her zaman bu gibi maddeleri çözündürmek için kullanılan araçlar olarak, dahil edilmelidir. Sinyal geçiş yolu blokerler kullanırken, aynı işlem için birkaç farklı inhibitörlerin kullanılması çalışılan spesifik yolunun birden fazla seviyede enzimleri hedefleyen farklı inhibitörlerin kullanılması. Elektroporasyon için, GFP-ifade DNA plazmid faydalı olan bir olansa pozitif kontrol. (-) Yanlış yerleştirilmiş Plazmid herhangi bir raportör gen ekspresyonu üretmiyorsa, bunun nedeni, anot (+) ve katot edilene çok muhtemeldir. DNA plazmid daha sonra retinanın göç edecek. Yeni DNA plazmidleri test edilirken bu nedenle, bir iç kontrol olarak elektroporasyon farklı floresan proteini eksprese eden bir DNA plazmidi dahil edilmesi önerilmektedir. Bu protokol açıklanan elektroporasyon parametreleri ifade hücreleri raportör geninin yüksek sayıda üretmek için optimize edilmiştir. Gerilim ya da darbe sayısını azaltmak, yanlış negatif sonuçlara neden olabilir transfekte edilmiş hücrelerin sayısını azaltır. Bununla birlikte, gerilim ya da darbe sayısını artan doku hasarı ve artan hücre ölümüne neden olabilir. Özel yapılmış platin elektrot üç set herhangi azaltılmış kapasite göstermeden fazla iki yıl boyunca tüm electroporations için kullanılmaktadır. Elektrotlar dikkatlice temizlenir ve elektrot ile yüzeyin olmalıdıre cilalı. Ticari 4 mm kürek elektrotlar bulunmaktadır.
Bu protokol, DNA plasmidleri elektroporasyon ve bütün retinal eksplant kimyasal muamele yöneliktir. Bundan başka, böyle bir morfolino oligomerlerin kullanımı ile gen ekspresyonunun devirerek gibi diğer deney prosedürleri dahil edilmesi için protokol genişletmek mümkündür. Bütün retina eksplant prosedürü kolay, hızlı ve yüksek tekrarlanabilir bir şekilde kısa vadeli deneyler gerçekleştirmek için olasılığı için açılır. Bu maliyetler, zaman ve her bir deney için gerekli hayvan sayısını azaltır ve en önemlisi sağlam veriler elde etmek imkanı artar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1xPBS (tablet) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10x DPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 734-0006 | |
| 100 μl pipette tips | VWR | 613-0798 | |
| 1.5 ml disposable plastic cuvette | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24-well plate | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm Petri dish | VWR | 391-1998 | |
| 70% ethanol | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inhibitor III | 217714 | Calbiochem | 300 nM in 0.01% DMSO |
| Cell culture incubator | Thermo Forma | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Electrodes | Platina, custom made | ||
| Electro square porator ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 Nutrient mix | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Forceps | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Freezing medium NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| GFP expressing DNA plasmid (pZGs) | |||
| Humidified incubator | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| Mounting medium ProLong Gold with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Paraffin film | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way embedding mold | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicillin streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| PhosphoHistone 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Dilution 1/4,000 |
| Platinum electrodes (custom made from "rondelles") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Dia: 4mm, 0.1 mm thickness |
| Platimun electrodes | Sonidel | CUY700P4L | Dia: 4 mm |
| Polyethylene pasteur pipette | VWR | 612-2853 | |
| Rotator shaker | VWR | 444-2900 | |
| Small spoon | VWR | 231-2151 | |
| Sucrose | VWR | 443815S | |
| White Leghorn eggs | Local supplier | ||
| Wine cooler | WineMaster 24, Caso, Berlin Germany |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Method. 24, 43-48 (2001).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain. J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. J Vis Exp. , (2012).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina. Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).
- Tomita, K., et al. Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis. Neuro. 16, 723-734 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).
- Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors. Exp eye re. 93, 556-564 (2011).
- Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway. Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).
- Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest. Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).
- Sauer, F.
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).
