Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לנתח, ניסוי לתפעל וexplants רשתית תרבות שלם מעוברי תרנגולת. תרבויות explant הן שימושיות כאשר שיעור הצלחה גבוהה, יעילות ושחזור יש צורך לבדוק את ההשפעות של פלסמידים לelectroporation ו / או חומרים מגיב, כלומר, מעכבים האנזימטית.
Abstract
הרשתית היא מודל טוב למערכת העצבים המרכזית בפיתוח. הגודל הגדול של העין והכי חשוב הנגישות למניפולציות ניסוייות באובו / in vivo הופך את הרשתית העוברית עוף מודל ניסיוני רב-תכליתי ויעיל מאוד. למרות רשתית העוף קלה למקד באוב על ידי זריקות או electroporation התוך עיני, הריכוז היעיל ומדויק של חומרים כימיים בתוך הרשתית עלול להיות קשה לשליטה מלאה. זה יכול להיות בגלל וריאציות של האתר המדויק הזרקה, דליפה מהעין או דיפוזיה אחידה של החומרים. יתר על כן, בתדירות של מומים ותמותה לאחר מניפולציות פולשנית כגון electroporation היא גבוהה למדי.
פרוטוקול זה מתאר לשעבר אובו הטכניקה לculturing explants רשתית שלם מעוברי עוף ומספק שיטה לחשיפה מבוקרת של הרשתית לחומרים כימיים. פרוטוcol מתאר כיצד לנתח, ניסוי לתפעל, וexplants רשתית תרבות שלם מעוברי תרנגולת. Explants יכול להיות מתורבת לכ 24 שעות ויהיה נתון למניפולציות שונות כגון electroporation. היתרונות העיקריים הם כי הניסוי אינו תלוי בהישרדות של העובר וכי הריכוז של המגיב הציג יכול להיות מגוון ומבוקר על מנת לקבוע ולייעל את הריכוז האפקטיבי. יתר על כן, הטכניקה היא מהירה, זולה ויחד עם השיעור הגבוה הניסיוני שלה להצלחה, הוא מבטיח לשחזור תוצאות. יודגש כי היא משמשת כמצוינת כדי להשלים את הניסויים שבוצעו באוב.
Introduction
הרשתית היא חלק ממערכת העצבים המרכזית ואת זה הוא, בפשטותה היחסית ואדריכלות סלולרית מאופיינת היטב, דגם פופולרי לחקר התפתחות מערכת עצבים מרכזית. עינו של עובר העוף היא יחסית גדולות בהשוואה לשאר העובר. לכן נגיש בקלות באובו למניפולציות ניסיוניות, כגון זריקות או electroporation, ומשמש ככלי מצוין לצבור ידע על תאים ברשתית וביולוגיה התפתחותית בvivo. למרות יתרונות הגדולים אלה, הישרדות של העוברים יכולה להיות נמוכה כאשר ניסויים פולשניים כגון עם electroporations, זריקות חוזרות ונשנות, או מניפולציות ניסיוניות משולבות.
Electroporation של פלסמידים DNA לעובר העוף באובו הוא טכניקה חשובה ומבוססת 1. היא מאפשרת תיוג של תאי עצב, התחקות של גורל תא, כמו גם שטחים עצביים בnerv המרכזימערכת היחידות הארגוניות והיא מאפשרת לביטוי גנים מחוץ לרחם לנתח תפקוד חלבון in vivo. הטכניקה נוצלה בעבר ללימודים של צינור עצבי 2, המוח האחורי 3, ורשתית 4. יש Electroporation של רשתית עוברית באוב כמה קשיים ניסיוניים הקשורים למצב in vivo. העמדה של העין, בשל קיפול הגולגולת של העובר, קרובה יחסית ללב. קרבה זו מגדילה את הסיכון של דום לב לאחר electroporation, והסיכון עולה עם גיל העובר. יתר על כן, כדי לגשת לעין, יש צורך לפתוח את הקרומים העובריים, ובכך להגדיל את הסיכון לדימום, מומים וכדאיות מופחתים שלאחר מכן. כאשר בודקים ואופטימיזציה פלסמיד דנ"א חדש לעתים קרובות ללא תוצאה פנוטיפי ידועה, מגבלות אלה עשויות להקטין את היעילות וכוחה של השיטה אפילו בניסויים מנוסים. כפי שהוצג בפרוטוקול זה, התרבות של wexplant החור ברשתית, שהוגדר כרשתית עצבית השלמה עם אפיתל הפיגמנט הוסר, הוא שיטה יעילה המשלימה בגישת אוב.
זריקות תוך עיניות של ריאגנטים כימיים קלות יחסית לביצוע באוב. עם זאת, הריכוז היעיל ומדויק של חומרים כימיים שהוחדרו בתוך הרשתית העצבית עלול להיות קשה לשלוט באופן מלא. הנפח המוזרק עשוי להשתנות עקב דליפה ואתר הזרקה המדויק עשוי להשפיע הן על חלוקת מגיב בתוך העין ודיפוזיה דרך הגוף הזגוגי. ההשתנות תהיה השלכות משמעותיות על הפרשנות של התוצאות כאשר כלומר, עקומת תגובה למינון מעכב אנזים נקבעה; במיוחד אם ההשפעה היא קטנה והחלון הזמני של ההשפעה הוא צר. יתר על כן, רק עין אחת יכולה לשמש מכל עובר בעת ביצוע ניסויים באובו בשל השפעות מערכתיות פוטנציאליות דרך זרם הדםעל העין הנגדית. התאמת גיל היא חשובה כאשר לומדים פיתוח והשתנות בודדות בין מטופלים ועוברים בקרה עשויה להוביל לשונות ניסיוניות נוספות.
מסיבות אלה, לשעבר אוב שיטה המבוססת על explants רשתית מעוברי עוף פותח, שברשתית העצבית יכולה להיות חשופה למדים ובשליטת תנאי ניסוי במבחנה. הפרוטוקול הנוכחי פותח על בסיס פרוטוקולים קודמים 5-9. explants רשתית מבמה (רח ') 20 (ימים עובריים [E] 3) לst31 (E7) עוברי עופות נותחו, תרבותי וelectroporated עם ריכוז פלסמיד דנ"א מוגדר או שנחשפו למדיום המכיל ריכוז מוגדר של מגיב כימי. הפרוטוקול המובא כאן כבר מיושם בהצלחה בפרסומים האחרונים, באמצעות כמה ריאגנטים כימיים שונים, כולל רגולטורים של מסלול הנזק לדנ"א, כגון KU55933, SB 218,078, ומועצה לביטחון לאומי 109,555 דיטוsylate, ומחזור התא, כגון Cdk1 / 2 מעכב שלישי 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה מתבצע בהתאם להמלצות ב" המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של האגודה למחקר ברפואת עיניים וראייה ".
1. טיפול בביצה וגביית עיניים
- אחסן ביצי ליבורנו הלבנות ב12-14 מעלות צלזיוס למשך לא יותר משבוע 1. אם זמין, להשתמש במקרר יין קירור לאחסון הביצים המופרות.
הערה: טמפרטורות גבוהות חנות להוביל להתפתחות לא תקינה של עוברים, ואילו טמפרטורות נמוכות מגבירה תמותה. זמן אחסון מורחב מגדיל שני תמותה והתפתחות לא תקינה. - לדגור על הביצים ב37.5 מעלות צלזיוס ו -60% חממת ביצת humidified עם הנדנדה עדינה בתדירות של 5 פעמים בשעה 24.
- הסר את הביצים מודגרות מן חממת הביצה בגיל העוברי הרצוי.
הערה: גיל העובר העוף נקבע כזמן של דגירה והוא כונה כימים עובריים (E) או כשלבים (רח '), על פי הסדרה של שלבי התפתחות שתוארו על ידי המבורגר והמילטון 12. - מניחים את הביצים שנבחרו בזרימה למינרית. נגב את קליפת הביצה עם 70% אתנול, כדי למנוע זיהום של העובר.
הערה: ניהול כל ההליכים בתנאים אספטיים עם פתרונות סטריליhttp://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions ומכשירים. - הקש בצד של הביצה בתקיפות כנגד משטח קשה לפיצוח פתוח הביצה. הנח את התוכן בצלחת פטרי 100 מ"מ. השתמש בכפית קטנה להעביר את העובר לצלחת פטרי 35 מ"מ המכילה מראש חימם (37 ° C) 1x PBS כדי למנוע את הרקמות מייבוש.
- מניחים את 35 מ"מ צלחת פטרי המכילה את הרקמה העוברית על מיקרוסקופ לנתח stereovision משקפת בזרימה למינרית. לערוף את העובר על ידי צובט את הצוואר עם מלקחיים עדינים וזורקים את הגוף.
- שימוש במלקחיים בסדר לעשות חתך המחוספס הפה, הגחון לעין. החל באתר של חתך, קורע את הרקמות המקיפות את כל העין. לצבוט את עצב הראייה ולהסיר את העיניים בשלמות מארובת העין. לאסוף צד השמאל ועין ימין מאותו העובר לשימוש כמו גם השליטה או עין שטופלה.
- השתמש בכפית קטנה להעביר את העיניים לצלחת חדשה 35 מ"מ פטרי המכילה מראש חימם (37 ° C) 1x PBS.
2. הכנת Explants הרשתית השלמה
- שימוש במלקחיים עדינים כדי להסיר את כל הרקמה סביב העין כולל Anlage scleral.
הערה: רקמת תנתק בקלות עוזבת את הרשתית על הגוף ועדשת הזגוגית עם אפיתל הפיגמנט (1A-B איור) ללא פגע. - שימוש במלקחיים עדינים לצבוט חתך קטן לאפיתל הפיגמנט בחלק הגב של העין ללא פגיעה ברשתית העצבית (איור 1 ג).
- שימוש במלקחי קנס לקרוע בעדינות לפתוח את starti אפיתל הפיגמנטng באתר של חתך, ומשאירה את העדשה ואת כל הרשתית מחוברת לגוף הזגוגי (1D איור). שמור את העין בחם (37 מעלות צלזיוס) 1x PBS כדי להקל על הסרת האפיתל פיגמנט.
הערה: אפיתל הפיגמנט עלול להיות קשה להסרת, בפרט לאורך גוף הריסים סביב התלמיד, באזור הקדמי של העין, ולאורך הבקע דמית העין. לכן, חלק מאפיתל הפיגמנט ניתן להשאיר על הרשתית העצבית (איור 1E-F).
3. טיפול בExplants הרשתית השלמה
- Electroporation של explants רשתית השלם
הערה: Electroporation של explants רשתית השלם יכול להתבצע מייד לאחר שלב 2.- להכין מדיום תרבות המכיל 1: 1 DMEM: תערובת מזון F12, 10% FBS, 10 U / ml פניצילין סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, וL- גלוטמין 2 מ"מ.
- חותך את קובט פלסטיק חד פעמי של 1.5 מיליליטר (מ"מ 12.5 מ"מ x 12.5 x 45 מ 'מ ') (או כל מיכל קטן מסוגל להחזיק פתרון 300-400 μl) כ 8 מ"מ מהתחתית בעזרת מסור בסדר להב.
- לדלל את פלסמיד דנ"א של בחירה ב1xDPBS לריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / μl.
- הפעילו את הפרמטרים electroporator וסט 15 V לST20 - ST25 רשתית (E3-E4) ו -20 V לst26 - st27 רשתית (E5). הגדר את הדופק חוזר ל5 פולסים של 50 דופק באורך msec עם 1 מרווחי שניות. השתמש במחולל פעימות שיכולות להיות נשלט על ידי רגל דוושה על הרצפה כתהיינה צורך בשתי הידיים כדי להחזיק את האלקטרודות במקום.
- חבר (קוטר שטוח, עגול. 4 מ"מ) שתי ההנעה בצורת אלקטרודות פלטינה (איור 2 א) לשקע הפלט על מחולל את הדופק.
הערה: אלקטרודות הפלטינה שימוש בפרוטוקול זה נעשו על ידי סדנת האוניברסיטה. אלקטרודות נעשו מ" rondelles "(כיתה פלטינה: 950 Pt / 5 Cu) צלחת פלטינה 0.1 מ"מ. Wi חיבור 0.8 מ"ממחדש היה מבודד באמצעות צינורות פלסטיק. - להעביר בזהירות את כל explant הרשתית מצעד 2.3 לקובט (או מיכל קטן שווה ערך) בעזרת פיפטה פסטר פוליאתילן עם הקצה מנותק לרכוש את גודל טיפ-פתיחה הנכונה עבור explant הרשתית. הימנע משימוש בטיפי פיפטה כמו הרשתית נוטה לצרף לפלסטיק ולקרוע לגזרים.
- השתמש פיפטה 100 μl כדי להסיר בעדינות את כל 1x PBS המקיף את טיפול explant לוקח רשתית שלא לגעת ברשתית כדי למנוע את הקריעה.
- להוסיף פתרון פלסמיד 100 μl לקובט כדי לכסות את כל explant הרשתית. דחף בעדינות את explant הרשתית עם מלקחיים אם זה צף למעלה. שימוש במלקחיים או אלקטרודות למצב העדשה להתמודד עם כל צד אחד של קובט ועצב הראייה לחלק התחתון של קובט.
- מניחים את האלקטרודה החיובית מול העדשה והאלקטרודה השלילית מאחורי הרשתית (איור 2 א), בלי לגעת ברקמה.
- החל הנוכחי על ידי לחיצה הרגל על הדוושה. בדקו בועות באלקטרודות המצביעות על שחרור מוצלח.
- השתמש פיפטה 100 μl כדי להסיר את כל תערובת פלסמיד מקובט ללא פגיעה ברשתית. תערובת פלסמיד ניתן לעשות שימוש חוזר שלושה עד חמש פעמים.
- למלא את קובט עם מחומם מראש (37 ° C) 1x PBS. שימוש במלקחיים כדי לנתק עדינות explant הרשתית מהקיר של קובט. לאחר electroporation הרשתית לעתים מכוסות בבועות, מה שהופך את לדבוק בקיר של קובט.
- השתמש בפיפטה פסטר פוליאתילן להעביר את כל explant הרשתית לצלחת 24-המכילה גם (37 מעלות צלזיוס) מדיום תרבות 1 מיליליטר מחומם מראש לכל טוב. דגירה explant רשתית אחד בכל טוב.
- דגירה explant הרשתית על 37 מעלות צלזיוס על שייקר הכתף, עם מהירות קבועה של 50 סל"ד, בתוך תא חממה עם 5% CO 2 למשך 24 שעות. הסיבוב הוא להבטיח חשיפה המרבית לבינונית ולpreveהידבקות NT של הרשתית לחלק התחתון של צלחת 24 גם.
- המשך לשלב 4.
- טיפול בexplants רשתית השלם עם ריאגנטים כימיים
הערה: טיפול הכימי של explants רשתית השלם יכול להתבצע מייד לאחר שלב 2.- להכין מדיום תרבות המכיל 1: 1 DMEM: תערובת מזון F12, 10% FBS, 10 U / ml פניצילין סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, וL- גלוטמין 2 מ"מ.
- השתמש בכפית קטנה להעביר explant הרשתית מצעד 2.3 לתוך צלחת 24 גם המכילה 1 מיליליטר מראש חימם בינונית (37 מעלות צלזיוס) תרבות לכל טוב. דגירה explant רשתית אחד בכל טוב.
- דגירה explant רשתית כל במשך 60 דקות על 37 מעלות צלזיוס על שייקר הכתף, עם מהירות קבועה של 50 סל"ד, בתוך תא חממה עם 5% CO 2 לפני הוספת מגיב כימי או רכב.
- הכן את הפתרון הכימי, למשל Cdk1 / 2 מעכב III, מעכב התקדמות M-שלב 13, בגמרריכוז של 30 מיקרומטר בDMSO.
- הסר את צלחת 24 גם, המכיל את כל explant הרשתית, מן חממת התא. הוסף 10 μl של המגיב הכימי או הרכב (DMSO) ישירות למדיום הרשתית, וכתוצאה מכך ריכוז סופי של 300 ננומטר Cdk1 / 2 מעכב שלישי ב0.01% DMSO. באופן ידני לסובב את צלחת 24 גם כדי לאפשר חלוקה שווה של המגיב הכימי או רכב בפתרון.
- דגירה explants הרשתית על 37 מעלות צלזיוס על שייקר הכתף, עם מהירות קבועה של 50 סל"ד, בתוך חממה עם 5% CO 2 לזמן הרצוי (עד 24 שעות).
- המשך לשלב 4.
4. קיבוע והקפאה של כל הפריטים הרשתית Eexplants
- הסר את צלחת 24 היטב המכילה את explant רשתית כל מטופלים מן חממת התא.
- השתמש בכפית קטנה להעביר explant הרשתית לצלחת 24 גם המכילה 1 מיליליטר / גם קר כקרח paraformaldehyde 4% ב1xPBS. אינקובטוריםטה על קרח במשך 15 דקות.
- השתמש בכפית קטנה להעביר את כל explant הרשתית לצלחת 24 גם המכילה 1 מיליליטר / גם 1xPBS הקרח הקר לשטוף את הרשתית. דגירה על קרח למשך 10 דקות.
- השתמש בכפית קטנה להעביר את כל explant הרשתית לצלחת 24 גם המכילה 1 מיליליטר / גם סוכרוז 30% קרים כקרח ב1xPBS. לדגור על קרח במשך 1-3 שעות, בהתאם ליום העוברי של הרשתית. לST20 - ST25 רשתית (E3), דגירה עבור שעה 1, רשתית מבוגרת זקוק לזמן דגירה ארוך יותר בסוכרוז.
- השתמש בכפית קטנה להעביר את כל explant הרשתית על סרט פרפין המכיל הרכבה בינונית כ -500 הקפאת cryostat μl. הסר ככל סוכרוז ככל האפשר על ידי בעדינות להזיז את explant הרשתית במדיום ההקפאה באמצעות הכפית הקטנה.
- העבר את explant הרשתית לעובש הטבעה מכיל מדיום הקפאה. מקם את העיניים כדי להקל על חתך בעתיד. שים עובש ההטבעה מכיל את כל explant הרשתית על ד"רקרח y עד הבינוני קפוא מוצק. חנות ב -80 מעלות צלזיוס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מתאר את ההכנה (איור 1 א-ו) וculturing של explants רשתית השלם מעוברי תרנגולת. פרוטוקול זה שמש בהצלחה לכל explants רשתית מעוברים של ST20 (E3) לst31 (E7).
Electroporation של פלסמידים DNA לתוך explants רשתית שלם מאפשר תיוג ומעקב של תאים ברשתית או ביטוי יתר של גן מוצרים שונים. לניסויי electroporation, אפיתל הפיגמנט הוסר בזהירות מעין enucleated של ST25 עובר (E4 ½). Explant הרשתית השלם היה אז הניח בקובט מכיל את פתרון ה- DNA פלסמיד, אלקטרודות היו שקועות (איור 2 א) ונוכחיות יושם. לאחר 24 שעות של culturing, תאי GFP חיוביים היו גלויים בחלק גדול של הרשתית שלמה (איור 2). לאחר חתך, GFP + תאים בודדים זוהו בקלות לאורך ציר apico-בסיס של הרשתית (אלחוטיתאיור 2 ג). Electroporation הביא באזור רשתית גדול תופס את פלסמיד ומבטא את גן הכתב. שיעור ההצלחה, נמדד במספר הרשתית עם אזור electroporated גדול יותר 1/5 של הרשתית הכוללת, היה 75% (62 מתוך 83 רשתית) לelectroporation explant רשתית כולה, בהשוואה ל -14% (37 מתוך 263 עיניים ) בelectroporation אובו. ניסויי electroporation על explants רשתית שלם בהצלחה בוצעו על ST20 (E3) לst27 עוברים (E5).
Explants הרשתית השלם יכול להיות מתורבת לכ 24 שעות (איור 3 א 'וב'). פעמים דגירה ארוכות יותר עשויות להוביל לעיכוב התפתחותי, מומים מורפולוגיים, אפופטוזיס וסופו של דבר התפוררות של הרשתית (איור 3 ג). כאשר culturing רשתית העוף ככל explants הארכיטקטורה של הרשתית נותרה בשלמותה. זה כולל הפצה של השלבים השונים של מחזור התא לאורך apico-basציר אל. במהלך התפתחות נורמלית התאים עוברים S-שלב בצד הבסיסי, ואחריו מיטוזה בצד הפסגה של 14,15 הרשתית. סעיף מexplant רשתית שלם, בתרבית במשך 24 שעות, היה immunostained עם 3 נוגדני phospho-היסטון (PH3), תיוג תאים בG2 מאוחר / M-שלב (איור 3D). התאים החיוביים PH3 נמצאו בצד הפסגה של הרשתית, עולה בקנה אחד עם פיתוח רשתית רגיל. מורכב cyclin B1-Cdk1 פעיל בגרעין ייזום מעבר M-שלב 13. חסימת פעילות Cdk1-קינאז ימנע אירועים במורד זרם, כי הם הכרחיים להתפשטות מחזור התא למיטוזה. שלב 29 explants רשתית השלם (E6) הודגרו עם Cdk1 / 2 מונעי III ל4 שעות וimmunoreactivity PH3 נותח. Cdk1 / 2 המעכב השלישי הפחית את מספר תאי PH3 החיוביים (איור 3E), המצביע על בלוק יעיל של מעבר G2 / M-שלב. ההפחתה של מספר mitoses לאחר treatmeNT עם מעכב Cdk1 / 2 וידא שהטיפול היה יעיל.
איור 1. ההסרה של אפיתל הפיגמנט. העין 6 עוף (st29) יום עוברי הייתה גזור ומוכנה לculturing כexplant רשתית שלם. צפה () של העין הקדמית עם תלמיד ועדשה והסדק דמית העין כלפי מטה. אפיתל הפיגמנט הוא ללא פגע אבל Anlage scleral ורקמת חיבור המקיפה הוסר. צפה (ב) לחלק האחורי של העין. יציאת עצב הראייה והסדק דמית העין פונים כלפי מטה. חתך (ג) באפיתל הפיגמנט. (ד) רוב אפיתל הפיגמנט הוסר. (E) אפיתל הפיגמנט חלק נשאר בלאורך שפת הגוף והריסים ( F) הסדק דמית העין. LE: עדשה וגוף הריסים, CF:סדק דמית העין, ON: יציאת עצב ראייה. סרגל קנה מידה הוא 0.5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. Electroporation של explants רשתית כולה. () מצגת סכמטי של אלקטרודות הפלטינה ואיך הם ממוקמים משני צדי explant הרשתית השלם שהוא שקוע בפתרון פלסמיד דנ"א בקובט הקטוע. (ב) explant רשתית שלם אחרי 24 שעות של culturing, ו- (ג) מחולק רשתית. ON: יציאת עצב ראייה. סרגל קנה מידה הוא (א) 4 מ"מ, (ב) 0.5 מ"מ, (ג) 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה גדולה יותר ve rsion של נתון זה.
3. explants רשתית כל תרבית איור היה קבוע, קפוא, cryosectioned, ומסומן על ידי אימונוהיסטוכימיה. (א) explant רשתית כל st29 תרבית למשך 24 שעות. micrographs הקרינה של הכתמה גרעינית אחרי (ב) שעה 24 ו- (ג) שעות 48. (ד) נוגדן PH3 שימש לתאי תווית בG2 מאוחר / M-שלב. (E) הצפיפות היחסית (PH3 + תאים / מ"מ 2, ממוצע ± SD) וקרינה micrographs של PH3 + תאים בst29 לאחר Cdk1 / 2 מעכב III טיפול במשך 4 שעות בהשוואה לרכב. רח ': המבורגר ושלבי המילטון, מבחן t, ** p <0.01, n ≥ 4 עיניים שטופלו, 4 חלקים לכל עין, שעות: שעות. סרגל קנה מידה הוא (א) 0.5 מ"מ, (BE) 10 מיקרומטר."Target =" _ jove.com/files/ftp_upload/53202/53202fig3large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעבודה זו בפרוטוקול מפורט לנתיחה, electroporation או טיפול כימי, וculturing של explants רשתית השלם מעוברי עוף מוצג. פרוטוקול זה הוא קל, מהיר ומאפשר לשניהם שיעור הצלחה גבוה ושחזור תוצאות.
Electroporation של explants רשתית השלם מייצר שטחים גדולים של תאים המבטאים את מבנה הגן של עניין. זה קל למצב בצורה נכונה את האלקטרודות ולחשוף חלק מסוים של הרשתית לריכוז פלסמיד דנ"א מוגדר. גישה זו מאפשרת לשיטה אמינה לבדיקת תפקוד גן ברשתית עם שיעור הצלחה בדרך כלל גבוה יותר בהשוואה לelectroporations באוב. explant הרשתית השלם גם מאפשר לחשוף את הרשתית למדיום המכיל ריכוז מוגדר של מגיב כימי נותן התפלגות אחידה של המגיב ברשתית העצבית. הפרוטוקול מאפשר לשילובטיפולים בי הרשתית electroporated ראשונה ולאחר מכן טופל בחומרים. ההשפעה של שונות בין עוברי אדם עשויה להיות ממוזערת, שכן הן עין טופלה ושליטה יכולה להיות שנאספו מאותו העובר ותטופל באופן עצמאי.
עוברי הפרוטוקול כבר מותאם לexplants רשתית שלם מST20 (E3) לst27 (E5) לelectroporation וST20 (E3) לst31 עוברים (E7) לטיפול בחומר כימי. בשלבים צעירים הרשתית / כוס אופטית קטנה מדי ושביר לטפל ביעילות ובאוב electroporation הוא הכי יעיל יותר סביר. Electroporations על explants רשתית שלם לא בוצע על במות יותר מאשר st27 (E5). סביר להניח ניתן להתאים את הפרוטוקול לexplants מעוברים מבוגר. שיכלול cuvettes קבלת גדולה יותר, בארות גדולות יותר לדגירה וגידול בהיקף בינוני תרבות רשתית. עם זאת, על ידי E12-14 אפיתל הפיגמנט והקטע החיצוני שלתאי קולטי האור נקשרו באופן הדוק, וההסרה של אפיתל הפיגמנט עלולה לגרום נזק לרשתית. הרשתית צריכה להיות שלמה במהלך ההליך כולו והדגירה הניסיוניים.
עם זה לנתיחה ופרוטוקול culturing, השלמות המבנית של ארכיטקטורת הרשתית נותרה בשלמותה במהלך 24 שעות, המבוסס על הביטוי של סמני סוג תא מסוימים. כאמור, יש לנו למדנו התקדמות מחזור התא בexplants והתהליך של הגירה גרעינית interkinetic של תאי רשתית נראה נורמלי. אם הפרוטוקול מבוצע במהירות יש רק השפעה קטנה על ההתקדמות התפתחותית בexplant. עם זאת, הפיתוח עשוי להיות האטה מעט וexplant כי כבר בתרבית למשך 24 שעות עשוי להפגין גיל התפתחותי שהוא 1-2 שעות צעירות ממקבילו הרגיל. מומלץ להשוות את explant לרשתית רגילה באותו גיל ומומלץ להשתמש בעין הנגדית כExpl ניסיונישליטת נמלה. יש לציין כי הסרת האפיתל הפיגמנט ברשתית עלולה להשפיע על ההתפתחות של מגזרי קולטי האור החיצוניים. צריך גם לציין שרשתית explant מייצגת רשתית פגועה עם תאי הגנגליון ברשתית axotomized.
פרוטוקול זה הוא פשוט, ולכן מפחית את השגיאות ניסיוניות אבל לשעבר אוב המצב דורש כמה בקרות ניסיוניות. תהליך התפתחותי ספציפי שהוא נושא להיחקר באמצעות לשעבר זה אובו הפרוטוקול יכול להיות גם למד במקביל ולהיות בהשוואה לנורמלית במצב אוב. הבקרות הניסיוניות המתאימות חייבות תמיד להיות כלולות, כגון כלי רכב משומשים לsolubilize חומרים. בעת שימוש בחוסמי נתיב אות, להשתמש בכמה מעכבים שונים לאותו תהליך או להשתמש מעכבים שונים המתמקדים באנזימים יותר מרמה של המסלול הספציפי שלמד. לelectroporation, פלסמיד דנ"א להביע GFP הוא שימושיביקורת חיובית SA. אם פלסמיד כזה אינו מייצר שום ביטוי גן כתב, זה ככל הנראה בשל שהאנודה (+) והקתודה (-) ממוקמות בצורה לא נכונה. אז פלסמיד דנ"א יהגר מהרשתית. כאשר בודקים פלסמידים DNA רומן לכן מומלץ לכלול פלסמיד דנ"א שמבטא חלבון ניאון שונה כמו שליטת electroporation פנימית. הפרמטרים electroporation שתוארו בפרוטוקול זה כבר מותאם לייצור מספר גבוה של גן הכתב לבטא בתאים. הפחתת המתח או מספר הפעימות מפחיתה את מספר תאי transfected, אשר עשוי להניב תוצאות שליליות כוזבות. עם זאת, הגדלת המתח או מספר הפעימות עלולה להביא לפגיעה של הרקמות ומוות של תאי גידול. שלושה סטים של אלקטרודות פלטינה מותאמות אישית שנעשה כבר בשימוש לכל electroporations במהלך יותר משנתיים בלי להראות שום יכולת מופחתת. אלקטרודות יש לנקות היטב וsurfac אלקטרודהלהיות מלוטש דואר. אלקטרודות ההנעה 4 מ"מ מסחריות זמינות.
פרוטוקול זה מתמקד בelectroporation של פלסמידים DNA וטיפול כימי של explants רשתית כולה. אפשר להרחיב עוד יותר את הפרוטוקול זה לכלול הפרוצדורות אחרות, כגון דפיקה למטה של ביטוי גנים עם שימוש oligomers morpholino. הליך explant הרשתית השלם פותח את האפשרות לביצוע ניסויים לטווח קצר בצורה קלה, מהירה ומאוד לשחזור. זה מפחית את עלויות, זמן, ואת מספר בעלי החיים הדרושים לכל ניסוי והכי חשוב זה מגדיל את האפשרות לקבל נתונים מוצקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1xPBS (tablet) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10x DPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 734-0006 | |
| 100 μl pipette tips | VWR | 613-0798 | |
| 1.5 ml disposable plastic cuvette | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24-well plate | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm Petri dish | VWR | 391-1998 | |
| 70% ethanol | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inhibitor III | 217714 | Calbiochem | 300 nM in 0.01% DMSO |
| Cell culture incubator | Thermo Forma | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Electrodes | Platina, custom made | ||
| Electro square porator ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 Nutrient mix | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Forceps | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Freezing medium NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| GFP expressing DNA plasmid (pZGs) | |||
| Humidified incubator | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| Mounting medium ProLong Gold with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Paraffin film | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way embedding mold | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicillin streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| PhosphoHistone 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Dilution 1/4,000 |
| Platinum electrodes (custom made from "rondelles") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Dia: 4mm, 0.1 mm thickness |
| Platimun electrodes | Sonidel | CUY700P4L | Dia: 4 mm |
| Polyethylene pasteur pipette | VWR | 612-2853 | |
| Rotator shaker | VWR | 444-2900 | |
| Small spoon | VWR | 231-2151 | |
| Sucrose | VWR | 443815S | |
| White Leghorn eggs | Local supplier | ||
| Wine cooler | WineMaster 24, Caso, Berlin Germany |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Method. 24, 43-48 (2001).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain. J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. J Vis Exp. , (2012).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina. Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).
- Tomita, K., et al. Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis. Neuro. 16, 723-734 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).
- Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors. Exp eye re. 93, 556-564 (2011).
- Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway. Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).
- Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest. Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).
- Sauer, F. Mitosis in the neural tube. J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).
