Summary
Denne protokollen beskriver en metode for å dissekere, eksperimentelt manipulere og kultur hele retinal eksplantater fra kylling embryoer. Eksplantatet kulturer er nyttig når høy suksessrate, effekt og reproduserbarhet er nødvendig for å teste effekten av plasmider for elektroporering og / eller reagenvolumer stoffer, dvs. enzymatiske hemmere.
Abstract
Netthinnen er en god modell for utvikling av sentralnervesystemet. Den store størrelsen på øyet og viktigst tilgjengeligheten for eksperimentelle manipulasjoner i ovo / in vivo gjør kylling embryonale netthinnen en allsidig og svært effektiv eksperimentell modell. Selv kyllingen hinnen er lett å målrette in ovo ved intraokulære injeksjoner eller elektroporering kan den effektive og nøyaktige konsentrasjon av reagenser i netthinnen være vanskelig å fullt ut kontroll. Dette kan være på grunn av variasjoner av den eksakte injeksjonsstedet, lekkasje fra øyet eller ujevn diffusjon av stoffene. Videre er hyppigheten av misdannelser og dødelighet etter invasive manipulasjoner slik som elektroporering temmelig høy.
Denne protokollen beskriver en ex ovo teknikk for dyrking av hele retinale eksplantater fra kyllingembryoer, og tilveiebringer en fremgangsmåte for kontrollert eksponering av netthinnen til reagensene. Protocol beskriver hvordan å dissekere, eksperimentelt manipulere og kultur hele retinal eksplantater fra kylling embryoer. Explants kan dyrkes i omtrent 24 timer og bli utsatt for ulike manipulasjoner som elektroporering. De største fordeler er at eksperimentet ikke er avhengig av overlevelsen av embryoet, og at konsentrasjonen av den innførte reagens kan varieres og kontrolleres for å bestemme og optimere den effektive konsentrasjonen. Videre er rask, billig og sammen med sin høye eksperimentell suksessrate teknikken, det sikrer reproduserbar resultater. Det bør understrekes at det fungerer som et utmerket supplement til eksperimenter utført i ovo.
Introduction
Netthinnen er en del av det sentrale nervesystemet, og det er, sammen med dens relative enkelhet og veldefinert cellulær arkitektur, en populær modell for å studere sentralnervesystemet utvikling. Øyet av kylling embryo er forholdsvis stor i forhold til resten av embryoet. Det er derfor lett tilgjengelig i ovo for eksperimentelle manipulasjoner, som for eksempel injeksjoner eller elektroporering, og fungerer som et utmerket verktøy for å få kunnskap om retinal celle og utviklingsbiologi in vivo. Til tross for disse store fordeler, kan overlevelse av embryoene være lav når forsøkene er invasiv slik som med electroporations, gjentatte injeksjoner, eller kombinerte eksperimentelle manipulasjoner.
Elektroporering av DNA-plasmider inn i kyllingembryo i ovo er en viktig og veletablert teknikk 1. Det gir mulighet for merking av nevroner, sporing av cellen skjebne samt nevrale traktater i det sentrale nervOUS-systemet og det gir mulighet for ektopisk genuttrykk å analysere protein funksjon in vivo. Teknikken har vært brukt i studier av neural rør 2, bakhjerne 3, 4 og netthinnen. Electroporation av embryonale netthinnen i ovo har noen eksperimentelle problemer som er relatert til in vivo situasjon. Posisjonen til øyet, på grunn av den kraniale folding av embryoet, er relativt nær hjertet. Dette nærhet øker risikoen for hjertestans etter elektroporering, og risikoen øker med alderen på fosteret. Videre, for å få tilgang til øyet, er det nødvendig å åpne embryoniske membranene, og dermed øke risikoen for blødning, misdannelser og påfølgende redusert levedyktighet. Ved testing og optimering av en ny DNA-plasmid ofte uten kjent fenotypisk utfall, kan disse begrensninger redusere effekten og kraften av metoden, selv for en erfaren experimentalist. Som presenteres i denne protokollen, kulturen av whull retinal eksplantatet, er definert som hele nevrale netthinnen med pigment epitelet fjernet, er en effektiv metode som utfyller i ovo tilnærming.
Intraokulære injeksjoner av kjemiske reagenser er relativt enkle å utføre in ovo. Imidlertid kan den effektive og nøyaktige konsentrasjonen av injiserte reagenser i det neurale netthinnen være vanskelig å fullt ut kontrollere. Det injiserte volumet kan variere på grunn av lekkasje, og den eksakte injeksjonsstedet kan påvirke både fordelingen av reagensen i øyet og diffusjon gjennom glasslegemet. Variabiliteten vil få store konsekvenser for tolkning av resultatene når ie, er en dose-respons kurve for en enzym-inhibitor bestemmes; særlig hvis effekten er liten og den temporale vinduet av effekten er smal. Videre kan bare ett øye brukes fra hvert embryo når du utfører i ovo eksperimenter på grunn av potensielle systemiske effekter via blodetpå motsatt øye. Alder søkeord er viktig når en skal studere utvikling og individuell variasjon mellom behandlede og kontroll embryoer kan føre til ytterligere eksperimentell variabilitet.
Av disse grunner ble en ex ovo metode basert på retinale eksplantater fra kyllingembryoer utviklet, hvor det nevrale netthinnen kan utsettes for en jevn og kontrollert eksperimentell tilstand in vitro. Den nåværende protokollen ble utviklet basert på tidligere protokoller 5-9. Retinal eksplantater fra trinn (m) 20 (embryoniske dager [E] 3) til ST31 (E7) kyllingembryoer ble dissekert, dyrket og elektroporert med en definert plasmid DNA-konsentrasjon, eller utsettes for et medium som inneholder en definert konsentrasjon av en kjemisk reagens. Protokollen som presenteres her har blitt implementert i nyere publikasjoner, ved hjelp av flere forskjellige kjemiske midler, inkludert regulatorer av DNA skade veien, for eksempel KU55933, SB 218 078, og NSC 109555 ditosylate, og cellesyklus, slik som Cdk1 / 2 inhibitor III 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen er utført i samsvar med anbefalingene i "Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr i foreningen for forskning på visjon og oftalmologi".
1. Egg Håndtering og Eye samling
- Oppbevar hvite Leghorn egg ved 12-14 ° C ikke lenger enn en uke. Hvis tilgjengelig, kan du bruke en nedkjølt vin kulere å lagre befruktede egg.
Merk: Høyere lagre temperaturer føre til unormal utvikling av embryo, mens lavere temperaturer øker dødeligheten. Utvidet lagringstiden øker både dødelighet og unormal utvikling. - Inkuber eggene i en 37,5 ° C og 60% fuktet inkubator egg med forsiktig gynging ved en frekvens på 5 ganger pr 24 timer.
- Fjern de ruges eggene fra egg inkubator ved ønsket embryonale alder.
Merk: I en alder av kylling embryo bestemmes som inkubasjonstiden og betegnes som embryonale dager (E) eller som stadier (st), I henhold til den serie av utviklingsstadier som er beskrevet av Hamburger og Hamilton 12. - Plasser de valgte egg i laminær hette. Tørk av eggeskallet med 70% etanol for å unngå forurensning av embryo.
Merk: Gjennomføre alle prosedyrer under aseptiske forhold med sterile løsningerhttp://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions og instrumenter. - Trykk på siden av egg hardt mot en hard overflate for å knekke åpen egget. Plassere innholdet i en 100 mm petriskål. Bruk en liten skje for å overføre embryo til en 35 mm petriskål inneholdende forvarmet (37 ° C) 1 x PBS for å hindre at vev fra tørking.
- Plasser 35 mm petriskål inneholder embryonale vev på en kikkert Stereo disseksjonsmikroskop i laminær hette. Halshogge embryo ved å klemme halsen med fin pinsett og kast kroppen.
- Bruk fine tang for å lage et snitt thgrov munnen, ventral for øyet. Starter på stedet av snittet, rive opp vevet rundt hele øyet. Knip av synsnerven og fjerne den intakte øyet fra øyehulen. Samle både venstre og høyre øye fra samme embryo for anvendelse som enten kontroll eller det behandlede øyet.
- Bruk en liten skje for å overføre øynene til en ny 35 mm petriskål inneholdende forvarmet (37 ° C) 1 x PBS.
2. Utarbeidelse av Whole Retinal eksplantater
- Bruk fine tang for å fjerne alle vev rundt øyet, inkludert skleral anlage.
Merk: Vevet vil løsne lett forlater netthinnen på glasslegemet og linsen med pigment epitel intakt (figur 1A-B). - Bruk fine tang for å klemme et lite snitt inn i pigment epitelet på den dorsale delen av øyet uten å skade det neurale netthinnen (figur 1C).
- Bruk fin pinsett for å forsiktig rive åpne pigment epitel starting på stedet av snittet, slik at objektivet og hele retina festet til glasslegemet (figur 1D). Hold øyet i varmt (37 ° C) 1 x PBS for å lette fjerning av pigmentet epitel.
Merk: pigment-epitel kan være vanskelig å fjerne, særlig langs strålelegeme rundt pupillen, i den fremre delen av øyet, og langs choroid fissur. Derfor kan en del av pigment epitelet bli liggende på nevrale netthinnen (figur 1E-F).
3. Behandling av Whole Retinal eksplantater
- Electroporation av hele netthinnens eksplantater
Merk: Electroporation av hele netthinnens eksplantater kan utføres direkte etter trinn to.- Forbered dyrkningsmedium inneholdende 1: 1 DMEM: F12 Nutrient blanding, 10% FBS, 10 U / ml penicillin streptomycin, 5 ug / ml insulin, og 2 mM L-glutamin.
- Klipp av en 1,5 ml engangs plastkuvette (12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm) (eller en hvilken som helst liten beholder som kan holde 300-400 mL løsning) omtrent 8 mm fra bunnen ved hjelp av en fin bladet sag.
- Fortynn plasmid DNA av valget i 1xDPBS til en endelig konsentrasjon på 0,1 ug / ul.
- Slå på electroporator og innstilte parametere til 15 V for ST20 - ST25 (E3-E4) hinnen og 20 V for st26 - st27 (E5) hinnen. Still inn puls-gjentakelser til 5 pulser av 50 msek puls-lengde med 1 sek mellomrom. Bruk en pulsgenerator som kan styres av en fot-pedal på gulvet som begge hender vil være nødvendig for å holde elektrodene på plass.
- Koble til to paddle formet (flat, sirkulær diam. 4 mm) platinaelektroder (Figur 2A) til utgangskontakten på pulsgeneratoren.
Merk: platinaelektroder som brukes i denne protokollen ble gjort ved universitetet verksted. Elektrodene ble laget av 0,1 mm platinaplate "rondelles" (platina karakter: 950 Pt / 5 Cu). Forbindelses 0,8 mm wire ble isolert ved hjelp av plastrør. - Overføre nøye hele retinal explant fra trinn 2,3 til kyvetten (eller tilsvarende liten beholder) med en polyetylen Pasteur pipette med avskåret å erverve rett tip-åpning størrelse for retinal eksplantering spissen. Unngå å bruke pipettespisser som netthinnen har en tendens til å feste seg til plasten og rive fra hverandre.
- Bruk en 100 mL pipette til å forsiktig fjerne hele 1x PBS rundt retinal explant tar seg ikke å røre netthinnen for å unngå å rive.
- Tilsett 100 ul plasmid løsning til kuvetten for å dekke hele retinal eksplantat. Trykk forsiktig ned retinal explant med tang hvis det flyter til toppen. Bruk pinsett eller elektroder for å plassere linsen for å møte noen en side av kyvetten og den optiske nerven til bunnen av kyvetten.
- Plassere den positive elektrode i foran linsen og den negative elektrode bak netthinnen (figur 2A), uten å berøre vev.
- Bruke gjeldende ved å trykke ned foten-pedal. Se etter bobler på elektrodene som indikerer vellykket utflod.
- Bruk en 100 ul pipette for å fjerne all plasmidet blanding fra kyvetten uten å skade netthinnen. Plasmidet blandingen kan brukes på nytt tre til fem ganger.
- Fyll opp kyvetten med forvarmet (37 ° C) 1 x PBS. Bruk pinsett ved forsiktig løsne retinal eksplantat fra veggen av kyvetten. Etter elektroporering netthinnen er ofte dekket med bobler, som gjør det holder seg til veggen av kyvetten.
- Bruk polyetylen Pasteur pipette for å overføre hele retinal eksplantatet inn i en 24-brønners plate inneholdende 1 ml forvarmet (37 ° C) kulturmedium per brønn. Inkuber én retinal eksplantat per brønn.
- Inkuber retinal eksplantatet ved 37 ° C på en rotator shaker, med en konstant hastighet på 50 rpm, i en celle inkubator med 5% CO2 i 24 timer. Rotasjonen er å sikre maksimal eksponering til mediet, og for å prevent adhesjon av netthinnen til bunnen av den 24-brønns plate.
- Gå videre til trinn 4.
- Behandling av hele netthinnens eksplantater med kjemiske midler
Merk: Kjemisk behandling av hele netthinnens eksplantater kan utføres direkte etter trinn to.- Forbered dyrkningsmedium inneholdende 1: 1 DMEM: F12 Nutrient blanding, 10% FBS, 10 U / ml penicillin streptomycin, 5 ug / ml insulin, og 2 mM L-glutamin.
- Bruk en liten skje for å overføre retinal eksplantat fra trinn 2,3 i en 24-brønners plate inneholdende 1 ml forvarmet (37 ° C) kulturmedium per brønn. Inkuber én retinal eksplantat per brønn.
- Inkuber hele retinal eksplantatet i 60 minutter ved 37 ° C på en rotator shaker, med en konstant hastighet på 50 rpm, i en celle inkubator med 5% CO2 før tilsetning av et kjemisk reagens eller kjøretøy.
- Klargjør kjemisk løsning, for eksempel Cdk1 / 2 III-hemmer, en hemmer av M-fase progresjon 13, til en endeligkonsentrasjon på 30 uM i DMSO.
- Fjern 24-brønners plate inneholdende hele retinal eksplantatet, fra cellen inkubatoren. Tilsett 10 pl av kjemisk reagens eller bærer (DMSO) direkte til retinal medium, noe som resulterer i en sluttkonsentrasjon på 300 nM Cdk1 / 2 inhibitor III i 0,01% DMSO. Manuelt rotere den 24-brønners plate for å tillate jevn fordeling av det kjemiske reagens eller kjøretøy i løsningen.
- Inkuber de retinale eksplantater ved 37 ° C på en rotator shaker, med en konstant hastighet på 50 opm, inne i en inkubator med 5% CO2 i ønsket tid (opp til 24 timer).
- Gå videre til trinn 4.
4. Fiksering og Frysing av Whole Netthinne Eexplants
- Fjern 24-brønners plate inneholdende det behandlede hele retinal eksplantat fra cellen inkubatoren.
- Bruk en liten skje for å overføre retinal eksplantatet til en 24-brønners plate inneholdende 1 ml / brønn iskaldt 4% paraformaldehyd i 1 x PBS. Incubate på is i 15 min.
- Bruk en liten skje for å overføre hele retinal eksplantatet til en 24-brønners plate inneholdende 1 ml / brønn iskald 1 x PBS for å vaske netthinnen. Inkuber på is i 10 min.
- Bruk en liten skje for å overføre hele retinal eksplantatet til en 24-brønners plate inneholdende 1 ml / brønn iskald 30% sukrose i 1XPBS. Inkuber på is i 1-3 timer avhengig av embryodag av netthinnen. For ST20 - ST25 (E3) netthinne, inkuberes i 1 time, eldre netthinne trenger lengre inkubasjonstid i sukrose.
- Bruk en liten skje for å overføre hele retinal eksplantatet på en parafinfilm inneholdende omtrent 500 ul kryostat frysemonteringsmedium. Fjerne så mye som mulig for sukrose ved forsiktig å bevege retinal eksplantatet i frysemediet ved hjelp av liten skje.
- Overføre retinal eksplantering til en embedding mold inneholder frysemedium. Plasser øyet til rette for fremtidig seksjonering. Sett embedding mold som inneholder hele retinal eksplantat på dry is inntil mediet er frosset fast. Oppbevar ved -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen beskriver fremstillingen (figur 1 A-F) og dyrking av hele retinale eksplantater fra kyllingembryoer. Denne protokollen har blitt brukt for hele netthinnens eksplantater fra embryoer av ST20 (E3) til ST31 (E7).
Electroporation av DNA plasmider i hele netthinnens eksplantater åpner for merking og sporing av netthinnens stamceller eller over-uttrykk for ulike genprodukter. For electroporation forsøk ble pigmentet epitel forsiktig fjernet fra enucleated øyet av en ST25 (E4 ½) embryo. Hele retinal eksplantatet ble deretter plassert i en kuvette inneholdende DNA-plasmid-løsning, ble elektrodene neddykket (figur 2A) og en strøm ble påført. Etter 24 timer av dyrkingen, GFP-positive celler var synlig i en stor del av det intakte hinnen (figur 2B). Etter seksjonering ble enkelt GFP + celler lett oppdages langs apico-basal aksen av netthinnen (Figur 2C). Elektroporering resultert i et stort område retinal tar opp plasmidet og som uttrykker reportergenet. Suksessraten, målt ved antallet netthinner med et elektroporert område som er større enn 1/5 av den totale netthinnen, var 75% (62 av 83 netthinner) for hel retinal explant elektroporering, sammenlignet med 14% (37 av 263 øyne ) for i ovo electroporation. Electroporation eksperimenter på hele netthinnens eksplantater har med hell blitt utført på ST20 (E3) til st27 (E5) embryoer.
Hele retinal eksplantater kan være dyrket i ca 24 timer (figur 3A og B). Lengre inkubasjonstider kan føre til forsinket utvikling, morfologiske misdannelser, apoptose og til slutt oppløsningen av netthinnen (Figur 3C). Når dyrking kylling netthinne som hele eksplantater arkitekturen av netthinnen er intakt. Dette gjelder fordelingen av de forskjellige fasene av cellesyklusen langs apico-basal aksen. Under normal utvikling cellene gjennomgår S-fasen på den basale side, etterfulgt av mitose på den apikale side av netthinnen 14,15. En del fra en hel retinal explant, dyrket i 24 timer ble immunostained med en Phospho-Histone 3 (PH3) antistoff, merking celler i slutten av G2 / M-fase (Figur 3D). De PH3 positive celler ble funnet på den apikale siden av retina, i samsvar med normal retinal utvikling. En aktiv cyklin B1-Cdk1 kompleks i kjernen vil initiere M-faseovergangen 13. Blokkering av Cdk1-kinase-aktivitet vil inhibere nedstrømshendelser som er nødvendige for cellesyklus forplantning inn i mitose. Stage 29 (E6) hele netthinnens eksplantater ble inkubert med Cdk1 / 2 Inhibitor III for 4 timer og PH3 immunoreaktivitets ble analysert. Den Cdk1 / 2 inhibitor III redusert antall PH3 positive celler (figur 3E), noe som indikerer en effektiv blokk av G2 / M-fase-overgang. Reduksjonen av antall mitoser etter renseanleggnt med Cdk1 / 2 inhibitor bekreftet at behandlingen var effektiv.
Figur 1. Fjerning av pigment epitel. En embryonale dag 6 (st29) kylling øyet ble dissekert og klargjort for dyrking som helhet retinal eksplantering. (A) Utsikt av fremre øye med eleven og linse og årehinnen sprekken vendt ned. Pigment epitelet er intakt, men den scleral anlage og omkringliggende bindevev er fjernet. (B) Utsikt over den bakre delen av øyet. Synsnerven exit og årehinnen sprekken er vendt ned. (C) innsnitt i pigment epitel. (D) De fleste av pigmentet epitel er fjernet. (E) Noen pigment epitel er igjen langs kanten av strålelegeme og ( F) årehinnen fissur. LE: linse og ciliarkropp, CF:årehinnen sprekken, ON: synsnerven exit. Scale bar er 0,5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Elektroporering av hele retinale eksplantater. (A) Skjematisk presentasjon av platinaelektroder, og hvor de er plassert på hver side av det hele retinal eksplantatet som er nedsenket i plasmid DNA-oppløsning i den avkortede kyvette. (B) Hele retinal eksplantat etter 24 h dyrking, og (C) seksjonert retina. PÅ: synsnerven exit. Scale bar er (A) 4 mm, (B) 0,5 mm, (C) 50 mikrometer. Klikk her for å se et større ve rsion av dette tallet.
Figur 3. Dyrkede hele netthinnens eksplantater var fikset, frosset, cryosectioned, og merket av immunhistokjemi. (A) En st29 hele retinal eksplantat kultivert i 24 timer. Fluorescens mikrografer av nukleær farging etter (B) 24 t, og (C) 48 t. (D) En PH3 antistoff ble brukt til å merke celler i slutten av G2 / M-fasen. (E) Den relative tetthet (PH3 + celler / mm 2, gjennomsnitt ± SD) og fluorescens mikroskopi av pH 3 + celler på st29 etter Cdk1 / 2-hemmer III behandling i 4 timer i forhold til kjøretøyet. st: Hamburger og Hamilton etapper, t-test, ** p <0,01, n ≥ 4 behandlet øyne, 4 seksjoner per øye, h: timer. Scale bar er (A) 0,5 mm, (BE) 10 mikrometer.jove.com/files/ftp_upload/53202/53202fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette arbeidet et detaljert protokoll for disseksjon, elektroporering eller kjemisk behandling, og dyrking av hele retinale eksplantater fra kyllingembryoer er presentert. Denne protokollen er enkelt, raskt og gir rom for både en høy suksessrate og reproduserbar resultater.
Electroporation av hele netthinnens eksplantater produserer store deler av celler som uttrykker genkonstruksjonen av interesse. Det er lett for korrekt posisjonering av elektrodene, og for å eksponere en bestemt del av netthinnen til et definert DNA-plasmid konsentrasjon. Denne fremgangsmåten gjør det mulig for en pålitelig metode for å undersøke genfunksjon i netthinnen med en typisk høyere suksessrate i forhold til electroporations i ovo. Hele retinal eksplantat gjør det også mulig å utsette netthinnen til et medium som inneholder en definert konsentrasjon av et kjemisk reagens som gir en jevn fordeling av reagensen i det nevrale netthinnen. Protokollen muliggjør kombinertbehandlinger hvor netthinnen blir først elektroporerte og deretter behandlet med stoffer. Innvirkningen av variasjon mellom individuelle embryoene kan bli minimalisert, siden både de behandlede og kontroll øye kan hentes fra den samme embryo og behandles uavhengig av hverandre.
Protokollen har blitt optimalisert for hele netthinnens eksplantater fra ST20 (E3) til st27 (E5) embryoer for elektroporering og ST20 (E3) til ST31 (E7) embryoer for kjemisk stoff behandling. At yngre stadier netthinnen / optikk cup er for liten og skjør til å effektivt håndtere og i ovo electroporation er mest sannsynlig mer effektiv. Electroporations på hele netthinnens eksplantater ble ikke utført på scener som er eldre enn st27 (E5). Det er sannsynlig mulig å tilpasse denne protokollen til eksplantater fra eldre embryoer. Som vil inkludere skaffe større kyvetter, større brønner for inkubasjon og økt volum av retinal kulturmedium. Men ved E12-14 pigment epitelet og den ytre delen avfotoreseptorcellene blir tett forbundet, og fjerning av pigment-epitel kan skade netthinnen. Netthinnen bør være intakt under hele forsøksprosedyren og inkubasjon.
Med denne disseksjon og dyrking protokollen, den strukturelle integriteten av retinal arkitekturen forblir intakt under 24 timer, basert på ekspresjonen av celletypespesifikke markører. Som nevnt, har vi studert cellesyklusprogresjon i eksplantater og prosessen med interkinetic atom migrering av retinale progenitorceller ser normalt. Hvis protokoll utføres raskt det er bare små virkninger på utviklings progresjon i eksplantatet. Imidlertid kan utviklingen være litt retarderes og et eksplantat som er blitt dyrket i 24 timer kan oppvise en utviklings alder som er 1-2 timer yngre enn den vanlige motpart. Det anbefales å sammenligne eksplantatet til alder-matchet normal netthinnen og det anbefales å bruke kontralaterale øyet som en eksperimentell eksplmaur kontroll. Det bør understrekes at fjernelse av retinal pigment-epitel kan påvirke utviklingen av de ytre segmentene fotoreseptoren. Det bør også påpekes at en eksplantat hinnen representerer en skadet netthinnen med axotomized retinal ganglion celler.
Denne protokollen er enkel og derfor reduserer eksperimentelle feil, men ex ovo situasjonen krever flere eksperimentelle kontroller. Spesifikk utviklings prosess som er underlagt bli studert ved hjelp av denne ex ovo-protokollen kan også studeres parallelt og sammenlignes med normal i ovo situasjon. De aktuelle forsøks kontrollene må alltid være inkludert, slik som kjøretøyer som brukes for å oppløse stoffene. Ved bruk av signal pathway blokkere, bruker flere forskjellige hemmere for den samme prosessen eller bruke ulike hemmere som er rettet mot enzymer på mer enn ett nivå med den spesifikke bane som er studert. For elektroporering, er en GFP-uttrykkende DNA-plasmid et nyttigsa positiv kontroll. Hvis en slik plasmid ikke produserer noen reporter genuttrykk, er det mest sannsynlig på grunn av at anoden (+) og katoden (-) er ikke korrekt. DNA-plasmidet blir deretter vandrer bort fra netthinnen. Når du skal teste nye DNA plasmider det anbefales derfor å inkludere en DNA plasmid som uttrykker en annen fluorescerende protein som en intern elektroporering kontroll. Electroporation parametrene som er beskrevet i denne protokollen er optimert for å produsere et høyt antall reportergen uttrykkende celler. Reduksjon av spenning eller antallet pulser reduserer antallet transfekterte celler, noe som kan gi falske negative resultater. En økning av spenningen eller det antall pulser som kan føre til skade på vev og øket celledød. Tre sett med skreddersydde platinaelektroder har blitt brukt i alle electroporations i mer enn to år uten å vise noen redusert kapasitet. Elektrodene må rengjøres grundig og elektroden surface poleres. Kommersielle 4 mm padle elektroder er tilgjengelige.
Denne protokollen fokuserer på elektroporering av DNA plasmider og kjemisk behandling av hele retinal eksplantater. Det er mulig å utvide denne protokollen for å inkludere andre eksperimentelle prosedyrer, for eksempel et knock-down av genekspresjon ved anvendelse av morfolino oligomerer. Hele retinal eksplantat prosedyren åpner opp for muligheten til å utføre kortvarige forsøk på en enkel, rask og reproduserbar måte. Det reduserer kostnader, tid og antall dyr som trengs for hvert forsøk og viktigst det øker muligheten for å få solide data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1xPBS (tablet) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10x DPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 734-0006 | |
| 100 μl pipette tips | VWR | 613-0798 | |
| 1.5 ml disposable plastic cuvette | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24-well plate | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm Petri dish | VWR | 391-1998 | |
| 70% ethanol | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inhibitor III | 217714 | Calbiochem | 300 nM in 0.01% DMSO |
| Cell culture incubator | Thermo Forma | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Electrodes | Platina, custom made | ||
| Electro square porator ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 Nutrient mix | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Forceps | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Freezing medium NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| GFP expressing DNA plasmid (pZGs) | |||
| Humidified incubator | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| Mounting medium ProLong Gold with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Paraffin film | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way embedding mold | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicillin streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| PhosphoHistone 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Dilution 1/4,000 |
| Platinum electrodes (custom made from "rondelles") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Dia: 4mm, 0.1 mm thickness |
| Platimun electrodes | Sonidel | CUY700P4L | Dia: 4 mm |
| Polyethylene pasteur pipette | VWR | 612-2853 | |
| Rotator shaker | VWR | 444-2900 | |
| Small spoon | VWR | 231-2151 | |
| Sucrose | VWR | 443815S | |
| White Leghorn eggs | Local supplier | ||
| Wine cooler | WineMaster 24, Caso, Berlin Germany |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Method. 24, 43-48 (2001).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain. J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. J Vis Exp. , (2012).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina. Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).
- Tomita, K., et al. Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis. Neuro. 16, 723-734 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).
- Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors. Exp eye re. 93, 556-564 (2011).
- Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway. Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).
- Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest. Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).
- Sauer, F. Mitosis in the neural tube. J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).
