Summary
Denne protokol beskriver en metode til at dissekere, eksperimentelt manipulere og kultur hele retinale eksplantater fra kylling embryoner. De eksplantatkulturer er nyttige, når høj succesrate, effektivitet og reproducerbarhed er nødvendige for at afprøve virkningerne af plasmider til elektroporering og / eller reagens stoffer, dvs. enzymatiske inhibitorer.
Abstract
Nethinden er en god model for udvikling af centralnervesystemet. Den store størrelse af øjet og vigtigst tilgængeligheden for eksperimentelle manipulationer i ovo / in vivo gør kyllingeembryoniske retina en alsidig og meget effektiv eksperimentel model. Selvom kyllingeretina er let at målrette in ovo ved intraokulær injektion eller elektroporation, kan den effektive og nøjagtige koncentration af reagenserne i nethinden være vanskeligt at fuldt kontrol. Dette kan skyldes variationer i stedet nøjagtige injektion, lækage fra øjet eller ujævn diffusion af stoffer. Endvidere hyppigheden af misdannelser og dødelighed efter invasive manipulationer såsom elektroporering er temmelig høj.
Denne protokol beskriver en ex ovo teknik til dyrkning af retinale hele eksplantater fra kyllingefostre og tilvejebringer en fremgangsmåde til kontrolleret eksponering af nethinden til reagenser. Protocol beskriver, hvordan at dissekere, eksperimentelt manipulere og kultur hele retinale eksplantater fra kylling embryoner. Eksplantaterne kan dyrkes i ca. 24 timer og underkastes forskellige manipulationer, såsom elektroporering. De vigtigste fordele er, at forsøget ikke er afhængig af overlevelsen af embryoet og at koncentrationen af det indførte reagens kan varieres og styres med henblik på at bestemme og optimere den effektive koncentration. Endvidere teknikken er hurtig, billig og sammen med dets høje eksperimentelle succesrate, sikrer reproducerbar resultater. Det skal understreges, at det tjener som et fremragende supplement til eksperimenter udført in ovo.
Introduction
Nethinden er en del af det centrale nervesystem og det er, med dens relative enkelhed og velkarakteriseret cellearkitektur, en populær model til undersøgelse af centralnervesystemet udvikling. Øjet kyllingefosteret er forholdsvis stor i forhold til resten af embryoet. Det er derfor let tilgængelig i ovo til forsøg manipulationer, såsom injektioner eller elektroporation, og tjener som et udmærket redskab til at få viden om retinal celle og udviklingsmæssige biologi in vivo. På trods af disse store fordele, kan overlevelsen af embryonerne være lav, når forsøgene er invasiv såsom med elektroporeringer, gentagne injektioner, eller kombinerede eksperimentelle manipulationer.
Elektroporering af DNA-plasmider i kyllingefosteret in ovo er en vigtig og veletableret teknik 1. Det giver mulighed for mærkning af neuroner, opsporing af celleskæbnen samt neuronale skrifter i den centrale Nervskellige, og det giver mulighed for ektopisk genekspression at analysere protein funktion in vivo. Teknikken har været anvendt til undersøgelser af neuralrøret 2, baghjerne 3 og 4 retina. Elektroporering af embryoniske retina in ovo har nogle eksperimentelle vanskeligheder, der er relateret til in vivo situationen. Positionen af øjet, på grund af den kraniale foldning af embryo, er relativt tæt på hjertet. Denne nærhed øger risikoen for hjertestop efter elektroporation, og risikoen stiger med alderen embryoet. Desuden at få adgang til øjet, er det nødvendigt at åbne embryonale membraner, hvilket øger risikoen for blødning, misdannelser og efterfølgende reduceret levedygtighed. Ved prøvning og optimere en ny DNA-plasmid ofte uden en kendt fænotypisk resultat, kan disse begrænsninger nedsætte effekten og effekt af fremgangsmåden selv for en erfaren eksperimentator. Som fremlagt i denne protokol, kulturen i whul retinal eksplantat, defineret som hele neurale nethinde med pigmentepithelet fjernet, er en effektiv metode, der supplerer in ovo metode.
Intraokulære injektioner af kemiske reagenser er forholdsvis let at udføre in ovo. Den effektive og nøjagtige koncentration af injicerede reagenser inden for neurale nethinde, kan imidlertid være vanskeligt at fuldt ud at kontrollere. Den injicerede volumen kan variere som følge af lækage og nøjagtige injektionsstedet kan påvirke både fordelingen af reagenset i øjet og diffusion gennem glaslegemet. Variabiliteten vil få store konsekvenser for fortolkningen af resultaterne, når dvs. en dosisresponskurve for et enzym-inhibitor bestemmes; især hvis virkningen er lille og tidsvindue af effekten er smal. Desuden kan kun et enkelt øje anvendes fra hver embryo ved udførelse in ovo forsøg på grund af potentielle systemiske effekter via blodstrømmenpå kontralaterale øje. Alder matching er vigtigt, når man studerer udvikling og individuel variation mellem behandlede og kontrol embryoer kan føre til yderligere eksperimentel variabilitet.
Af disse årsager blev en ex ovo metode baseret på retinale eksplantater fra kyllingembryoer udviklet, hvor neurale nethinde kan udsættes for en ensartet og kontrolleret forsøgsbetingelse in vitro. Denne protokol blev udviklet baseret på tidligere protokoller 5-9. Retinale eksplantater fra trin (st) 20 (embryonale dage [E] 3) til ST31 (E7) kyllingembryoer blev dissekeret, dyrket og elektroporeret med en defineret DNA-plasmid koncentration eller udsat for et medium indeholdende en defineret koncentration af en kemisk reagens. Protokollen præsenteres her er gennemført med succes i de seneste publikationer, ved hjælp af flere forskellige kemiske reagenser, herunder regulatorer af DNA-skader vej, såsom KU55933, SB 218078, og NSC 109555 ditosylate, og cellecyklus, såsom Cdk1 / 2-inhibitor III 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol er udført i overensstemmelse med anbefalingerne i "Vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr i Foreningen for forskning i et syn og oftalmologi".
1. Æg Håndtering og Eye kollektion
- Opbevar hvide Leghorn æg ved 12-14 ° C i højst 1 uge. Hvis det er tilgængeligt, skal du bruge en nedkølet vinkøler at gemme befrugtede æg.
Bemærk: Højere butik temperaturer fører til unormal udvikling af embryoner, mens lavere temperaturer øger dødeligheden. Udvidet opbevaringstid øger både dødelighed og unormal udvikling. - Inkubér æg i en 37,5 ° C og 60% befugtet inkubator æg under forsigtig vipning ved en frekvens på 5 gange per 24 timer.
- Fjern de rugede æg fra ægget inkubator ved den ønskede embryonale alder.
Bemærk: Alderen på kyllingen embryo bestemmes som inkubationstiden og betegnes som embryonale dage (E) eller som stadier (st), Ifølge række udviklingsstadier beskrevet af Hamburger og Hamilton 12. - Placer de valgte æg i laminær strømning. Tør æggeskallen med 70% ethanol for at undgå forurening af embryoet.
Bemærk: Udfør alle procedurer under aseptiske betingelser med sterile opløsningerhttp://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions og instrumenter. - Tryk på siden af ægget fast mod en hård overflade for at knække åbne ægget. Anbring indholdet i en 100 mm petriskål. Brug en lille ske at overføre fosteret til en 35 mm petriskål indeholdende foropvarmet (37 ° C) 1x PBS for at forhindre væv fra tørring.
- Placer 35 mm petriskål indeholdende det embryonale væv på en kikkert stereovision dissektionsmikroskop i laminar flow hætte. Halshugge fosteret ved at knibe halsen med fine pincet og kassér kroppen.
- Brug fine pincet til at gøre et snit thru munden, ventral for øjet. Begyndende på det sted, indsnit, oprive vævet, der omgiver hele øjet. Afklemme synsnerven og fjern den intakte øjne fra øjenhulen. Saml både venstre og højre øje fra den samme embryo til anvendelse som enten kontrollen eller det behandlede øje.
- Brug en lille ske at overføre øjnene til en ny 35 mm petriskål indeholdende foropvarmet (37 ° C) 1 x PBS.
2. Udarbejdelse af Whole Retinale Eksplantater
- Brug fine tænger til at fjerne alle væv omkring øjet herunder sclera Anlage.
Bemærk: Vævet let at fjerne forlader nethinden på glaslegemet og linsen med pigmentepithelet intakt (figur 1A-B). - Brug fine tænger at klemme et lille snit i pigmentepithelet på den dorsale del af øjet uden at beskadige den neurale retina (figur 1C).
- Brug fine pincet til forsigtigt at rive åbne pigment epitel starting på stedet for snittet, hvorefter linsen og hele nethinden knyttet til glaslegemet (figur 1D). Hold øjet i varmt (37 ° C) 1x PBS for at lette fjernelsen af pigmentet epitel.
Bemærk: pigmentepithelet kan være vanskeligt at fjerne, navnlig langs det ciliære legeme rundt om pupillen, i den forreste region af øjet, og langs årehinden fissur. Derfor kan nogle af pigmentepithelet efterlades på neurale nethinde (Figur 1E-F).
3. Behandling af Whole Retinale Eksplantater
- Elektroporering af hele retina eksplantater
Bemærk: Elektroporation af hele retina eksplantater kan udføres direkte efter trin 2.- Forbered dyrkningsmedium indeholdende 1: 1 DMEM: F12 Nutrient mix, 10% FBS, 10 U / ml penicillin streptomycin, 5 ug / ml insulin og 2 mM L-glutamin.
- Skær en 1,5 ml engangs plastik kuvette (12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm) (eller en lille beholder kan rumme 300-400 pi opløsning) ca. 8 mm fra bunden med en fin-bladet sav.
- Fortynd DNA-plasmid valg i 1xDPBS til en endelig koncentration på 0,1 pg / pl.
- Tænd elektroporator og indstillede parametre til 15 V for ST20 - ST25 (E3-E4) nethinde og 20 V for ST26 - ST27 (E5) nethinden. Indstil puls-gentagelser til 5 pulser af 50 msek puls længde med 1 sek intervaller. Brug en impulsgenerator, der kan styres af en mund- pedal på gulvet, som begge hænder vil blive nødvendig for at holde elektroderne på plads.
- Tilslut to padle formet (flad, cirkulær diam. 4 mm) platinelektroder (figur 2A) til output-stikket på pulsen generatoren.
Bemærk: De platinelektroder anvendt i denne protokol, blev foretaget af universitetet værksted. Elektroderne blev fremstillet ud fra 0,1 mm platinplade "rondelles" (platin karakter: 950 Pt / 5 Cu). Forbindelseselementet 0,8 mm wire blev isoleret ved hjælp af plastrør. - Overføre forsigtigt hele retinal eksplantat fra trin 2.3 til kuvetten (eller tilsvarende lille beholder) med en polyethylen Pasteur-pipette med spidsen skåret af til at erhverve den rigtige tip-åbningsstørrelse for retinal eksplantation. Undgå at bruge pipettespidser som nethinden har tendens til at knytte til plast og rive fra hinanden.
- Brug en 100 pi pipette til forsigtigt fjerne hele 1x PBS omkring nethinden eksplantatet Pas på ikke at røre nethinden for at undgå at rive.
- Tilsæt 100 pi plasmidopløsning til kuvetten for at dække hele retinal eksplantation. Skub forsigtigt ned retinale eksplantation med pincet, hvis det flyder til toppen. Brug pincet eller elektroder til at placere linsen til at imødegå enhver ene side af kuvetten og synsnerven til bunden af kuvetten.
- Placer den positive elektrode foran linsen og den negative elektrode bag nethinden (figur 2A), uden at berøre vævet.
- Påfør den nuværende ved at trykke ned mund- pedal. Check for bobler på elektroderne indikerer vellykket decharge.
- Brug en 100 pi pipette til at fjerne alle plasmidet mix fra kuvetten uden at beskadige nethinden. Plasmidet blanding kan genbruges tre til fem gange.
- Fyld kuvetten med foropvarmet (37 ° C) 1 x PBS. Brug pincet til forsigtigt frigøre retinal eksplantat fra væggen af kuvetten. Efter elektroporation nethinden er eventuelt dækket med bobler, hvilket gør det klæbe til væggen af kuvetten.
- Brug polyethylen Pasteur pipette til at overføre hele retinal eksplantatet i en plade med 24 brønde indeholdende 1 ml foropvarmet (37 ° C) dyrkningsmedium per brønd. Inkuber en retinal eksplantat per brønd.
- Inkubér retinal eksplantatet ved 37 ° C på en rotator shaker, med en konstant hastighed på 50 rpm i en celle inkubator med 5% CO2 i 24 timer. Rotationen er at sikre maksimal eksponering til mediet og Prevent vedhæftning af retina til bunden af 24-brønds plade.
- Fortsæt til trin 4.
- Behandling af hele retina eksplantater med kemiske reagenser
Bemærk: Kemisk behandling af hele retina eksplantater kan udføres direkte efter trin 2.- Forbered dyrkningsmedium indeholdende 1: 1 DMEM: F12 Nutrient mix, 10% FBS, 10 U / ml penicillin streptomycin, 5 ug / ml insulin og 2 mM L-glutamin.
- Brug en lille ske at overføre retinal eksplantat fra trin 2.3 i en 24-brønds plade indeholdende 1 ml forvarmet (37 ° C) dyrkningsmedium per brønd. Inkuber en retinal eksplantat per brønd.
- Inkubér hele retinal eksplantatet i 60 minutter ved 37 ° C på en rotator shaker, med en konstant hastighed på 50 rpm i en celle inkubator med 5% CO2 før tilsætning et kemisk reagens eller køretøj.
- Forbered kemiske opløsning, f.eks Cdk1 / 2-inhibitor III, en inhibitor af M-fase progression 13, ved en endeligkoncentration på 30 uM i DMSO.
- Fjern plade med 24 brønde, der indeholder hele retinal eksplantat, fra celleinkubator. Tilsæt 10 ul af kemisk reagens eller vehikel (DMSO) direkte til den retinale medium, hvilket resulterer i en slutkoncentration på 300 nM Cdk1 / 2-inhibitor III i 0,01% DMSO. Manuelt dreje plade med 24 brønde for at tillade jævn fordeling af kemisk reagens eller køretøj i opløsningen.
- Inkubér retinale eksplantater ved 37 ° C på en rotator shaker, med en konstant hastighed på 50 rpm inde i en inkubator med 5% CO2 i den ønskede tid (op til 24 timer).
- Fortsæt til trin 4.
4. Fiksering og indefrysning af Whole retinal Eexplants
- Fjern plade med 24 brønde indeholdende den behandlede hele retinal eksplantat fra celleinkubator.
- Brug en lille ske at overføre retinal eksplantation til en 24-brønds plade indeholdende 1 ml / brønd iskold 4% paraformaldehyd i 1 x PBS. Incubate på is i 15 minutter.
- Brug en lille ske at overføre hele retinal eksplantation til en 24-brønds plade indeholdende 1 ml / brønd is kolde 1 x PBS at vaske nethinden. Der inkuberes på is i 10 min.
- Brug en lille ske at overføre hele retinal eksplantation til en 24-brønds plade indeholdende 1 ml / brønd iskold 30% saccharose i 1 x PBS. Der inkuberes på is i 1-3 timer afhængigt af den embryoniske dag i nethinden. For ST20 - ST25 (E3) nethinder, inkuberes i 1 time, ældre nethinder brug længere inkubationstid i saccharose.
- Brug en lille ske at overføre hele retinal eksplantatet på en paraffin film indeholdende ca. 500 pi kryostat nedfrysning monteringsmedium. Fjern så meget som muligt saccharose ved forsigtigt at bevæge retinal eksplantatet i frysemedium hjælp af lille ske.
- Overfør retinal eksplantatet til en indlejring form indeholdende frysemedium. Placer øjet at lette fremtidig inddeling. Sætte indlejring form indeholdende hele retinal eksplantation på dry is, indtil mediet er frosset fast. Opbevar ved -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol beskriver fremstillingen (figur 1A-F) og dyrkning af hele retina eksplantater fra kyllingefostre. Denne protokol er med succes blevet brugt til hele retinale eksplantater fra embryoner af ST20 (E3) til ST31 (E7).
Elektroporering af DNA-plasmider i hele retina eksplantater giver mulighed for mærkning og sporing af retinale progenitorceller eller over-ekspression af forskellige genprodukter. For elektroporation eksperimenter blev pigmentepithelet omhyggeligt fjernet fra enukleeret øje af en ST25 (E4 ½) embryo. Hele retinal eksplantat blev derefter anbragt i en kuvette indeholdende DNA plasmidopløsning, blev elektroderne nedsænket (figur 2A) og en strøm blev påført. Efter 24 timer af dyrkning, GFP-positive celler var synlige i en stor del af det intakte nethinden (figur 2B). Efter sektionering, blev enkelt GFP + -celler let detekteres langs apico-basal akse nethinden (Fifigur 2C). Elektroporation resulterede i et stort nethindeområde optage plasmidet og ekspression af reportergenet. Succesraten, målt på antallet af nethinder med en elektroporeret areal større end 1/5 af den samlede nethinden, var 75% (62 ud af 83 nethinder) for hele retinal eksplantat elektroporering, sammenlignet med 14% (37 ud af 263 øjne ) for in ovo elektroporation. Elektroporation eksperimenter på hele retinale eksplantater har med succes blevet udført på ST20 (E3) til ST27 (E5) embryoner.
Hele retinale eksplantater kan dyrkes i ca. 24 timer (figur 3A og B). Længere inkubationstider kan føre til forsinket udvikling, morfologiske misdannelser, apoptose og i sidste ende nedbrydning af nethinden (figur 3C). Når dyrkning af kylling nethinder som hele eksplantater arkitekturen af nethinden forbliver intakt. Dette omfatter fordeling af de forskellige faser i cellecyklus langs apico-Basal akse. Under normal udvikling cellerne undergår S-fasen på den basale side, efterfulgt af mitose på den apikale side af nethinden 14,15. Et afsnit fra en hel retinal eksplantat, dyrket i 24 timer, blev immunofarvet med en Phospho-histon 3 (PH3) antistof, mærkning celler i slutningen af G2 / M-fasen (figur 3D). De PH3 positive celler blev fundet på den apikale side af nethinden, i overensstemmelse med normal retinal udvikling. En aktiv cyclin B1-Cdk1 kompleks i kernen vil igangsætte M-faseovergangen 13. Blokering af Cdk1-kinaseaktivitet vil inhibere down-stream begivenheder, der er nødvendige for cellecyklus formering i mitose. Stage 29 (E6) hele retina eksplantater blev inkuberet med Cdk1 / 2 Inhibitor III i 4 timer og PH3 immunreaktivitet blev analyseret. Den Cdk1 / 2-inhibitor III reducerede antallet af pH 3 positive celler (figur 3E), hvilket indikerer en effektiv blok af G2 / M-faseovergang. Reduktionen af antallet af mitoser efter treatment med Cdk1 / 2-inhibitoren bekræftet, at behandlingen var effektiv.
Figur 1. Fjernelse af pigment epitel. En embryonale dag 6 (ST29) kylling øje blev dissekeret og forberedt til dyrkning som hele retinal eksplantation. (A) Udsigt af den forreste øje med elev og linse og årehinden revne nedad. Pigmentepithelet er intakt, men sclera Anlage og omgivende bindevæv er blevet fjernet. (B) den bagtil del af øjet. Synsnerven exit og choroid revne vender nedad. (C) snit i pigmentepithelet. (D) De fleste af pigment epitel er fjernet. (E) Nogle pigment epitel efterlades ved langs randen af det ciliære legeme og ( F) årehinden revne. LE: linse og corpus ciliare, CF:choroid revne, ON: synsnerven exit. Scale bar er 0,5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Elektroporation af hele retina eksplantater. (A) Skematisk præsentation af platinelektroder og hvordan de er placeret på hver side af hele retinal eksplantatet, der er nedsænket i DNA-plasmid opløsning i den trunkerede kuvette. (B) Whole retinal eksplantat efter 24 timer af dyrkning, og (C) sektioneret nethinden. ON: synsnerven exit. Scale bar er (A) 4 mm, (B) 0,5 mm, (C) 50 um. Klik her for at se et større ve rsion af dette tal.
Figur 3. Dyrkede hele retina eksplantater blev fastsat, frosset, cryosectioned og mærkes ved immunohistokemi. (A) En ST29 hele retinal eksplantatet dyrkes i 24 timer. Fluorescens mikrografier af nuklear farvning efter (B) 24 timer og (C) 48 timer. (D) et PH3 antistof blev anvendt til at mærke celler i slutningen af G2 / M-fasen. (E) Den relative massefylde (PH3 + celler / mm 2, middelværdi ± SD) og fluorescens mikrografier af pH 3 + celler ved ST29 efter Cdk1 / 2-inhibitor III behandling i 4 timer i forhold til køretøjet. st: Hamburger og Hamilton stadier, t-test, ** p <0,01, n ≥ 4 behandlede øjne, 4 sektioner pr øjet, h: timer. Scale bar er (A) 0,5 mm, (BE) 10 um.jove.com/files/ftp_upload/53202/53202fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette arbejde præsenteres et detaljeret protokol for dissektion, elektroporation eller kemisk behandling, og dyrkning af hele retina eksplantater fra kylling embryoner. Denne protokol er nemt, hurtigt og giver mulighed for både en høj succesrate og reproducerbar resultater.
Elektroporering af hele retina eksplantater producerer store områder af celler, som udtrykker genkonstruktionen af interesse. Det er let at placere korrekt elektroderne og at blotlægge en bestemt del af nethinden til en defineret DNA-plasmid koncentration. Denne fremgangsmåde giver mulighed for en pålidelig metode til at undersøge genfunktion i nethinden med en typisk højere succesrate i forhold til elektroporeringer in ovo. Hele retinal eksplantat gør det også muligt at udsætte nethinden til et medium indeholdende en defineret koncentration af en kemisk reagens giver en ensartet fordeling af reagenset i neurale nethinde. Protokollen tillader kombineretbehandlinger, hvor nethinden først elektroporerede og derefter behandlet med stoffer. Indflydelsen af variabilitet mellem individuelle embryoer kan minimeres, da både behandlede og kontrol øjet kan afhentes fra den samme embryo og behandles selvstændigt.
Protokollen er blevet optimeret til hele retinale eksplantater fra ST20 (E3) til ST27 (E5) embryoner til elektroporation og ST20 (E3) til ST31 (E7) embryoner til kemisk stof behandling. Ved yngre faser retina / optik cup er for lille og skrøbelig til effektivt at håndtere og in ovo elektroporering er mest sandsynligt mere effektiv. Elektroporeringer på hele retinale eksplantater blev ikke udført på etaper ældre end ST27 (E5). Det er sandsynligt muligt at tilpasse denne protokol til eksplantater fra ældre embryoner. Det ville omfatte opnåelse større kuvetter, større brønde til udrugning og øget volumen af retinal dyrkningsmedium. Men ved E12-14 pigmentepithelet og den ydre del affotoreceptorer blevet tæt knyttet og fjernelse af pigment epitel kan beskadige nethinden. Nethinden skal være intakt under hele forsøget og inkubation.
Med denne dissektion og dyrkning protokol, den strukturelle integritet af den retinale arkitektur forbliver intakt under 24 timer, baseret på ekspressionen af celletypespecifikke markører. Som nævnt har vi undersøgt cellecyklusprogression i eksplantaterne og processen med interkinetic nuklear migration af retinale progenitorceller ser normal. Hvis protokollen udføres hurtigt er der kun små effekter på den udviklingsmæssige progression i eksplantatet. Imidlertid kan udviklingen være lidt decelereres og en eksplantat, der er blevet dyrket i 24 timer kan udvise en udviklingsmæssig alder, der er 1-2 timer yngre end den normale modstykke. Det tilrådes at sammenligne eksplantatet til alder-matchede normal nethinden, og det tilrådes at bruge kontralaterale øje som en eksperimentel ekspant kontrol. Det skal understreges, at fjernelsen af nethindepigmentepitelet kan påvirke udviklingen af de ydre fotoreceptor segmenter. Det skal også bemærkes, at en explant nethinden repræsenterer en skadet nethinden med axotomiserede retinale ganglieceller.
Denne protokol er enkel og derfor reducerer eksperimentelle fejl, men ex ovo situationen kræver flere eksperimentelle kontrol. En specifik udviklingsproces, der er underkastet blive undersøgt ved hjælp af denne ex ovo protokol kan også studeres parallelt og sammenlignes med den normale in ovo situation. De passende eksperimentelle kontrol skal altid være inkluderet, såsom køretøjer, der anvendes til at opløse stoffer. Ved brug af signalvej blokkere, bruge flere forskellige inhibitorer for den samme proces eller anvende andre inhibitorer, der målenzymer ved mere end et niveau af den specifikke vej, som er undersøgt. For elektroporation, en GFP-udtrykkende DNA-plasmid er nyttigt etsa positiv kontrol. Hvis sådant plasmid ikke producerer reportergenekspression, er det mest sandsynligt på grund af, at anoden (+) og katode (-) er placeret forkert. DNA plasmid vil derefter migrere væk fra nethinden. Ved prøvning hidtil ukendte DNA-plasmider er det derfor anbefales at inkludere et DNA-plasmid, der udtrykker et andet fluorescerende protein som en intern kontrol elektroporation. Elektroporation parametre, der beskrives i denne protokol er blevet optimeret til at frembringe et stort antal reportergen udtrykkende celler. Formindskelse af spænding eller antallet af impulser reducerer antallet af transficerede celler, der kan frembringe falske negative resultater. Dog kan øge spændingen eller antallet af impulser føre til beskadigelse af vævet og forøget celledød. Tre sæt specialfremstillede platinelektroder er blevet brugt til alle elektroporeringer i mere end to år uden at vise nogen reduceret kapacitet. Elektroderne skal rengøres omhyggeligt og elektroden overflade poleres. Kommercielle 4 mm paddleelektroderne er tilgængelige.
Denne protokol fokuserer på elektroporation af DNA plasmider og kemisk behandling af hele retinale eksplantater. Det er muligt at udvide denne protokol til at omfatte andre eksperimentelle procedurer, såsom en knock-down af genekspression ved anvendelse af morpholino oligomerer. Hele retinal eksplantat proceduren åbner op for muligheden for at udføre kortvarige eksperimenter på en nem, hurtig og meget reproducerbar måde. Det reducerer omkostningerne, tid og antallet af dyr, der er nødvendige for hvert forsøg, og vigtigst det øger muligheden for at få solide data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1xPBS (tablet) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10x DPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 734-0006 | |
| 100 μl pipette tips | VWR | 613-0798 | |
| 1.5 ml disposable plastic cuvette | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24-well plate | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm Petri dish | VWR | 391-1998 | |
| 70% ethanol | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inhibitor III | 217714 | Calbiochem | 300 nM in 0.01% DMSO |
| Cell culture incubator | Thermo Forma | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Electrodes | Platina, custom made | ||
| Electro square porator ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 Nutrient mix | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Forceps | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Freezing medium NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| GFP expressing DNA plasmid (pZGs) | |||
| Humidified incubator | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| Mounting medium ProLong Gold with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Paraffin film | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way embedding mold | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicillin streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| PhosphoHistone 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Dilution 1/4,000 |
| Platinum electrodes (custom made from "rondelles") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Dia: 4mm, 0.1 mm thickness |
| Platimun electrodes | Sonidel | CUY700P4L | Dia: 4 mm |
| Polyethylene pasteur pipette | VWR | 612-2853 | |
| Rotator shaker | VWR | 444-2900 | |
| Small spoon | VWR | 231-2151 | |
| Sucrose | VWR | 443815S | |
| White Leghorn eggs | Local supplier | ||
| Wine cooler | WineMaster 24, Caso, Berlin Germany |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Method. 24, 43-48 (2001).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain. J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. J Vis Exp. , (2012).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina. Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).
- Tomita, K., et al. Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis. Neuro. 16, 723-734 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).
- Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors. Exp eye re. 93, 556-564 (2011).
- Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway. Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).
- Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest. Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).
- Sauer, F. Mitosis in the neural tube. J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).
