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Developmental Biology

एक उपन्यास संस्कृति मॉडल मानव pluripotent के लिए अपरा वातानुकूलित मीडिया में जिलेटिन पर सेल प्रचार स्टेम

Published: August 3, 2015 doi: 10.3791/53204
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Science, Graduate School of Medicine, Korea University

Protocol

आचार बयान: मानव नाल अध्ययन कोरिया विश्वविद्यालय (AN09085-001) के मानव अनुसंधान के लिए संस्थागत समीक्षा बोर्ड के अनुमोदन के साथ, भावी आयोजित किया गया। सभी प्रयोगों कोरिया यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर में एक स्वच्छ रोगाणु मुक्त रूम की सुविधा में प्रदर्शन किया गया। प्रयोगात्मक डिजाइन और hPSCs का उपयोग प्रक्रियाओं कोरिया यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर के संस्थागत समीक्षा बोर्ड (AN12277-003) द्वारा अनुमोदित किया गया।

उपकरण, संस्कृति, मीडिया, और व्यंजन के 1. तैयारी

  1. 0.1% जिलेटिन के साथ कोट सभी संस्कृति व्यंजन। आटोक्लेव फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और संदंश। अधिक से अधिक 15 मिनट के लिए 15 £ साई के तहत 121 डिग्री सेल्सियस पर शल्य कैंची, microcentrifuge ट्यूब, और धुंध जीवाणुरहित।
  2. तैयार पूर्व गर्म 0.25% trypsin-इथाइलीन एमाइन टेट्रा-एसिटिक एसिड (ट्रिप्सिन-EDTA) और पूर्व गर्म फ़िल्टर्ड संस्कृति मीडिया (DMEM) 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 100 यू / एमएल पेनिसिलिन से युक्त है, और 100 ग्राम / मिलीलीटर streptomycप्रक्रियाओं के शुरू होने से पहले में।

मानव प्लेसेंटा से 2. सेल अलगाव

  1. लिखित सूचित सहमति प्राप्त करने के बाद गर्भ के 7-32 सप्ताह में सामान्य या चिकित्सीय गर्भपात के दौर से गुजर स्वस्थ गर्भवती महिलाओं से सीजेरियन प्रसव के बाद अपरा ऊतक, प्राप्त करते हैं।
  2. नाल से प्रसूति विशेषज्ञ शल्य चिकित्सा द्वारा अलग मानव नाल कोरियोनिक प्लेट (HPCs) है; 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.25% trypsin-EDTA में इन सेते हैं, और उसके बाद 5 मिलीलीटर पीबीएस से धो लें।
  3. कैंची का उपयोग HPCs से कोरियोनिक विल्ली पृथक; विल्ली कीमा और 1ml पीबीएस के साथ उन्हें तीन बार धोएं। नख़रेबाज़ के बाद, एक विंदुक टिप का उपयोग कर एक microfuge ट्यूब में कोरियोनिक विल्ली जगह; नीचे से ऊपर pipetting और 500 μl पीबीएस के साथ नमूने धो लें और 3 मिनट के लिए 120 XG के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र। पूर्व गर्म संस्कृति के माध्यम से 500 μl के साथ दो बार ऊतकों को धो लें।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर जिलेटिन में लिपटे प्लेटों पर मध्यम में संस्कृति कोशिकाओं, 5% सीओ 2 में
  5. तीसरे पारित होने तक हर 2-3 दिनों मध्यम विनिमय। संस्कृति के दौरान, संस्कृति माध्यम में तैर सेल मलबे को हटाने; बढ़ रही अपरा fibroblasts थाली करने के लिए देते हैं जाएगा। संस्कृति तो 10 वें पारित होने के लिए एचपीसी ऊपर से निकाली गई और fibroblast कोशिकाओं की तरह trypsinization और mitomycin-सी (10 माइक्रोग्राम / एमएल) के उपचार के बाद hESC संस्कृतियों के लिए उन्हें फसल।
  6. शेयर नमूने के रूप में HPCs ठंड से पहले, HPCs सामान्यतः (एम fermentans, एम hyorhinis, एम Arginine, एम माइकोप्लाज्मा सहित नाल, संक्रमित कि रोगजनकों के साथ दूषित नहीं कर रहे हैं, इसकी पुष्टि करने के लिए रिवर्स प्रतिलेखन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी पीसीआर) का उपयोग करें । orale, एम salivarium, एम hominis, एम pulmonis, एम arthritidis, एम neurolyticum, एम hyopneumoniae,और एम capricolum) और बैक्टीरियल प्रजातियों, Ureaplasma urealyticum, एक माइकोप्लाज्मा पता लगाने किट का उपयोग करके।
    1. आरटी पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें किट में दिए गए सभी प्राइमरों और मिश्रण का उपयोग करें। माइकोप्लाज्मा का पता लगाने के लिए 36 दिनों के लिए खेती की जाती है कि कोशिकाओं के supernatants का प्रयोग करें। पीसीआर मिश्रण करने के लिए इन नमूनों के 3 μl जोड़ें और 30 सेकंड, 2 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, और 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के लिए प्रत्येक 94 डिग्री सेल्सियस से मिलकर, 35 चक्र के लिए 1 सेंट पीसीआर प्रक्रिया करते हैं।
    2. ध्यान से पीसीआर मिश्रण करने के लिए 1 सेंट पीसीआर उत्पाद के 0.5 μl जोड़ सकते हैं और पहले की तरह ही शर्तों का उपयोग 30 चक्र के लिए 2 एन डी पीसीआर प्रक्रिया करते हैं। 1% agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा परिलक्षित उत्पादों का विश्लेषण करें; जैल को 1 सेंट और 2 एन डी पीसीआर उत्पादों में से प्रत्येक के 10 μl लागू होते हैं।
  7. HPCs रोगजनकों के साथ दूषित हो पाए जाते हैं, तो इन को खत्मनिर्माता के निर्देशों का पालन, एंटीबायोटिक दवाओं का एक संयोजन (बी एम-Cyclin) का उपयोग। 3 दिन के लिए बी.एम.-Cyclin 1 से 10 माइक्रोग्राम / मिलीग्राम से युक्त नए मध्यम जोड़ें, और फिर एक और 4 दिनों के लिए 5 माइक्रोग्राम / एमएल बी.एम.-Cyclin 2 के साथ कोशिकाओं का इलाज। दो बार इस चक्र को दोहराएँ और उसके बाद फिर से माइकोप्लाज्मा संदूषण के लिए जाँच करें।

3. फसल काटने वाले मानव प्लेसेंटा व्युत्पन्न कोशिकाओं मध्यम (hPCCM) वातानुकूलित

  1. संदूषण को छोड़कर जाने के बाद, संलग्न कोशिकाओं (85-90% संगम इलाज; (1.5 × 10 7 कोशिकाओं / 2 घंटे और 30 मिनट के लिए mitomycin-सी (10 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ कुप्पी), और 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोया पीबीएस। 24 घंटे के लिए mitomycin-सी बिना पूर्व गर्म मध्यम के साथ कोशिकाओं को सेते हैं।
  2. एक दिन के इलाज के बाद, 10 एमएल मध्यम में कोशिकाओं को सेते (DMEM-F12 के 20% नॉक आउट सीरम रिप्लेसमेंट [KOSR] के साथ पूरक, 0.1 मिमी β-mercaptoethanol, 1% NEAA, और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन)। एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 24 ऊष्मायन के मानव संसाधन, फसल मुख्यमंत्री के बाद औरएक 0.22 सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर मुख्यमंत्री फिल्टर।
  3. नई मध्यम और ऊष्मायन के एक और 10 मिलीलीटर जोड़ें। 1 सप्ताह के लिए हर दिन संस्कृतियों से सभी supernatants लीजिए और -80 डिग्री सेल्सियस पर काटा मध्यम फ्रीज। दोहराया फ्रीज पिघलना चक्र से बचें।

4. संस्कृति मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) और स्टेम सेल की प्रेरण (IPSCs)

  1. मानव भ्रूण स्टेम सेल लाइनों प्राप्त, (क्रमशः, नाम WA01 और WA09 के तहत एनआईएच hESC रजिस्ट्री में सूचीबद्ध) एच 1 और H9 कोशिकाओं और प्रेरित-स्टेम सेल IPSC-1: आईपीएस (चमड़ी) -1 और IPSC -2 (IISH1i- WiCell अनुसंधान संस्थान (मैडिसन, WI, संयुक्त राज्य अमरीका) से बी एम)। प्रकोष्ठों निर्माता के निर्देशों का पालन thawed और सभ्य होना चाहिए।
  2. नियंत्रण समूह के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर व्यापक रूप से इस्तेमाल फीडर से मुक्त और सीरम मुक्त परिभाषित संस्कृति के माध्यम में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में लिपटे बर्तन पर और 5% सीओ 2 में संस्कृति कोशिकाओं। प्रारंभ में, hPSCs की 80-100 clumps के बीज मैंएन 35 मिमी व्यंजन हैं। के लिए 70-80% संगम और नियमित रूप से पारित होने कोशिकाओं तक इन व्यंजनों में कोशिकाओं को विकसित उप-संवर्धन, हर 5-6 दिन में एक बार यांत्रिक या एंजाइमी तरीकों (Dispase) का उपयोग। मध्यम के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें और 1 के अनुपात में उन्हें प्लेट: 4। हर दिन ताजा माध्यम के साथ मध्यम बदलें।
  3. प्रयोगात्मक समूहों के लिए, बर्तन पर hPCCM में संस्कृति कोशिकाओं या तो यंत्रवत् या enzymatically, 0.1% जिलेटिन के साथ पूर्व में लिपटे और एक बार हर 5 दिन की दिनचर्या passaging प्रदर्शन करते हैं। 6-1: 10 1 की श्रेणी में अनुपात में प्लेट कोशिकाओं। hPSCs स्थानांतरण के बाद 2 दिनों के भीतर जिलेटिन के लिए देते हैं। दैनिक ताजा माध्यम के साथ मध्यम बदलें।

मानव स्टेम सेल के 5. विशेषता

नोट: इस तरह के alkaline फॉस्फेट धुंधला, immunocytochemistry, मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qRT- पीसीआर), और पश्चिमी सोख्ता के रूप में कई तरीकों का उपयोग hPSCs विशेषताएँ।

  1. Immunofluorescence धुंधला
    1. Immunofluorescenc के लिएई धुंधला, संस्कृति hPSCs और 4% 10 मिनट के लिए (डब्ल्यू / वी) paraformaldehyde के साथ 8 अच्छी तरह से स्लाइड कक्षों में कोशिकाओं को ठीक; तो, (वी / वी) ट्राइटन-X100 के 15 मिनट के लिए, और 0.1% से युक्त पीबीएस में 3% (वी / वी) सामान्य घोड़े सीरम के साथ 1 घंटे के लिए कोशिकाओं ब्लॉक (वी / वी) 0.1% के साथ कोशिकाओं permeabilized Tween- 20। हर कदम के बीच 5 मिनट के लिए दो बार पीबीएस धो लें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ हे / एन: प्राथमिक एंटीबॉडी (1000 का 1 अक्टूबर 4, SSEA4, टीआरए-1-81, टीआरए-1-60, कमजोर पड़ने) के साथ कोशिकाओं को सेते हैं।
    3. बढ़ते से पहले, अंधेरे में 5 मिनट के लिए 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के साथ कोशिकाओं को सेते हैं। धो कोशिकाओं इसरो अंधेरे में प्रत्येक और सूखी कोशिकाओं को पूरी तरह 5 मिनट के लिए तीन बार। प्रतिदीप्ति बढ़ते मध्यम में कोशिकाओं की रक्षा करें और एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के तहत उन्हें निरीक्षण करते हैं।
  2. QRT- पीसीआर
    1. निर्माता विनिर्देशों के अनुसार एक RNeasy मिनी किट का उपयोग कोशिकाओं से कुल शाही सेना को अलग और एक नैनो ड्रॉप स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर निकाला शाही सेना यों। एक 20 μl प्रतिक्रिया मिश्रण युक्त oligo के लिए कुल शाही सेना के 2 माइक्रोग्राम जोड़कर सीडीएनए Synthesize (डीटी) प्राइमरों और सुपरस्क्रिप्ट द्वितीय रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस; इस प्रक्रिया में निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
    2. बुद्धि SYBR ग्रीन qPCR के मास्टर मिक्स और पूरक टेबल S1 में वर्णित प्राइमर दृश्यों का उपयोग कर, एक जैव रेड iCycler बुद्धि प्रणाली के साथ संश्लेषित सीडीएनए बढ़ाना। Glyceraldehyde-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH) के उन लोगों के लिए ब्याज की जीन का चक्र दहलीज मूल्यों मानक के अनुसार।
  3. Alkaline फॉस्फेट (एपी) धुंधला
    1. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार, ते सेल विशेषता किट का उपयोग एपी गतिविधि का पता लगाने।
    2. 5 दिन पर, मीडिया महाप्राण और 12 मिनट के लिए पीबीएस में 4% paraformaldehyde के साथ hPSCs तय कर लो। Overfix मत करो; अब से 2 मिनट के लिए कोशिकाओं फिक्सिंग alkaline फॉस्फेट की निष्क्रियता का परिणाम देगा। लगानेवाला Aspirate और 1x कुल्ला बफर से कुल्ला। ऐसा न करेंकुओं कदम के बीच शुष्क करने की अनुमति देते हैं।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से (35 मिमी पकवान के प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर) को कवर करने के लिए पर्याप्त धुंधला समाधान जोड़ें। 15 मिनट के लिए आरटी पर अंधेरे में प्लेटें सेते हैं।
    4. ऊष्मायन के बाद, 1x कुल्ला बफर के साथ बर्तन धोने। 1x पीबीएस के साथ कवर कोशिकाओं सुखाने को रोकने और एक ओलिंप माइक्रोस्कोप का उपयोग दाग कोशिकाओं की जांच करने और छवि के लिए।
  4. पश्चिमी धब्बा
    1. पहले से 9 में वर्णित पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करते हैं। संक्षेप में, सेल lysates में प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करते हैं। एक सोडियम dodecyl सल्फेट-polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) जेल पर प्रोटीन के बराबर राशि का समाधान और एक polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली पर प्रोटीन हस्तांतरण।
    2. दाग ब्लॉक और 4 डिग्री सेल्सियस पर विभिन्न प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ / ओ एन यह जांच; बाद में 1 घंटे के लिए एचआरपी संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दाग सेते हैं। 10 मिनट incubations के बीच हर समय के लिए झिल्ली तीन बार धोएं। एक ईसीएल अभिकर्मक का उपयोग संकेतों का पता लगाने।
    3. लघु मिलकर दोहराएँ (एसटीआर) विश्लेषण
      1. hPSCs एक ही मार्ग पर नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों से काटा गया। जीनोमिक डीएनए निर्माता के निर्देशों के अनुसार, एक डीएनए माइक्रो किट का उपयोग कर निकाला गया था।
      2. निर्माता की विशेषताओं और केशिका वैद्युतकणसंचलन के अनुसार, AmpF / एसटीआर पीसीआर प्रवर्धन किट का उपयोग कर 16 विभिन्न आनुवंशिक लोकी के लिए जीनोमिक डीएनए बढ़ाना एक आनुवंशिक विश्लेषक का उपयोग किया गया था।

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Representative Results

इस hPSC प्रचार विधि का एक फायदा यह मानव कोशिकाओं से स्रावित घटकों का उपयोग करता है। प्रोटोकॉल में एक सबसे ciritical कदम मानव नाल व्युत्पन्न कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति है। इस आवश्यकता है और एचपीसी थाली विल्ली का एक सटीक भाग से सटीक विच्छेदन। 1 मानव नाल व्युत्पन्न सेल अलगाव के लिए प्रक्रिया को पता चलता है। इस प्रक्रिया को सरल और कोशिकाओं के अलगाव के लिए सुविधाजनक है, और आसानी से 1 घंटे के भीतर किया जा सकता है। चित्रा 2 में वर्णित है, ऊतकों मजबूती अंकुरित जिलेटिन लेपित पकवान और fibroblast कोशिकाओं की तरह करने के लिए संलग्न। Trypsinization द्वारा मार्ग दौरान मलबे और सड़ा हुआ ऊतकों को हटाने की कोशिकाओं के चयन की अनुमति देता है और एक सजातीय संस्कृति सुनिश्चित करता है। इन कोशिकाओं को संदूषण की कमी की पुष्टि के बाद की hPSC प्रसार के लिए वातानुकूलित माध्यम का उत्पादन किया जा सकता है। इष्टतम स्थितियों, कोशिकाओं 80-85% संगम को विकसित करने के लिए अनुमति दी है कि उन लोगों के रूप में परिभाषित किया गया है, जो वीं के बादई वृद्धि कृत्रिम रूप से (डेटा) नहीं दिखाया बंद कर दिया गया था।

फीडर कोशिकाओं या सिंथेटिक matrices पर सुसंस्कृत hPSCs hPCCM में जिलेटिन लेपित व्यंजन को हस्तांतरित किया जा सकता है। 3 hPSC लाइनों Matrigel लेपित प्लेट (चित्रा 3 ए और बी) के लिए मनाया कि इसी तरह के एक स्तर पर hPCCM में बनाए रखा जा सकता है कि पता चलता है। 0.1% जिलेटिन अब तक hPSC संस्कृति के लिए uesd नहीं किया गया है। हमारी परिस्थितियों में, hPSCs विस्तार किया है और नियंत्रण समूह में hPSCs के समान pluripotency, को बनाए रखा। HPCCM hPSC संस्कृति के लिए अन्य मेट्रिसेस पहुँचा कि पुष्टि करने के लिए, hPSCs laminin, vitronectin और गैर लेपित बर्तन पर उप-सुसंस्कृत थे। hPSC जुड़ी है और laminin- और vitronectin लेपित बर्तन पर hPCCM में वृद्धि हुई। हालांकि, कई मार्ग के बाद, कई कालोनियों भेदभाव कर रहे थे और जिलेटिन लेपित समूह पर उन लोगों के विपरीत, को बनाए रखने नहीं दिया। गैर लेपित बर्तन करने के लिए स्थानांतरण के बाद, कोई लगाव hPSCs (चित्रा -3 सी) के लिए मनाया गया। सी के लिएonfirm hPSCs hPCCM में लंबी अवधि संस्कृति के बाद नियंत्रण समूह के लिए आनुवंशिक रूप से समान थे, कि दोनों समूहों से समानांतर में सुसंस्कृत hPSCs 16 जीनोमिक लोकी (चित्रा 3 डी और ई) के लिए एक छोटी मिलकर दोहराने (एसटीआर) तकनीक का उपयोग कर विश्लेषण किया गया।

HPSCs के पूर्व vivo संस्कृति के बारे में एक व्यापक रूप से स्वीकार धारणा bFGF के आत्म नवीकरण को बढ़ावा देने की जरूरत है कि है। BFGF के अभाव में, hPSCs उनके आत्म नवीकरण क्षमता खो देते हैं और 12,13 अलग। HPCCM हालत में, hPSCs उनके आत्म नवीकरण क्षमता खो देते हैं और stably लंबी अवधि संस्कृति (चित्रा -4 ए - सी) के दौरान pluripotency मार्करों व्यक्त नहीं किया।

3 रोगाणु परतों की कोशिकाओं में भेदभाव करने की क्षमता hPSCs का एक अनूठा आंतरिक विशेषता है। हर hPSC इस क्षमता के संरक्षण को सत्यापित करने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए। चित्रा 5 में दिखाया गया है, hPSCs अनायास सेल में भेदभावhPCCM में शामिल करने के 2 सप्ताह (चित्रा 5 ए और बी) के बाद 3 जनन स्तर की है। इन आंकड़ों hPCCM नैदानिक ​​उपयोग के लिए इष्टतम है कि संकेत मिलता है।

hPSC स्थानांतरण के दौरान जिलेटिन लेपित बर्तन पर कुर्की समय यह hPSC प्रचार के लिए व्यावसायिक रूप से सिंथेटिक matrices के साथ लेपित बर्तन पर है की तुलना में अब है। आमतौर पर, कोशिकाओं। सिंथेटिक substrates के साथ कोटिंग के बाद एक दिन के भीतर संलग्न 0.1% जिलेटिन पर और नियंत्रण प्लेटों पर 6 से पता चलता लगाव चित्रा। 24 घंटे के बाद उप-सुसंस्कृत hPSCs नियंत्रण (चित्रा 6A) पर से जिलेटिन पर थोड़ा और अधिक संलग्न। hPSCs सावधानी के साथ संभाला जाना चाहिए। 48 घंटे के बाद, hPSCs पूरी तरह से जुड़ा हुआ है और जिलेटिन लेपित व्यंजन (चित्रा 6B) पर विस्तार शुरू किया गया था। इसके अलावा, hPSCs जिलेटिन पर उप-संस्कृति (चित्रा 6C) के बाद 5 दिन पर प्रभावी ढंग से और गठन पैक कालोनियों विकसित करने के लिए दिखाई दिया। HPSCs, सावधान उपचार के लिए कुर्की की अवधि के दौरानटी महत्वपूर्ण है और अस्तित्व और आत्म नवीकरण प्रभावित कर सकते हैं। HPCCM परिस्थितियों में, एक 48 घंटा अवधि जोरदार hPSCs की कुर्की के लिए सिफारिश की है।

चित्र 1
चित्रा 1: मानव नाल कोरियोनिक विल्ली से सेल अलगाव (ए) के ताजा अपरा कोरियोनिक ऊतक trypsinization के बाद पीबीएस में धोया गया था।। (बी) विल्ली निष्फल शल्य कैंची का उपयोग टुकड़ों में काट रहे थे। (सी) विल्ली मलबा और जहाजों को दूर करने के लिए पीबीएस में कई बार धोया गया। (डी - ई) विल्ली, एक सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब को हस्तांतरित किया गया (अधिकतम) कीमा और धोया। (एफ) ऊतकों को एक टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर centrifuged थे। (जी) इस प्रक्रिया पूर्व गर्म संस्कृति के माध्यम में पीबीएस में तीन बार और दो ​​बार दोहराया गया था। (एच) कक्ष और ऊतकों एक पूर्व लेपित जिलेटिन कुप्पी पर एक साथ वरीयता प्राप्त और 5-7 दिनों के लिए incubated रहे थे। कोशिकाओं जुड़ी है और अंकुरित।

चित्र 2
चित्रा 2: मानव नाल व्युत्पन्न कोशिकाओं की खेती (ए) के अलगाव के बाद लगभग 1 सप्ताह, अंकुरित जिलेटिन लेपित बोतल और fibroblast कोशिकाओं की तरह से जुड़ी मानव नाल ऊतकों और कोशिकाओं।। पहले उपसंस्कृति बीतने के बाद (बी), ऊतकों को हटा दिया गया। मध्यम हर दूसरे दिन ताजा माध्यम से बदल दिया गया था। (सी) तीसरे पारित होने के बाद, कोशिकाओं को और अधिक सजातीय दिखाई दिया। स्केल सलाखों:। 200 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 3:। जिलेटिन लेपित बर्तन पर hPCCM में मानव स्टेम सेल जिलेटिन लेपित बर्तन पर hPCCM में सुसंस्कृत 13 मार्ग, hPSCs, के बाद, उच्च alkaline फॉस्फेट (एपी) गतिविधि का प्रदर्शन किया। (ए) एच 1 और IPSCs (Matrigel लेपित बर्तन पर mTeSR1) नियंत्रण की स्थिति में सुसंस्कृत थे। (बी) एच 1 और IPSCs जिलेटिन लेपित बर्तन पर hPCCM में सुसंस्कृत थे। बाएं पैनल: उज्ज्वल क्षेत्र; राइट पैनल: alkaline फॉस्फेट धुंधला हो जाना। (सी) एच 1 और IPSC तबादला और तुलना के लिए कई मैट्रिक्स में लिपटे बर्तन पर सुसंस्कृत थे। 5 मार्ग hPSCs सुसंस्कृत थे, के बाद दिखाया गया है। Laminin लेपित व्यंजन, vitronectin लेपित बर्तन, गैर लेपित व्यंजन हैं। (डी - ई) hPSCs के लिए STR विश्लेषण नियंत्रण hPSCs के साथ तुलना में hPCCM में सुसंस्कृत। स्केल सलाखों:। 10 माइक्रोन कृपया गइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां चाटना।

चित्रा 4
चित्रा 4:। 14 मार्ग के बाद SSEA-4, Oct-4, Sox2, NANOG, टीआरए-1-60, और टीआरए-1-81 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ मानव स्टेम सेल प्रचार bFGF की आवश्यकता नहीं है (ए) एच 1 सेल immunofluorescence धुंधला पर hPCCM में बर्तन जिलेटिन लेपित। स्केल बार: 10 माइक्रोन। (बी) आरटी पीसीआर विश्लेषण प्रयोगात्मक और नियंत्रण की स्थिति में अलग सेल लाइनों में stemness मार्करों, OCT4, NANOG, और Rex1 की अभिव्यक्ति को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था। (सी) pluripotency मार्करों के प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर, OCT4, Sox2, और FGF2, पश्चिमी blots द्वारा निर्धारित किया गया है hPSCs में। इस figur का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंई।

चित्रा 5
चित्रा 5: इन विट्रो में pluripotency का विश्लेषण। (ए) QRT- पीसीआर विश्लेषण hPCCM स्थितियों में उगाया stemness मार्करों, OCT4 और NANOG की अभिव्यक्ति और विभेदित कोशिकाओं में तीन-रोगाणु परत मार्करों की अभिव्यक्ति और undifferentiated कोशिकाओं को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था। । Mesoderm, nestin, SOX1: बाहरी झिल्ली, एएफपी, GATA3: अन्तर्जनस्तर ग्राफ में दिखाया गया है, माप नियंत्रण संस्कृति की स्थिति (OCT4) टी, HNF3 β में मनाया अभिव्यक्ति के स्तर के लिए सामान्यीकृत थे। त्रुटि सलाखों एसडी ± साधन संकेत मिलता है। (बी) एच 1 और mesoderm निहित है कि 2 सप्ताह (desmin), बाहरी झिल्ली (TUJ1) के बाद embryoid निकायों का गठन प्रयोगात्मक शर्तों के तहत 10 मार्ग के लिए सुसंस्कृत थे कि IPSC लाइनों,और अन्तः (एएफपी, GATA4), immunofluorescence धुंधला द्वारा मापा। स्केल सलाखों:। 100 माइक्रोन, 200 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6:। दो मैट्रिक्स में लिपटे प्लेटों के बीच hPSC लगाव की तुलना एच 1 और IPSC -1, विभिन्न स्थितियों के लिए स्थानांतरित कर 0.1% जिलेटिन hPCCM में और नियंत्रण समूह थे। (ए) hPSC उप-संस्कृति के बाद 1 दिन। 2 दिन hPSC उप-संस्कृति के बाद (बी)। 5 दिन hPSC उप-संस्कृति के बाद (सी)। स्केल सलाखों:। 10 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह मॉडल, ऐसे bFGF या इंसुलिन के रूप में बहिर्जात पुनः संयोजक वृद्धि कारकों के अलावा बिना humanized फीडर से मुक्त संस्कृति की स्थिति में, उनकी विशेषताओं को बनाए रखने के एक humanized microenvironment में hPSCs के हेरफेर सक्षम करते हुए सफलतापूर्वक hPSCs प्रचार करने के लिए विकसित किया गया था। Exogenous bFGF के पूरकता आम है और इस तरह के Matrigel या laminin के रूप में substrata के आवेदन hPSCs 14 की फीडर से मुक्त संवर्धन के लिए आवश्यक है।

इस प्रोटोकॉल सरल और आसानी से लागू है। हालांकि, कुछ चरणों में अपनी सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं। सबसे महत्वपूर्ण कदम नाल से जरायु कोशिकाओं की सड़न रोकनेवाला अलगाव है। अपरा के लिए संग्रह तरीकों के कारण, इस तरह के माइकोप्लाज्मा के रूप में रोगाणुओं की संदूषण जोखिम अधिक है। इसलिए, कोशिकाओं के अलगाव के दौरान रोगज़नक़ परीक्षा और प्रबंधन बहुत महत्वपूर्ण हैं। साथ ही, प्रक्रियाओं के सभी aseptically किया जाना चाहिए। conditione का संग्रहमानव नाल कोशिकाओं की संस्कृति से घ मीडिया आम तौर पर आसान है। अपने को संभालने में कुछ हद तक मुश्किल है क्योंकि हालांकि, hPSC संस्कृतियों में अनुभव की जरूरत है। एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु के रूप में, इस प्रोटोकॉल का उपयोग शोधकर्ता ध्यान में रखना चाहिए कि इस प्रोटोकॉल में hPSCs की कुर्की के लिए आवश्यक समय के लोकप्रिय संस्कृति तरीकों (लगभग 24 घंटा) से (36-48 घंटा) रह गया है कि तथ्य यह है। यह अंतर hPSCs की व्यवहार्यता या प्रसार को प्रभावित नहीं करता है। इसके विपरीत, इस प्रोटोकॉल के अनुसार सुसंस्कृत hPSCs के विकास के पारंपरिक प्रोटोकॉल का उपयोग संवर्धित कोशिकाओं की तुलना में अधिक मजबूत है।

इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल वंश भेदभाव के शामिल होने के लिए आवेदन किया है। उदाहरण के लिए, भ्रूण रोगाणु कोशिकाओं की तरह या मूल कोशिकाओं मानव इस प्रोटोकॉल के आवेदन या संशोधन के द्वारा उपयोगी कोशिकाओं या ऊतकों में तब्दील किया जा सकता है। यह विभिन्न परिस्थितियों में विशिष्ट बहिर्जात की खुराक की पहचान करने के लिए एक और अधिक सुलभ मंच प्रदान करता है।इस प्रोटोकॉल की एक सीमा नाल अधिग्रहण पर hPCCM उत्पादन की निर्भरता है। इसलिए, एक सतत मानव नाल की आपूर्ति की जरूरत है।

यह अतिरिक्त बहिर्जात सिंथेटिक substrates के बिना hPSC प्रसार के लिए एक पूर्व vivo फीडर से मुक्त humanized वातावरण प्रदान करता है क्योंकि यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है। इस तकनीक के माहिर के बाद भविष्य के निर्देश जानवर और hPCCM में सुसंस्कृत hPSCs से प्राप्त उत्पादों के नैदानिक ​​अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है, और hPSCs के प्रसार और लगाव को प्रभावित करने वाले तंत्र को निर्धारित करने के लिए। इस hPCCM में hPSCs के सफल प्रचार के लिए पहली बार विस्तृत प्रोटोकॉल है। विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल स्टेम सेल अनुसंधान और उसके आवेदन और संबंधित निष्कर्षों के बारे में आगे के अध्ययन में नए क्षितिज खोल सकता warranted रहे हैं।

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Disclosures

लेखक ब्याज की कोई संघर्ष का संकेत मिलता है।

Acknowledgments

लेखकों अपरा ऊतक को उपलब्ध कराने के लिए जल्द ही-Cheol हांगकांग (एमडी, पीएच.डी., एसोसिएट प्रोफेसर, प्रसूति एवं स्त्री रोग विभाग, मेडिकल कॉलेज कोरिया विश्वविद्यालय) को धन्यवाद देना चाहूंगा। इस काम में कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ), कोरिया गणराज्य से अनुदान (R1211902) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mitomycin-C Sigma-Aldrich Corporation M4287 10 μg/ml
Mycoplasma detection kit TaKaRa Bio Inc. #6601
Matrigel BD Biosciences #354277
mTeSR1 STEMCELL Technologies Inc. #05850
Dispase Worthington Biochemical Corporation LS02100 1 mg/ml
Gelatin Sigma-Aldrich Corporation G2500 0.10%
BM-Cyclin Roche 799 050 10 μg/ml
RNeasy mini kit  Qiagen 74104
Nano Drop Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Inc
iQ SYBR Green qPCR Master Mix  Bio-Rad Laboratories #170-8882AP
ES Cell Characterization kit Chemicon International, Inc., SCR001
Power cDNA Synthesis Kit  iNtRON Biotechnology 25011
QIAamp® DNA Micro kit Qiagen 56304
AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit Applied Biosystems Inc. 4322288
Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer  Applied Biosystems Inc.

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References

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Jung, J. H., Kim, B. S. A Novel… More

Jung, J. H., Kim, B. S. A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media. J. Vis. Exp. (102), e53204, doi:10.3791/53204 (2015).

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