Protocol
بيان الأخلاق: وقد أجريت الدراسة المشيمة البشرية مستقبلا، مع موافقة مجلس المراجعة المؤسسية للبحوث البشري من جامعة كوريا (AN09085-001). أجريت جميع التجارب في-جرثومة الحرة منشأة غرفة نظيفة في المركز الطبي لجامعة كوريا. تمت الموافقة على تصميم والإجراءات باستخدام hPSCs التجريبي من قبل مجلس المراجعة المؤسسية من المركز الطبي في جامعة كوريا (AN12277-003).
1. إعداد الآلات، الثقافة وسائل الإعلام، وأطباق
- معطف جميع الأطباق الثقافة بنسبة 0.1٪ الجيلاتين. المالحة الأوتوكلاف الفوسفات مخزنة (PBS) وملقط. تعقيم مقص جراحي، أنابيب microcentrifuge، والشاش على 121 درجة مئوية تحت £ 15 رطل لمدة أكثر من 15 دقيقة.
- 0.25٪ التربسين الاثيلين أمين رباعي حمض الخل استعداد استعد مسبقا (التربسين-EDTA) واستعد مسبقا سائل الإعلام والثقافة تصفيتها (DMEM) تحتوي على 20٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 100 U / البنسلين مل، و 100 غرام / مل streptomycقبل البدء في الإجراءات.
2. عزل الخلايا من المشيمة البشرية
- الحصول على أنسجة المشيمة بعد ولادة قيصرية قسم الولادة، من النساء الحوامل صحية تمر الإجهاض الطبيعي أو العلاجي في 7-32 أسبوعا من الحمل بعد الحصول على الموافقة المسبقة الخطية.
- لدينا أخصائي الولادة المشيمة البشرية لوحات المشيمي منفصلة جراحيا (HPCS) من المشيمة. احتضان هذه في 0.25٪ التربسين-EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، ثم يغسل مع 5 مل PBS.
- عزل الزغابات المشيمية من HPCS باستخدام مقص. تخطر على الزغابات وغسلها ثلاث مرات مع 1ML PBS. بعد تنميق، ضع الزغابات المشيمية في أنبوب microfuge باستخدام طرف ماصة. غسل العينات مع 500 ميكرولتر PBS التي pipetting صعودا وهبوطا، وأنابيب الطرد المركزي لمدة 120 x ج لمدة 3 دقائق. غسل الأنسجة مرتين مع 500 ميكرولتر من قبل تحسنت مستنبت.
- خلايا الثقافة في المتوسط على لوحات الجيلاتين المغلفة في 37 ° C، في 5٪ CO 2
- تبادل المتوسطة كل 2-3 أيام حتى مرور الثالث. خلال الثقافة، وإزالة الحطام الخلية عائمة في مستنبت. وتزايد الخلايا الليفية الرحمية نعلق على طبق من ذهب. ثقافة الخلايا مثل الخلايا الليفية المستمدة من HPC حتى مرور 10 عشر ثم حصادها للثقافات HESC بعد trypsinization وميتوميسين-C (10 ميكروغرام / مل) العلاج.
- قبل التجميد HPCS كعينات الاسهم، استخدم عكس النسخ-البلمرة المتسلسل (RT-PCR) للتأكد من أن HPCS ليست ملوثة مع مسببات الأمراض التي تصيب عادة المشيمة، بما في ذلك الميكوبلازما (M. المخمرة، M. الأنافية الخنزيرية، M. ارجينين، M . الفويهى، M. اللعابية، M. هومينيس، M. للرئة، M. arthritidis، M. neurolyticum، M. hyopneumoniae،وM. capricolum) والأنواع البكتيرية، الميورة الحالة لليوريا، وذلك باستخدام مجموعة الكشف عن الميكوبلازما.
- اتبع تعليمات الشركة الصانعة لأداء RT-PCR، استخدم كل الاشعال ومخاليط المنصوص عليها في عدة. استخدام supernatants من الخلايا التي تم زراعتها لمدة 36 يوما للكشف عن الميكوبلازما. إضافة 3 ميكرولتر من هذه العينات لمخاليط PCR وتنفيذ الإجراء 1 ش PCR لمدة 35 دورات، يتألف كل منها من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
- إضافة بعناية 0.5 ميكرولتر من 1 الحادي PCR المنتج إلى خليط PCR وتنفيذ الإجراء 2 الثانية PCR لمدة 30 دورات باستخدام نفس الشروط كما كان من قبل. تحليل المنتجات تضخيمها من قبل 1٪ هلام الاغاروز الكهربائي. تطبيق 10 ميكرولتر من كل من شارع 1 و 2 الثانية المنتجات PCR إلى المواد الهلامية.
- إذا تم العثور على HPCS أن تكون ملوثة مع مسببات الأمراض، والقضاء على هذهباستخدام مزيج من المضادات الحيوية (BM-السيكلين)، باتباع إرشادات الشركة المصنعة. إضافة الوسيلة الجديدة التي تحتوي على 10 ميكروغرام / مل من BM-السيكلين 1 لمدة 3 أيام، ثم علاج الخلايا مع 5 ميكروغرام / مل BM-السيكلين 2 لمدة 4 أيام أخرى. كرر هذه الدورة مرتين ومن ثم التحقق من وجود تلوث الميكوبلازما مرة أخرى.
3. خلايا حصاد الإنسان المشيمة المستمدة مكيفة متوسط (hPCCM)
- بعد استبعاد التلوث، وعلاج الخلايا المرفقة (85-90٪ التقاء؛ (1.5 × 10 7 خلايا / قارورة) مع ميتوميسين-C (10 ميكروغرام / مل) لمدة 2 ساعة و 30 دقيقة، ويغسل خلايا ثلاث مرات مع 10 مل برنامج تلفزيوني. احتضان الخلايا مع المتوسط قبل تحسنت دون ميتوميسين-C لمدة 24 ساعة.
- بعد يوم واحد من العلاج، واحتضان خلايا في 10 مل المتوسطة (DMEM-F12 تستكمل مع 20٪ خروج المغلوب المصل استبدال [KOSR]، 0.1 ملم β المركابتويثانول، 1٪ NEAA، و 1٪ البنسلين ستربتومايسين). بعد 24 ساعة من الحضانة، والحصاد CM في أنبوب مخروطي 15 مل وتصفية CM باستخدام فلتر حقنة 0.22 ميكرون.
- إضافة 10 مل أخرى من الوسيلة الجديدة والحضانة. جمع كل supernatants من ثقافات كل يوم لمدة 1 أسبوع وتجميد المتوسطة تحصد في -80 ° C. تجنب تكرار تجميد أذاب دورات.
4. ثقافة الإنسان الخلايا الجذعية الجنينية (hESCs) وتحريض الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs)
- الحصول الجنينية خطوط الخلايا الجذعية البشرية، H1 و H9 الخلايا (المدرجة في التسجيل NIH HESC تحت اسم WA01 وWA09، على التوالي) والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة التوجيهية-1: الجذع (القلفة) -1 والتوجيهية 2 (IISH1i- BM) من معهد أبحاث معهد ويسيل (ماديسون، WI، الولايات المتحدة الأمريكية). يجب إذابة الخلايا ومثقف باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- لمجموعة المراقبة، وخلايا الثقافة على أطباق الغشاء القاعدي مصفوفة المغلفة في استخدامها على نطاق واسع تحديدا مستنبت حرة المصل خالية من وحدة التغذية وعند 37 درجة مئوية و5٪ CO 2. في البداية، البذور 80-100 كتل من hPSCs طن 35 ملم الأطباق. تنمو الخلايا في هذه الأطباق حتى 70-80٪ التقاء وبشكل روتيني خلايا مرور لمرة واحدة كل 5-6 أيام، وذلك باستخدام الطرق الميكانيكية أو الأنزيمية (Dispase)، زراعة الفرعية. غسل الخلايا مرتين مع المتوسط ومنها لوحة في نسبة 1: 4. استبدال المتوسطة مع المتوسطة الطازجة كل يوم.
- للمجموعات التجريبية، وخلايا الثقافة في hPCCM على الأطباق قبل المغلفة مع الجيلاتين 0.1٪ وأداء الركض روتيني مرة كل 5 أيام، إما ميكانيكيا أو إنزيمي. لوحة الخلايا في نسب في حدود 1: 6-1: 10. hPSCs نعلق على الجيلاتين داخل 2 يوما بعد النقل. استبدال المتوسطة مع المتوسطة الطازجة يوميا.
5. توصيف المحفزة الإنسان الخلايا الجذعية
ملاحظة: توصيف hPSCs باستخدام عدة طرق، مثل تلطيخ الفوسفاتيز القلوية، مناعية، الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QRT-PCR)، والنشاف الغربي.
- المناعي تلطيخ
- لimmunofluorescencالبريد تلطيخ، hPSCs ثقافة وإصلاح الخلايا في غرف الشريحة 8 جيدا مع 4٪ (ث / ت) لامتصاص العرق لمدة 10 دقيقة. ثم، permeabilized الخلايا بنسبة 0.1٪ (V / V) تريتون-X100 لمدة 15 دقيقة، ومنع الخلايا لمدة 1 ساعة مع 3٪ (V / V) مصل الحصان العادي في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ (V / V) Tween- 20. يغسل PBS مرتين لمدة 5 دقائق بين كل خطوة.
- احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية (OCT-4، SSEA4، TRA-1-81، TRA-1-60، التخفيف من 1: 1000) O / N عند 4 درجات مئوية ومع الأجسام المضادة الثانوية.
- قبل التركيب، واحتضان الخلايا مع 4، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي) لمدة 5 دقائق في الظلام. غسل الخلايا بشكل صارم ثلاث مرات لمدة 5 دقائق كل والجافة الخلايا تماما، في الظلام. الحفاظ على الخلايا في مضان المتوسطة المتزايدة وننظر إليها تحت المجهر مضان.
- QRT-PCR
- عزل الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا باستخدام عدة RNeasy مصغرة وفقا لمواصفات الشركة الصانعة وتحديد الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام نانو قطرة مقياس الطيف الضوئي. توليف [كدنا بإضافة 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع لتحتوي بنسبة ضئيلة 20 ميكرولتر خليط التفاعل (DT) الاشعال ومرتفع II عكس الناسخ. اتبع تعليمات الشركة الصانعة في هذا الإجراء.
- تضخيم كدنا] توليفها مع نظام معدل الذكاء بيو راد iCycler، وذلك باستخدام معدل الذكاء SYBR الأخضر QPCR ميكس ماجستير وتسلسل التمهيدي هو موضح في الجدول التكميلي S1. تطبيع القيم عتبة دورة من الجينات التي تهم تلك نازعة غليسيرألدهيد-3-فوسفات (GAPDH).
- الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) تلطيخ
- كشف النشاط AP باستخدام خلية ES توصيف كيت، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- في يوم 5، ونضح وسائل الإعلام وإصلاح hPSCs مع بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 12 دقيقة. لا overfix. وتحديد الخلايا لمدة تزيد عن 2 دقيقة يؤدي إلى تثبيط إنزيم الفوسفاتيز القلوية. نضح تثبيتي، وشطف مع 1X شطف العازلة. لاتسمح الآبار لتجف بين الخطوات.
- إضافة ما يكفي من حل تلطيخ لتغطية كل بئر (1 مل لكل بئر من صحن 35 ملم). احتضان لوحات في الظلام في RT لمدة 15 دقيقة.
- بعد الحضانة، وغسل الصحون مع 1X شطف العازلة. تغطية الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X لمنع جفاف ودراسة وصورة الخلايا الملون باستخدام مجهر أوليمبوس.
- البقعة الغربية
- إجراء تحليل لطخة غربية كما هو موضح سابقا في 9. لفترة وجيزة، وتحديد تركيزات البروتين في الخلية لست]. حل كميات متساوية من البروتين على دوديسيل الصوديوم وكبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (SDS-PAGE) جل ونقل البروتينات على غشاء البولي فينيل الفلوريد (PVDF).
- منع وصمة عار وتحقيق ذلك O / N مع الأجسام المضادة الأولية المختلفة في 4 ° C؛ في وقت لاحق احتضان وصمة عار مع الأجسام المضادة الثانوية HRP-مترافق لمدة 1 ساعة. يغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة في كل مرة بين حضانات. كشف الإشارات باستخدام كاشف ECL.
- قصيرة جنبا إلى جنب كرر (STR) تحليل
- كانت تحصد hPSCs من السيطرة والمجموعات التجريبية في نفس المقطع. تم استخراج DNA الجينومية باستخدام طقم DNA مايكرو، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- تضخيم الحمض النووي الجيني لمدة 16 المكاني وراثية مختلفة باستخدام أدوات AmpF / STR PCR التضخيم، وفقا لمواصفات الشركة الصانعة والكهربائي الشعري أجريت باستخدام محلل الوراثية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ومن مزايا هذه الطريقة نشر hPSC هو أنه يستخدم مكونات يفرز من خلايا الإنسان. والخطوة الأكثر ciritical في البروتوكول هو العزلة والثقافة من الخلايا المشتقة من المشيمة البشرية. وهذا يتطلب وتشريح دقيق من جزء محدد من HPC لوحة الزغب الشكل يظهر 1 إجراءات المستمدة من المشيمة البشرية العزلة الخلية. هذه العملية بسيطة ومريحة لعزل الخلايا، ويمكن أن تتم في غضون 1 ساعة. كما هو موضح في الشكل 2، والأنسجة تعلق على طبق وتشبه الخلايا الليفية الخلايا المغلفة الجيلاتين ظهرت بقوة. إزالة الأنقاض والأنسجة التالفة أثناء المقاطع التي trypsinization تتيح اختيار الخلايا ويضمن ثقافة متجانسة. هذه الخلايا يمكن استخدامها لإنتاج المتوسطة مشروط لhPSC انتشار بعد التأكد من عدم وجود تلوث. وقد تم تحديد الظروف المثلى كما، تلك التي سمحت الخلايا ليصل إلى 80-85٪ التقاء، وبعد ذلك عشرتم إيقاف نمو ه مصطنع (لا تظهر البيانات).
hPSCs مثقف على الخلايا المغذية أو مصفوفات الاصطناعية يمكن نقلها إلى أطباق المغلفة الجيلاتين في hPCCM الشكل 3 يدل على أن خطوط hPSC يمكن الحفاظ في hPCCM على مستوى مماثل لذلك الذي لوحظ لوحات Matrigel المغلفة (3A الشكل وB). لم uesd على 0.1٪ الجيلاتين للثقافة hPSC حتى الآن. في ظروفنا، توسعت hPSCs وحافظت تعدد القدرات، على غرار hPSCs في السيطرة على المجموعة. للتأكد من أن hPCCM الوصول المصفوفات الأخرى للثقافة hPSC، كانت hPSCs شبه مثقف على laminin، vitronectin وأطباق غير المغلفة. hPSC المرفقة ونمت في hPCCM على laminin- والأطباق المغلفة vitronectin. ومع ذلك، وبعد العديد من المقاطع، والتفريق بين العديد من المستعمرات ولم تحافظ، على عكس تلك الموجودة على مجموعة الجيلاتين المغلفة. بعد نقلها إلى أطباق غير المغلفة، لم يلاحظ أي مرفق لhPSCs (الشكل 3C). لجonfirm أن hPSCs كانت متطابقة وراثيا لمجموعة المراقبة بعد ثقافة على المدى الطويل في hPCCM، وقد تم تحليل hPSCs مثقف بالتوازي من المجموعتين عن استخدام تكرار جنبا إلى جنب قصيرة (STR) تقنية لمدة 16 مواضع الجيني (الشكل 3D وE).
هناك فكرة مقبولة على نطاق واسع وثقافة فيفو السابقين من hPSCs هي أن هناك حاجة bFGF لتعزيز التجديد الذاتي. في غياب bFGF، hPSCs تفقد قدرتها تجديد الذات وتفرق 12،13. في حالة hPCCM، لم hPSCs لا تفقد قدرتها التجديد الذاتي ومستقر أعرب علامات تعدد القدرات خلال ثقافة على المدى الطويل (الشكل 4A - C).
القدرة على التمايز إلى خلايا من 3 طبقات جرثومية هي سمة أصلية فريدة من hPSCs. يجب اختبار كل hPSC للتحقق من الحفاظ على هذه القدرة. كما هو مبين في الشكل (5)، hPSCs متباينة بشكل عفوي في الخليةالصورة من 3 طبقات جرثومية بعد 2 أسابيع من الاستقراء في hPCCM (5A الشكل وB). وتشير هذه البيانات إلى أن hPCCM هو الأمثل للاستخدام السريري.
الساعة المرفق على أطباق الجيلاتين المغلفة أثناء نقل hPSC أطول مما هو عليه على أطباق المغلفة مع مصفوفات الاصطناعية تجاريا لنشر hPSC. عادة، خلايا تعلق غضون يوم واحد بعد طلاء مع ركائز الاصطناعية. يبين الشكل 6 المرفق على الجيلاتين 0.1٪ وعلى لوحات التحكم. بعد 24 ساعة hPSCs شبه مثقف تعلق يزيد قليلا على الجيلاتين من على جهاز التحكم (الشكل 6A). وينبغي التعامل مع hPSCs بحذر. بعد 48 ساعة، وhPSCs تعلق تماما وبدأ التوسع على الأطباق المغلفة الجيلاتين (الشكل 6B). وعلاوة على ذلك، ظهرت hPSCs أن تنمو المستعمرات معبأة بشكل فعال وشكلت في يوم 5 بعد ثقافة فرعية على الجيلاتين (الشكل 6C). خلال الفترة المرفقات للhPSCs، المعامله دقيقةر مهم ويمكن أن تؤثر البقاء والتجديد الذاتي. في ظروف hPCCM، يوصى فترة 48 ساعة بقوة لمرفق من hPSCs.
الشكل 1: عزل خلية من المشيمة البشرية الزغابات المشيمية (A) وجرفت النسيج المشيمي المشيمة الطازجة في برنامج تلفزيوني بعد trypsinization. (B) وقطع الزوائد إلى قطع باستخدام مقص جراحي معقم. (C) الزوائد تم غسلها عدة مرات في برنامج تلفزيوني لإزالة الحطام والسفن. (D - E) تم نقل الزوائد إلى أنبوب الطرد المركزي الصغيرة، مفروم (كحد أقصى) وغسلها. تم طرد (F) الأنسجة باستخدام جهاز للطرد المركزي الطاولة. وتكرر (G) هذه العملية ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني ومرتين في قبل تحسنت مستنبت. (H) خلايا وكانت المصنفة الأنسجة معا على قبل المغلفة الجيلاتين القارورة وحضنت لمدة 5-7 أيام. الخلايا المرفقة وامتدت.
الشكل 2: زراعة الخلايا المشتقة من المشيمة البشرية (A) ما يقرب من 1 في الاسبوع بعد العزلة، أنسجة المشيمة البشرية والخلايا التي تعلق على قوارير المغلفة الجيلاتين وخلايا تشبه الخلايا الليفية ظهرت. (B) وبعد مرور أول فرعية، تم إزالة الأنسجة. تم استبدال المتوسطة من قبل متوسطة جديدة كل يوم. (C) بعد مرور الثالث، ظهرت الخلايا أكثر تجانسا. الحانات النطاق: 200 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
وفاق / ftp_upload / 53204 / 53204fig3.jpg "/>
الرقم 3: الإنسان خلايا الجذعية المحفزة في hPCCM على الأطباق المغلفة الجيلاتين بعد 13 الممرات، hPSCs، مثقف في hPCCM على أطباق الجيلاتين المغلفة، أظهرت ارتفاع الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) النشاط. كانت (A) H1 و iPSCs مثقف في ظروف التحكم (mTeSR1 على أطباق Matrigel المغلفة). تم مثقف (B) H1 و iPSCs في hPCCM على أطباق الجيلاتين المغلفة. غادر الفريق: حقل مشرق؛ اللوحة اليمنى: الفوسفاتيز القلوية تلطيخ. تم نقلها (C) H1 والتوجيهية ومثقف على عدة أطباق المغلفة مصفوفة للمقارنة. كما هو مبين، بعد كانت 5 مقاطع hPSCs مثقف. أطباق المغلفة Laminin، أطباق المغلفة vitronectin، أطباق غير المغلفة. (D - E) STR تحليل لhPSCs تربيتها في hPCCM مقارنة مع hPSCs السيطرة. الحانات النطاق: 10 ميكرون الرجاء جلعق هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4: لا يتطلب المحفزة الخلايا الجذعية البشرية نشر bFGF (A) H1 خلية تلوين المناعي مع أجسام مضادة ضد SSEA-4، OCT-4، SOX2، NANOG، TRA-1-60، وTRA-1-81 بعد 14 مقاطع على أطباق الجيلاتين المغلفة في hPCCM. شريط النطاق: 10 ميكرون. تم استخدام التحليل (B) RT-PCR لقياس التعبير عن علامات stemness، OCT4، NANOG، وRex1 في خطوط مختلفة من الخلايا في ظروف التجريبية والضابطة. (C) ومستويات البروتين التعبير عن علامات تعدد القدرات، OCT4، SOX2، وFGF2، في hPSCs تم تحديدها من قبل البقع الغربية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذه شملت رقمه.
الشكل 5: تحليل تعدد القدرات في المختبر. تم استخدام تحليل (A) QRT-PCR لقياس التعبير عن علامات stemness، OCT4 وNANOG والتعبير عن علامات طبقة ثلاثة الجرثومية في الخلايا المتمايزة وخلايا غير متمايزة نمت في ظروف hPCCM. كما هو مبين في الرسم البياني، وكانت القياسات المعيارية لمستويات التعبير التي لوحظت في الظروف الثقافة التحكم (OCT4) T، β HNF3: الأديم المتوسط، NESTIN، SOX1: الأديم الظاهر، لوكالة فرانس برس، GATA3: الأديم. وتشير أشرطة الخطأ وسائل ± SD. (B) H1 و خطوط التوجيهية التي كانت تربيتها لمدة 10 ممرات تحت ظروف تجريبية تشكيل هيئات مضغي بعد 2 أسابيع التي تحتوي على الأديم المتوسط (desmin)، الأديم الظاهر (TUJ1)،والأديم الباطن (ا ف ب، GATA4)، مقاسا تلوين المناعي. الحانات النطاق: 100 ميكرون، 200 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
نقلت مقارنة المرفق hPSC بين لوحين المغلفة مصفوفة H1 والتوجيهية-1 لظروف مختلفة، الجيلاتين 0.1٪ في hPCCM والمجموعة الضابطة: الرقم 6. (A) 1 بعد يوم hPSC الثقافة الفرعية. (B) بعد 2 أيام hPSC الثقافة الفرعية. (C) بعد 5 أيام hPSC الثقافة الفرعية. الحانات النطاق: 10 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تم تطوير هذا النموذج إلى نشر بنجاح hPSCs، مع الحفاظ على خصائصها، وأنسنة ظروف ثقافة خالية من التغذية بدون إضافة عوامل النمو المؤتلف خارجية مثل bFGF أو الأنسولين، مما يتيح التلاعب hPSCs في المكروية أنسنة. bFGF مكملات خارجي هو شائع وتطبيق الطبقات التحتية مثل Matrigel أو Laminin الحالي هو ضروري لتغذية خالية من زراعة من hPSCs 14.
هذا البروتوكول هو بسيط وسهل التنفيذ. ومع ذلك، بعض الخطوات الحاسمة لنجاحها. الخطوة الأكثر أهمية هو عزل العقيم من خلايا المشيمه من المشيمة. نظرا لطرق جمع لالمشيمة، وخطر التلوث من مسببات الأمراض مثل الميكوبلازما مرتفع. ولذلك، فحص الممرض والإدارة خلال عزل الخلايا مهمة جدا. بالإضافة إلى ذلك، كافة الإجراءات يجب أن يؤديها جو معقم و مطهر. جمع مكيفاتد وسائل الإعلام عن ثقافة خلايا المشيمة البشرية من السهل عموما. ومع ذلك، هناك حاجة إلى الخبرة في الثقافات hPSC بسبب تناولهم من الصعب إلى حد ما. باعتبارها نقطة أخرى مهمة، الباحث باستخدام هذا البروتوكول يجب أن نضع في الاعتبار أن حقيقة أن الوقت اللازم لإلحاق hPSCs في هذا البروتوكول هو أطول (36-48 ساعة) من الطرق الثقافة الشعبية (حوالي 24 ساعة). هذا الاختلاف لا يؤثر على بقاء أو انتشار hPSCs. على العكس من ذلك، فإن نمو hPSCs مثقف وفقا لهذا البروتوكول هو أقوى من أن الخلايا مثقف باستخدام بروتوكولات التقليدية.
وعلاوة على ذلك، فإن هذا البروتوكول لديه طلبات تحريض النسب التمايز. على سبيل المثال، الخلايا الجرثومية الجنينية تشبه أو الخلايا الاولية الإنسان يمكن أن تتحول إلى خلايا مفيدة أو الأنسجة من تطبيق أو تعديل هذا البروتوكول. أنه يوفر منصة أكثر سهولة لتحديد ملاحق خارجية محددة في ظروف متنوعة.واحد الحد من هذا البروتوكول هو الاعتماد الإنتاج hPCCM على اكتساب المشيمة. وبالتالي، هناك حاجة إلى إمدادات المشيمة البشري المستمر.
هذا البروتوكول هو مهم لأنه يوفر خارج الحي بيئة خالية من وحدة التغذية أنسنة لنشر hPSC دون ركائز الاصطناعية الخارجية إضافية. التوجهات المستقبلية بعد اتقان هذه التقنية يمكن تطبيقها على الدراسات السريرية المنتجات المشتقة من hPSCs مثقف في hPCCM الحيوانية و، وتحديد الآليات التي تؤثر على انتشار والحجز على hPSCs. وهذا هو أول بروتوكول مفصلة لنشر الناجح لhPSCs في hPCCM. والجدير بالذكر أن هذا البروتوكول قد يفتح آفاقا جديدة في مجال أبحاث الخلايا الجذعية وإجراء المزيد من الدراسات حول تطبيقاتها والنتائج المرتبطة هناك ما يبرر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وتشير المؤلفين جود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر قريبا تشيول كونج (MD، دكتوراه، أستاذ مشارك، قسم التوليد وأمراض النساء، جامعة كلية طب كوريا) لتوفير أنسجة المشيمة. وأيد هذا العمل في جزء من المنح (R1211902) من المؤسسة الوطنية للبحوث كوريا (جبهة الخلاص الوطني)، وجمهورية كوريا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich Corporation | M4287 | 10 μg/ml |
| Mycoplasma detection kit | TaKaRa Bio Inc. | #6601 | |
| Matrigel | BD Biosciences | #354277 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies Inc. | #05850 | |
| Dispase | Worthington Biochemical Corporation | LS02100 | 1 mg/ml |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Corporation | G2500 | 0.10% |
| BM-Cyclin | Roche | 799 050 | 10 μg/ml |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Nano Drop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc | ||
| iQ SYBR Green qPCR Master Mix | Bio-Rad Laboratories | #170-8882AP | |
| ES Cell Characterization kit | Chemicon International, Inc., | SCR001 | |
| Power cDNA Synthesis Kit | iNtRON Biotechnology | 25011 | |
| QIAamp® DNA Micro kit | Qiagen | 56304 | |
| AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit | Applied Biosystems Inc. | 4322288 | |
| Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems Inc. |
References
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
- Amit, M. C., Shakiri, V., Margulets, J. Itskovitz-Eldor Feeder layer and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biol Reprod. 70 (3), 837-845 (2004).
- Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).
- Jin, S., Yao, H., Weber, J. L., Melkoumian, Z. K., Ye, K. A synthetic, xeno-free peptide surface for expansion and directed differentiation of human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (11), e50880 (2012).
- Xu, R. H., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
- Xu, C., et al. Basic fibroblast growth factor supports undifferentiated human embryonic stem cell growth without conditioned medium. Stem Cells. 23 (3), 315-323 (2005).
- Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
- Park, Y., et al. Human feeder cells can support the undifferentiated growth of human and mouse embryonic stem cells using their own basic fibroblast growth factors. Stem Cells Dev. 20 (11), 1901-1910 (2011).
- Park, Y., et al. The efficacy of human placenta as a source of the universal feeder in human and mouse pluripotent stem cell culture. Cell Reprogram. 12 (3), 315-328 (2010).
- Park, Y., et al. Undifferentiated propagation of the human embryonic stem cell lines, H1 and HSF6, on human placenta-derived feeder cells without basic fibroblast growth factor supplementation. Stem Cells Dev. 19 (11), 1713-1722 (2010).
- Seok, K., et al. Human placenta-derived feeders support prolonged undifferentiated propagation of a human embryonic stem cell line, SNUhES3: comparison with human bone marrow-derived feeders. Stem Cells Dev. 16 (3), 421-428 (2007).
- Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
- Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
- Mahmood, A., Harkness, L., Schrøder, H. D., Abdallah, B. M., Kassem, M. Enhanced differentiation of stem cells mesenchymal progenitors by inhibition of TGF-beta/activin/nodal using SB-431542. J Bone Miner Res. 25 (6), 1216-1233 (2010).
