Protocol
Этика заявление: Исследование плаценты человеком был проведен перспективно, с одобрения Institutional Review Board в человеческой исследований Университета Кореи (AN09085-001). Все эксперименты проводились в чистом стерильном номер объекта в Медицинском центре Университета Кореи. Опытно-конструкторских и процедуры с использованием hPSCs были одобрены Институциональные наблюдательного совета Университета медицинского центра Корея (AN12277-003).
1. Подготовка инструментов, медиакультуры и блюда
- Пальто все культуры блюда с 0,1% желатина. Автоклав забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), и щипцы. Стерилизовать хирургические ножницы, микроцентрифужных трубки и марлю в 121 ° С при 15lb фунтов на квадратный дюйм в течение более чем 15 мин.
- Приготовленный подогретого 0,25% трипсина-этилен амин тетра-уксусную кислоту (трипсин-ЭДТА) и предварительно нагревают культуральную среду фильтруют (DMEM), содержащей 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл streptomycв перед началом процедуры.
2. Выделение клеток из плаценты человека
- Получить плацентарной ткани, после кесарева сечения, от здоровых беременных женщин, которым нормальный или терапевтического аборта на 7-32 недель беременности, после получения письменного информированного согласия.
- Имейте акушерской специалиста хирургическим отдельные человеческие плацентарные хориона пластины (HPCS) из плаценты; инкубировать их в 0,25% трипсин-ЭДТА при 37 ° С в течение 20 мин, а затем промывают 5 мл PBS.
- Изолировать хорионический ворсинки от HPCS с помощью ножниц; фарш ворсинки и мыть им три раза 1 мл PBS. После измельчения, место ворсин хориона в пробирке с использованием пипетки; мыть образцы с 500 мкл PBS с помощью пипетки вверх и вниз, и центрифуги трубки на 120 мкг в течение 3 мин. Промыть ткань дважды 500 мкл подогретого культуральной среде.
- Культуры клеток в среде на покрытые желатином пластин при 37 ° С, в 5% CO 2
- не Обменять среду каждые 2-3 дня до третьего прохода. Во культуры, удалением клеточного дебриса, плавающие в культуральной среде; растущие плацентарные фибробласты приложить к пластине. Культура фибробластов-подобные клетки, полученные из КВД до 10-го прохода, а затем собрать их для чЭСК культур после обработки трипсином и митомицин-C (10 мкг / мл) лечение.
- Перед замораживанием HPCS как образцы акции, использовать обратный транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), чтобы подтвердить, что HPCS не загрязнены патогенными микроорганизмами, которые обычно инфицируют через плаценту, в том числе микоплазмы (M. fermentans, М. М. hyorhinis, аргинина, м . Orale, М. salivarium, М. Hominis, М. pulmonis, М. arthritidis, М. neurolyticum, М. hyopneumoniae,и "М. capricolum) и видов бактерий, Ureaplasma urealyticum, с помощью набора определения микоплазмы.
- Следуйте инструкциям производителя, чтобы выполнить RT-PCR, использовать все праймеры и смесей, предусмотренные в комплекте. Используйте супернатантов клеток, которые были выращены в течение 36 дней для обнаружения микоплазм. Добавить 3 мкл этих образцов к ПЦР смеси и выполнять процедуру 1-й ПЦР в течение 35 циклов, каждый из которых состоит из 94 ° C в течение 30 сек, 55 ° С в течение 2 мин и 72 ° С в течение 1 мин.
- Осторожно добавляют 0,5 мкл 1-го продукта ПЦР с ПЦР-смеси и выполнить процедуру 2-й ПЦР в течение 30 циклов с использованием тех же условий, как и раньше. Анализ амплифицированных продуктов электрофорезом в 1% агарозном геле; применяют по 10 мкл каждого из 1-й и 2-й ПЦР-продуктов в гелях.
- Если HPCS находят, загрязнены патогенами, устранить ихиспользуя комбинацию антибиотиков (БМ-циклин), следуя инструкциям изготовителя. Добавить среде, содержащей 10 мкг / мл BM-циклин 1 в течение 3 дней, а затем обработать клетки с 5 мкг / мл БМ-циклин 2 в течение еще 4 дней. Повторите этот цикл в два раза, а затем проверить на загрязнение микоплазмой снова.
3. Сбор плаценты человека клеток, полученных кондиционированной среды (hPCCM)
- После исключения загрязнения, лечить прикрепленные клетки (85-90% слияния (1,5 × 10 7 клеток / колба) митомицином-C (10 мкг / мл) в течение 2 ч и 30 мин и промывают клеткам три раза с 10 мл PBS. Инкубируйте клетки с подогретого среде без митомицина-С в течение 24 ч.
- Через день после обработки, инкубировать клеток в 10 мл среды (DMEM-F12 с добавлением 20% нокаут-Serum Replacement [KOSR], 0,1 мМ β-меркаптоэтанола, 1% NEAA и 1% пенициллина-стрептомицина). После 24 часов инкубации, урожай см в 15-мл коническую пробирку ифильтровать см с помощью шприца 0,22 мкм фильтр.
- Добавить еще 10 мл новой среды и инкубации. Собирают все супернатантов из культур каждый день в течение 1 недели и заморозить собранного среду при -80 ° С. Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания.
4. Культура эмбриональных стволовых клеток человека (ЭСК) и индукции плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)
- Получить линий эмбриональных стволовых клеток человека, H1 и H9 клеток (перечисленные в реестре НИЗ чЭСК под названием WA01 WA09 и, соответственно) и индуцированной плюрипотентных стволовых клеток IPSC-1: IPS (крайняя плоть) -1 и IPSC-2 (IISH1i- БМ) из научно-исследовательского института WiCell (Madison, WI, USA). Клетки должны быть разморожены и культивируют в соответствии с инструкциями изготовителя.
- В контрольной группе, культуры клеток на базальной мембране Матрица покрытием блюд широко используется в питатель-свободным и бессывороточной культуральной среде определяется при 37 ° С и в 5% СО 2. Первоначально семян 80-100 скопления hPSCs яN 35-мм блюда. не расти клетки в этих блюд до 70-80% слияния и регулярно прохождения клеток к югу от культивирования раз в 5-6 дней, с использованием механических или ферментативные методы (диспазу). Промыть клетки дважды среды и пластины их в соотношении 1: 4. Заменить среду свежей средой каждый день.
- Для экспериментальных групп, культуры клеток в hPCCM на чашки, предварительно покрытые 0,1% желатином и рутинного пассирования раз в 5 дней, либо механически, либо ферментативно. Пластина клеток в соотношении в диапазоне от 1: 6-1: 10. hPSCs приложить к желатина в течение 2 дней после передачи. Ежедневно заменить среду свежей средой.
5. Характеристика человека плюрипотентных стволовых клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Охарактеризуйте hPSCs используя несколько методов, таких как щелочной фосфатазы окрашивания, иммуногистохимии, количественный ПЦР в реальном времени (ПЦР-Qrt), и вестерн-блоттинга.
- Окрашивание Иммунофлуоресценции
- Для immunofluorescencе окрашивания, культура hPSCs и фиксации клеток в камерах слайд 8-луночных с 4% (вес / объем) параформальдегида в течение 10 мин; Затем, проницаемыми клеток с 0,1% (об / об) Тритон-X100 в течение 15 мин, и блокировать клетки в течение 1 ч с 3% (объем / объем) нормального лошадиной сыворотки в PBS, содержащем 0,1% (об / об) Tween- 20. Вымойте PBS в два раза в течение 5 мин между каждым шагом.
- Инкубируйте клетки с первичными антителами (ОКТ-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, разведении 1: 1000) O / N при 4 ° С и с вторичным антителом.
- Перед установкой, инкубировать клетки 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в течение 5 мин в темноте. Вымойте клетки строго три раза в течение 5 мин каждый и сухие клетки полностью, в темноте. Сохранение клеток в среде флуоресценции монтажа и наблюдать их под флуоресцентным микроскопом.
- Qrt-ПЦР
- Изолировать общей РНК из клеток с использованием RNeasy мини комплект в соответствии с требованиями завода-изготовителя и количественно извлеченный РНК, используя Nano падения спектрофотометра. Синтезируют кДНК добавлением 2 мкг суммарной РНК с 20-мкл реакционной смеси, содержащей олиго (дТ) праймеры и Верхний II обратной транскриптазы; следуйте инструкциям изготовителя в этой процедуре.
- Amplify синтезированной кДНК с системой IQ Bio-Rad прибора Icycler, используя IQ SYBR Green КПЦР мастер смеси и грунтовки последовательности, описанные в таблице S1 Дополнительному. Нормализовать пороговые значения цикла генов, представляющих интерес для тех, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH).
- Щелочная фосфатаза окрашивание (AP)
- Обнаружение AP деятельность, используя ES Cell характеристика комплект, в соответствии с протоколом производителя.
- На 5-й день, аспирация СМИ и исправить hPSCs с 4% параформальдегидом в PBS в течение 12 мин. Не overfix; фиксации клеток в течение более 2 мин приведет к инактивации щелочной фосфатазы. Аспирируйте фиксатор и промыть 1x промывки буфером. Непозволяют скважин высохнуть между шагами.
- Добавьте достаточно окрашивания решение для покрытия каждую лунку (1 мл на лунку 35 мм блюдо). Планшеты инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин.
- После инкубации, мыть посуду с 1x промывки буфером. Обложка клетки с 1x PBS, чтобы предотвратить высыхание и изучить и изображения окрашенных клеток с использованием микроскопа Olympus.
- Вестерн-блот
- Выполнение Вестерн-блоттинга, как описано выше в 9. Вкратце, определения концентрации белка в клеточных лизатах. Решение равные количества белка на додецилсульфата натрия гель-электрофореза в полиакриламидном сульфат (SDS-PAGE) геля и передать на белки в поливинилиденфторид (ПВДФ) мембраны.
- Блок блот и исследовать его O / N с различными первичными антителами при 4 ° С; затем инкубируют блот с HRP-конъюгированные вторичные антитела в течение 1 часа. Вымойте мембраны три раза в течение 10 мин каждый раз между инкубации. Обнаружение сигналов с использованием реагента ECL.
- Краткое Повторите Тандем (STR) Анализ
- hPSCs собирали из контрольной и экспериментальной групп на том же отрывке. Геномную ДНК экстрагировали с помощью набора ДНК Micro, в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Amplify геномной ДНК для 16 различных генетических локусов, используя набор AMPF / STR ПЦР-амплификации, в соответствии с требованиями завода-изготовителя и капиллярного электрофореза проводили, используя генетический анализатор.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Одним из преимуществ этого метода распространения HPSC, что он использует компоненты, секретируемые из клеток человека. Наиболее ciritical шаг в протоколе является изоляция и культуры плацента-клеток, полученных человека. Это требует и точной рассечение от точного часть HPC пластины ворсинок. Рисунок 1 показывает процедуру выделения плаценты человека, полученных клеток. Этот процесс прост и удобен для выделения клеток, и может быть легко выполнена в течение 1 ч. Как описано на фиг.2, ткани прикреплены к покрытые желатином блюдо и фибробластоподобных клеток проросших энергично. Удаление мусора и гнилые тканей во время проходов по трипсинизации позволяет селекцию клеток и обеспечивает однородную культуру. Эти клетки могут быть использованы для получения кондиционированной среды для HPSC пролиферации после подтверждения отсутствие загрязнения. Оптимальные условия были определены как те, что позволило клеткам расти 80-85% слияния, после чего йРост электронной искусственно остановлен (данные не показаны).
hPSCs культивированные на клетках-фидерах или синтетических матриц могут быть переданы на покрытые желатином блюд в hPCCM. 3 видно, что HPSC линии могут быть сохранены в hPCCM на уровне, аналогичном тому, что наблюдается для Матригель-покрытых пластин (Фиг.3А и В). 0,1% желатина не была уезда для HPSC культуры до сих пор. В наших условиях, hPSCs расширен и поддерживается плюрипотентность, подобный hPSCs в контрольной группе. Чтобы подтвердить, что hPCCM обращались другие матрицы для культуры HPSC, hPSCs субкультивировали на ламинином, витронектин и блюд без покрытия. HPSC прилагается и вырос в hPCCM на laminin- и витронектином покрытием блюд. Тем не менее, после нескольких пассажей, многие колонии были дифференцированы и не поддерживать, в отличие от тех, на желатин покрытием группы. После передачи в непокрытых блюд, никакой привязанности не наблюдалось hPSCs (рис 3C). Для Confirm что hPSCs были генетически идентичны с контрольной группой после длительного культуры в hPCCM, hPSCs культивированный параллельно из обеих групп были проанализированы с помощью короткого повтора тандем (STR) технику для 16 локусов генома (рис 3D и E).
Широкое признание понятие о экс естественных условиях культуры hPSCs что оФРФ необходима для продвижения самообновление. При отсутствии оФРФ, hPSCs теряют самообновлению способность и дифференцировать 12,13. В состоянии hPCCM, hPSCs не теряют самообновлению способность и стабильно выразил плюрипотентности маркеры во время долгосрочного культуры (рис 4А - C).
Возможность дифференциации в клетки 3 зародышевых листков является уникальным внутренней характеристикой hPSCs. Каждый HPSC должны быть проверены, чтобы убедиться, сохранение этой способности. Как показано на рисунке 5, hPSCs спонтанно дифференцироваться в клетких слоев 3 зародышевых после 2 недель индукции в hPCCM (рис 5А и В). Эти данные указывают на то, что hPCCM является оптимальным для клинического применения.
Время привязанность на покрытые желатином блюд во время передачи HPSC больше, чем на блюдах, покрытых коммерчески синтетических матриц для распространения HPSC. Как правило, клетки прикреплены в день после покрытия синтетических субстратов. Рисунок 6 показывает привязанность на 0,1% желатина и на контрольных пластин. Через 24 часа субкультивироваться hPSCs присоединены немного более, чем на желатине на управления (6А). hPSCs должны быть обработаны с осторожностью. Через 48 ч hPSCs были полностью присоединены и начал расширение на покрытые желатином блюд (фиг.6В). Кроме того, появились hPSCs расти эффективно и формируется упакованные колонии на 5 день после суб-культуры на желатин (рис 6C). В период привязанности к hPSCs, тщательных ЛЕЧЕНИИт имеет важное значение и может влиять на выживание и самообновление. В условиях hPCCM, период 48 ч настоятельно рекомендуется для крепления hPSCs.
Рисунок 1: изоляторе из плаценты человека хорионического ворсинок () Свежий плаценты хорионический ткань промывают в PBS, после обработки трипсином.. (Б) ворсинки были разрезаны на куски с использованием стерильных хирургических ножниц. (С) Вилли промывали несколько раз в PBS для удаления мусора и сосуды. (D - Е) Вилли были переведены в микро-центрифужную пробирку, фарш (максимум) и промывают. (F) Ткани центрифугировали при помощи настольной центрифуге. (G) Этот процесс повторяли три раза в PBS и два раза в подогретого культуральной среде. (H) Клетки и ткани высевали вместе на предварительно покрытые желатином колбу и инкубируют в течение 5-7 дней. Клетки прилагается и проросли.
Рисунок 2: Выращивание плацента-клеток, полученных человека () Приблизительно через 1 неделю после изоляции, тканей человека плацента и клетки, прикрепленные к покрытые желатином колб и фибробластоподобных клеток проросших.. (B) После первого прохода субкультуры, ткани были удалены. Среду заменяли свежей средой через день. (С) после третьего пассажа, клетки оказались более однородным. Масштабные бары:. 200 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
ES / ftp_upload / 53204 / 53204fig3.jpg "/>
Рисунок 3:. Человек плюрипотентные стволовые клетки в hPCCM на покрытые желатином блюд После 13 проходов, hPSCs, культивируемых в hPCCM на покрытые желатином блюд, имели высокий щелочной фосфатазы (AP) деятельности. () H1 и иПСК культивировали в условиях контроля (mTeSR1 на блюдах Матригель покрытием). (Б) H1 и иПСК культивировали в hPCCM на покрытые желатином блюд. Левая панель: светлое поле; Правая панель: щелочная фосфатаза окрашивание. (С) H1 и Ipsc переносили и культивировали на нескольких матричных покрытием блюд для сравнения. Как показано, после 5 пассажей hPSCs культивировали. ЛАМИНИНА покрытием посуда, витронектин покрытием блюда, не покрытые блюда. (D - E) УЛ анализ hPSCs культивировали в hPCCM по сравнению с контрольными hPSCs. Масштабные бары:. 10 мкм Пожалуйста, грлизать здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4:. Человек плюрипотентных стволовых клеток распространения не требует оФРФ () H1 клеток окрашивание иммунофлюоресценции с антителами против SSEA-4, октябрь-4, SOX2, NANOG, TRA-1-60, TRA-и 1-81 после 14 проходов на покрытые желатином блюда в hPCCM. Масштабная линейка: 10 мкм. Анализ (Б) ОТ-ПЦР использовали для измерения экспрессию маркеров стволовости, Oct4, NANOG и Rex1 в различных клеточных линий в экспериментальных и контрольных условиях. (C) уровни экспрессии белка маркеров плюрипотентности, OCT4, Sox2 и FGF2, в hPSCs были определены западных пятнами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 5: Анализ плюрипотентности в пробирке. Анализ (А) QRT-ПЦР использовали для измерения экспрессию маркеров, стволовости OCT4 и NANOG и экспрессию трех зародышевых слоев маркеров в дифференцированных клетках и недифференцированные клетки, выращенные в условиях hPCCM. Как показано на графике, измерения были нормированы на уровни экспрессии наблюдались в условиях контрольной культуре (Oct4) Т, HNF3 β:. Мезодерма, Nestin, Sox1: эктодермы, AFP, GATA3: эндодермы. Столбики ошибок указывают средства ± SD. (B), H1 и IPSC линий, которые культивировали в течение 10 пассажей в экспериментальных условиях, сформированных эмбриональные тельца после 2 недель, что содержащиеся мезодермы (Desmin), эктодермы (TUJ1),и энтодерма (АФП, GATA4), как измерено иммунофлуоресцентного. Масштабные бары:. 100 мкм, 200 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6:. Сравнение привязанности HPSC между двумя пластинами матричных покрытием H1 и IPSC-1 были переданы различным условиям, 0,1% желатина в hPCCM и контрольная группа. (А) через 1 день после HPSC субкультуры. (В) через 2 дня после HPSC субкультуры. (С) через 5 дней после HPSC субкультуры. Масштабные бары:. 10 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта модель была разработана, успешно распространяться hPSCs, сохраняя их характеристики, в гуманизированных фидерных свободных условиях культивирования без добавления экзогенных рекомбинантных факторов роста, таких как оФРФ или инсулина, что позволяет манипулировать hPSCs в гуманизированного микросреды. Экзогенный добавок оФРФ является общим и применение субстратов, таких как Matrigel или ламинином имеет важное значение для подачи свободной культивирования hPSCs 14.
Этот протокол является простым и легким в реализации. Тем не менее, некоторые шаги имеют решающее значение для его успеха. Наиболее важным шагом является асептический изоляция хориона клеток из плаценты. Благодаря методов сбора для плаценты, риск загрязнения патогенов, таких как микоплазмы высока. Таким образом, возбудитель обследование и управление во время выделения клеток, очень важны. Кроме того, все процедуры должны быть выполнены асептически. Коллекция conditioneд СМИ от культуры плаценты клеток человека, как правило, легко. Тем не менее, опыт работы в HPSC культур необходима, потому что их обработка довольно трудно. Как еще один важный момент, исследователь, используя этот протокол должен иметь в виду, что тот факт, что время, необходимое для крепления hPSCs в этом протоколе длиннее (36-48 ч), чем популярных методов культивирования (примерно 24 ч). Это различие не влияет на жизнеспособность или распространения hPSCs. Напротив, рост hPSCs культивируют в соответствии с этим протоколом является более надежной, чем клетки, культивируемые с использованием обычных протоколов.
Кроме того, этот протокол имеет приложения для индукции дифференциации клонов. Например, человек эмбриональные зародышевые клетки, как и клетки-предшественники могут быть превращены в полезные клеток или тканей путем применения или модификации данного протокола. Это обеспечивает более доступную платформу для выявления конкретных экзогенные добавки в различных условиях.Одним из ограничений этого протокола является зависимость hPCCM производства на приобретение плаценты. Таким образом, непрерывная подача плацента человеческая необходим.
Этот протокол является важным, поскольку оно дает экс естественных условиях подачи свободной гуманизированную среду для распространения HPSC без дополнительных экзогенных синтетических субстратов. Будущие направления после освоения этой техники может быть применен к животному и клинических исследований продуктов, полученных из культивируемых в hPSCs hPCCM, и определить механизмы, влияющие на пролиферацию и крепление hPSCs. Это первое подробное протокол для успешного распространения hPSCs в hPCCM. Примечательно, что это протокол может открыть новые горизонты в исследовании стволовых клеток и других исследований, касающихся ее применения и связанных с ними выводов являются оправданными.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы указывают на отсутствие конфликтов интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить скоро Чхоль Хон (MD, Ph.D., доцент кафедры акушерства и гинекологии, Медицинский колледж Университет Кореи) для обеспечения плацентарной ткани. Эта работа была частично поддержана грантами (R1211902) из Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), Республика Корея.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich Corporation | M4287 | 10 μg/ml |
| Mycoplasma detection kit | TaKaRa Bio Inc. | #6601 | |
| Matrigel | BD Biosciences | #354277 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies Inc. | #05850 | |
| Dispase | Worthington Biochemical Corporation | LS02100 | 1 mg/ml |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Corporation | G2500 | 0.10% |
| BM-Cyclin | Roche | 799 050 | 10 μg/ml |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Nano Drop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc | ||
| iQ SYBR Green qPCR Master Mix | Bio-Rad Laboratories | #170-8882AP | |
| ES Cell Characterization kit | Chemicon International, Inc., | SCR001 | |
| Power cDNA Synthesis Kit | iNtRON Biotechnology | 25011 | |
| QIAamp® DNA Micro kit | Qiagen | 56304 | |
| AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit | Applied Biosystems Inc. | 4322288 | |
| Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems Inc. |
References
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
- Amit, M. C., Shakiri, V., Margulets, J. Itskovitz-Eldor Feeder layer and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biol Reprod. 70 (3), 837-845 (2004).
- Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).
- Jin, S., Yao, H., Weber, J. L., Melkoumian, Z. K., Ye, K. A synthetic, xeno-free peptide surface for expansion and directed differentiation of human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (11), e50880 (2012).
- Xu, R. H., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
- Xu, C., et al. Basic fibroblast growth factor supports undifferentiated human embryonic stem cell growth without conditioned medium. Stem Cells. 23 (3), 315-323 (2005).
- Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
- Park, Y., et al. Human feeder cells can support the undifferentiated growth of human and mouse embryonic stem cells using their own basic fibroblast growth factors. Stem Cells Dev. 20 (11), 1901-1910 (2011).
- Park, Y., et al. The efficacy of human placenta as a source of the universal feeder in human and mouse pluripotent stem cell culture. Cell Reprogram. 12 (3), 315-328 (2010).
- Park, Y., et al. Undifferentiated propagation of the human embryonic stem cell lines, H1 and HSF6, on human placenta-derived feeder cells without basic fibroblast growth factor supplementation. Stem Cells Dev. 19 (11), 1713-1722 (2010).
- Seok, K., et al. Human placenta-derived feeders support prolonged undifferentiated propagation of a human embryonic stem cell line, SNUhES3: comparison with human bone marrow-derived feeders. Stem Cells Dev. 16 (3), 421-428 (2007).
- Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
- Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
- Mahmood, A., Harkness, L., Schrøder, H. D., Abdallah, B. M., Kassem, M. Enhanced differentiation of stem cells mesenchymal progenitors by inhibition of TGF-beta/activin/nodal using SB-431542. J Bone Miner Res. 25 (6), 1216-1233 (2010).
