Protocol
倫理文：ヒト胎盤研究は、高麗大学（AN09085-001）の人間の研究のための施設内倫理委員会の承認を得て、将来に向かって行きました。すべての実験は、高麗大学医療センターのクリーン無菌室の施設で行われました。 hPSCsを用いた実験の設計および手順は高麗大学医療センターの施設内倫理委員会（AN12277-003）によって承認されました。
楽器、文化メディア、および料理の作製
- 0.1％ゼラチンでコーティングすべての培養皿。オートクレーブリン酸緩衝生理食塩水（PBS）と鉗子。手術用はさみ、微量遠心管、および15分以上のための15ポンドのPSIの下で121℃でガーゼを滅菌します。
- 20％ウシ胎児血清（FBS）、100 U / mlペニシリン、100グラム/ mlを含む調製予め温めた0.25％トリプシン - エチレンアミン四酢酸（トリプシンEDTA）及び予熱濾過培地（DMEM） streptomyc手順を開始する前に。
ヒト胎盤から2細胞の単離
- 書面によるインフォームドコンセントを得た後、妊娠7-32週で正常または治療的流産を受けた健康な妊婦から、帝王切開の出産後、胎盤組織を取得します。
- 胎盤から産科専門外科の別々のヒト胎盤絨毛プレート（HPCの）を持っています。 37℃で20分間、0.25％トリプシン-EDTAでこれらをインキュベートし、次いで5 mlのPBSで洗浄します。
- はさみを使用してのHPCから絨毛を隔離。絨毛をミンチし、1ミリリットルPBSでそれらを3回洗浄します。ミンチした後、ピペットチップを使用して、マイクロチューブの中に絨毛を置きます。上下にピペッティングにより500μlのPBSでサンプルを洗浄し、3分間120×gでのためにチューブを遠心します。予め温めた培地500μlので二回組織を洗ってください。
- 37℃、5％CO 2でゼラチンコーティングしたプレート上で培地中の培養細胞
- 第3通路まで2〜3日ごとに培地を交換します。培養中、培養液中に浮遊する細胞の破片を除去します。成長胎盤線維芽細胞はプレートに取り付けます。文化その後、10 番目の通路にHPCまでに由来し、線維芽細胞様細胞は、トリプシン処理し、マイトマイシンC（10 / mlの）治療後のhESC培養物のためにそれらを収穫します。
- ストックサンプルとしてのHPCを凍結する前に、のHPCは、通常（M.·ファー、M.のヒオリニス、M.アルギニン、Mがマイコプラズマを含む胎盤、感染性病原体に汚染されていないことを確認するために逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を使用し。orale、M.のsalivarium、M.ホミニス、M.プルモニス、M.のarthritidis、M.のneurolyticum、M。ハイオニューモニエ、とM.カプリコラム ）および細菌種、 ウレアプラズマリティクム 、マイコプラズマ検出キットを使用します。
- RT-PCRを実行するための製造元の指示に従って、キットで提供されるすべてのプライマーとの混合物を使用しています。マイコプラズマ検出のための36日間培養された細胞の上清を使用してください。 PCR混合物にこれらのサンプルの3μlを添加して、35サイクルの1 回目のPCR手順を実行し、30秒間、94℃から成るそれぞれ、55℃で2分間、および72℃で1分間。
- 慎重にPCR混合物に1 回目のPCR産物を0.5μlを添加し、前と同じ条件を用いて、30サイクルの2 回目のPCR手順を実行します。 1％アガロースゲル電気泳動により増幅産物を分析します。ゲルに第 1および第 2 回目のPCR産物の各10μlのを適用します。
- のHPCは、病原体に汚染されることがわかっている場合は、これらを排除します製造者の指示に従って、抗生物質（BM-サイクリン）の組み合わせを使用して。 3日間BM-サイクリン110μg/ mlを含む新しい培地を追加し、さらに4日間5μg/ mlのBM-サイクリン2で細胞を処理します。 2回のサイクルを繰り返してから、再度マイコプラズマ汚染を確認してください。
ミディアム馴化3.収穫ヒト胎盤由来細胞（hPCCM）
- 汚染を除外した後、付着した細胞（85〜90％コンフルエンス治療; 2時間30分間マイトマイシンC（10μg/ ml）で（1.5×10 7細胞/フラスコ）を、10 mlの細胞を3回洗浄しPBSを24時間マイトマイシンCなしで予め温めた培地で細胞をインキュベートします。
- 処理の1日後に、10ミリリットル培地中の細胞をインキュベート（DMEM-F12が20％ノックアウト血清代替[KOSR]を補充し、0.1ミリモルのβメルカプトエタノール、1％NEAA、及び1％ペニシリン - ストレプトマイシン）。インキュベーションの24時間後、15 mlのコニカルチューブで収穫CMと0.22μmのシリンジフィルターを使用してCMをフィルタリングします。
- 新しいメディアとのインキュベーションの別の10ミリリットルを追加します。 1週間毎日培養物から全ての上清を収集し、-80℃で回収培地を凍結します。凍結融解を繰り返さないでください。
4.培養ヒトの胚性幹細胞（ヒトES細胞）および多能性幹細胞の誘導（性IPSC）
- ヒト胚性幹細胞株を取得し、（それぞれ、名前WA01とWA09の下でNIHのhESCレジストリに記載されている）H1およびH9細胞および誘導多能性幹細胞iPS細胞-1：のiPS（包皮）-1とiPS細胞-2（IISH1i- WiCell研究所（マディソン、WI、USA）からのBM）。細胞を、製造者の指示に従って解凍し、培養されるべきです。
- 対照群では、37°C で広く使用されているフィーダーを含まない無血清の規定された培地中で基底膜マトリックスでコーティングされた皿上で、5％CO 2で培養細胞。最初は、hPSCs私の80-100塊をシードnは35-mmディッシュ。機械的または酵素的方法（ディスパーゼ）を使用して、すべての5~6日に1回継代培養用の70〜80％コンフルエンスと日常的継代細胞まで、これらの皿で細胞を増殖させます。培地で細胞を2回洗浄し、1：1の割合でそれらをプレート：4。毎日新鮮な培地で培地を交換してください。
- 実験群では、皿上hPCCMで培養細胞を0.1％ゼラチンで予めコーティングし、5日ごとに一度ルーチン継代を行い、機械的または酵素的に。 6-1：10 1の範囲の比率でプレート細胞。 hPSCsは、転送後2日以内にゼラチンに接続します。毎日新鮮な培地で培地を交換してください。
ヒト多能性幹細胞の5キャラクタリゼーション
注：アルカリホスファターゼ染色、免疫組織化学、定量的リアルタイムPCR（QRT-PCR）、およびウェスタンブロッティングなどのいくつかの方法を用いてhPSCsを特徴付けます。
- 免疫蛍光染色
- immunofluorescenc用E染色、培養hPSCsと10分間、4％（w / v）のパラホルムアルデヒドを用いて8ウェルチャンバースライド中の細胞を固定します。次に、（v / v）のトリトンX100を15分間、0.1％を含有するPBS中の3％（v / v）の正常ウマ血清と1時間、細胞をブロック（v / v）の0.1％で細胞を透過処理Tween- 20。すべてのステップの間に5分間のPBSで二回洗浄します。
- 4℃、二次抗体を用いて、O / N：一次抗体（千OCT-4、SSEA4、TRA-1-81、TRA-1-60、1の希釈）で細胞をインキュベートします。
- 取り付けの前に、暗所で5分間、4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で細胞をインキュベートします。暗闇の中で、完全に5分間、細胞を厳密に3回ずつ、乾燥細胞を洗浄します。蛍光マウンティング培地中で細胞を維持し、蛍光顕微鏡下に観察します。
- 定量RT-PCR
- 製造業者の仕様書に従ってRNeasyミニキットを用いて細胞から全RNAを分離し、ナノドロップ分光光度計を用いて抽出したRNAを定量化します。 オリゴ（dT）プライマーおよびSuperscript II逆転写酵素を含む20μlの反応混合液に2μgの全RNAを添加することによりcDNAを合成。この手順では、製造元の指示に従ってください。
- のiQ SYBRグリーン定量PCRマスターミックスと補足表S1に記載されたプライマー配列を用いて、Bio-Rad社のiCycler iQのシステムを用いて合成されたcDNAを増幅します。グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）のものに目的の遺伝子のサイクル閾値の値を正規化します。
- アルカリホスファターゼ（AP）染色
- 製造業者のプロトコルに従って、ES細胞の特徴付けキットを使用して、AP活性を検出。
- 5日目に、培地を吸引し、12分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒドでhPSCsを修正。 overfixないでください。より長い2分間細胞を固定すると、アルカリホスファターゼの不活性化をもたらします。固定液を吸引し、1×リンスバッファーですすいでください。しないウェルを工程間乾燥させます。
- 各ウエル（35mm皿のウェルあたり1ml）にカバーするのに十分な染色液を加えます。室温で15分間、暗所でプレートをインキュベートします。
- インキュベーション後、1×リンスバッファーで皿を洗います。オリンパス顕微鏡を用いて染色された細胞の乾燥を防止し、検査し、画像ために、1×PBSで細胞を覆います。
- ウエスタンブロット法
- 以前に9で説明したようにウェスタンブロット分析を行います。簡潔には、細胞溶解物中のタンパク質濃度を決定します。ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）ゲル上で等量のタンパク質を解決し、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜上にタンパク質を移します。
- ブロットをブロックし、4℃で、異なる一次抗体/ O Nをそれを調べます。その後、1時間HRP結合二次抗体でブロットをインキュベートします。 10分のインキュベーションの間の各時間のために、膜を3回洗浄します。 ECL試薬を使用して信号を検出します。
- 短いタンデムリピート（STR）分析
- hPSCsは、同じ通路で対照群と実験群から採取しました。ゲノムDNAは、製造業者の説明書に従って、DNAマイクロキットを用いて抽出しました。
- メーカーの仕様およびキャピラリー電気泳動によると、AmpF / STR PCR増幅キットを使用して16個の異なる遺伝子座についてのゲノムDNAを増幅すると、遺伝子解析装置を用いて行きました。
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Representative Results
このHPSC伝搬法の1つの利点は、ヒト細胞から分泌されたコンポーネントを使用することです。プロトコルの中で最もciriticalステップは、ヒト胎盤由来細胞の単離および培養です。これは、HPC板絨毛の正確な部分から必要とし、正確な解剖。 図1は、ヒト胎盤由来細胞を単離するための手順を示しています。このプロセスは、細胞の単離のための簡単で便利であり、かつ容易に1時間以内に行うことができます。 図2で説明したように、ゼラチンコートディッシュおよび線維芽細胞様細胞に付着した組織を確実に発芽しました。トリプシン処理により継代中に破片や腐った組織の除去は、細胞の選択を可能にし、均質な文化を保証します。これらの細胞は、汚染がないことを確認した後のHPSCの増殖のための馴化培地を産生するために使用することができます。最適条件は、その目の後、細胞は80から85までパーセントの集密度まで増殖させたものとして定義しました。E成長は人為的（データは示さず）を停止させました。
フィーダー細胞または合成マトリックス上で培養hPSCsはhPCCMでゼラチン被覆皿に移すことができる。 図3は、HPSC線はマトリゲルコーティングプレート（ 図3AおよびB）について観察されたものと同様のレベルでhPCCMに維持することができることを示す図 。 0.1％のゼラチンは、これまでHPSC培養にuesdされていません。私たちの条件では、hPSCsは拡大し、対照群ではhPSCsと同様の多能性を維持しました。 hPCCMはHPSC培養に他のマトリックスにアクセスしたことを確認するには、hPSCsは、ラミニン、ビトロネクチンおよび非コートディッシュ上で継代培養しました。 HPSCが取り付けられ、ラミニンおよびビトロネクチンでコーティングしたディッシュ上hPCCMに生えていました。しかし、いくつかの継代後、多くのコロニーを分化させて、ゼラチンコート基上のものとは異なり、維持されませんでした。非コートディッシュに移した後、何のアタッチメントはhPSCs（ 図3C）は観察されませんでした。 Cへonfirm hPSCsがhPCCMで長期培養後の対照群と遺伝的に同一であったことを、両群から並列で培養hPSCsは、16のゲノム遺伝子座（ 図3DおよびE）は、短いタンデムリピート（STR）技術を用いて分析しました。
hPSCs のex vivo培養に関して広く受け入れられている考え方は、bFGFが自己再生を促進するために必要とされることです。 bFGFの不在下では、hPSCsは、その自己再生能力を失い、12,13を区別します。 hPCCM条件では、hPSCsは、その自己複製能力を失わなかったと安定長期培養（ 図4A - C）中に多能性マーカーを発現しました。
3胚葉の細胞に分化する能力は、hPSCsのユニークな本質的な特徴です。すべてのHPSCは、この能力の保存を確認するためにテストする必要があります。 図5に示すように、hPSCsは自発的に細胞に分化しますhPCCM（ 図5AおよびB）における誘導の2週間後の3胚葉の秒。これらのデータは、hPCCMは、臨床使用のために最適であることを示しています。
HPSC転送時のゼラチンコートディッシュ上の付着時間は、HPSCの伝播のための商業的に合成マトリックスでコーティングされた皿上でより長いです。通常、合成基質を用いて塗布した後日以内に付着した細胞は、0.1％ゼラチン上と対照プレート上を図6に示す添付図 。 24時間後に継代培養hPSCsは、コントロール（ 図6A）に比べてゼラチンにやや取り付けられています。 hPSCsは注意して処理する必要があります。 48時間後、hPSCsは完全に取り付けられており、ゼラチンコートディッシュ（ 図6B）の展開を始めましたました。また、hPSCsは、ゼラチンのサブカルチャー（ 図6C）の後5日目に効果的に形成された充填されたコロニーを成長させるために登場しました。 hPSCs、慎重treatmenための取付け期間中tは重要であり、生存及び自己再生に影響を与えることができます。 hPCCM条件では、48時間の期間が強くhPSCsの装着を推奨します。
図1：ヒト胎盤絨毛からの細胞の単離（A）新鮮な胎盤絨毛組織をトリプシン処理した後、PBS中で洗浄しました。 （B）絨毛は、滅菌外科用はさみを使用して小片に切断しました。 （C）絨毛の破片及び血管を除去するためにPBSで数回洗浄しました。 （D - E）絨毛は、微小遠心管、ミンチ（最大）に移し、洗浄しました。 （F）組織を卓上遠心機を用いて遠心分離しました。 （G）、この処理は、予め温めた培地中でPBS中で3回と2回繰り返しました。 （H）細胞そして組織をプレコーティングゼラチンフラスコに一緒に播種し、5〜7日間インキュベートしました。細胞が付着し発芽しました。
図2：ヒト胎盤由来細胞の培養（A）の単離後、約1週間、発芽ゼラチンコートフラスコおよび線維芽細胞様細胞に付着したヒト胎盤組織および細胞。 （B）最初の継代培養の経過後、組織を除去しました。培地は一日おきに新鮮な培地と交換しました。 （C）は、第3継代後、細胞はより均一に見えました。スケールバー：200μmで、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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図3：ゼラチンコートディッシュ上hPCCMでヒト多能性幹細胞 13継代後、ゼラチンコートディッシュ上hPCCMで培養hPSCsは、高アルカリホスファターゼ（AP）活性を示しました。 （A）H1およびiPS細胞は、対照条件（マトリゲルでコーティングしたディッシュ上mTeSR1）中で培養しました。 （B）H1と性IPSCは、ゼラチンコートディッシュ上hPCCM中で培養しました。左パネル：明視野;右パネル：アルカリホスファターゼ染色。 （C）H1およびiPS細胞は、比較のために、いくつかのマトリックスでコーティングされた皿に移し、培養しました。 5通路hPSCsを培養した後のように、示さ。ラミニンコートディッシュ、ビトロネクチンでコーティングされた皿、非コーティングされた料理を提供しています。 （D - E）コントロールhPSCsと比較hPCCMで培養しhPSCsのためのSTR分析。スケールバー：10μmである。 してくださいCこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをなめます。
図4：14継代後SSEA-4、OCT-4、SOX2、NANOG、TRA-1-60、およびTRA-1-81に対する抗体を用いたヒト多能性幹細胞の増殖がbFGFのを必要としない（A）H1細胞免疫蛍光染色hPCCM中のゼラチンコートディッシュに。スケールバー：10μmです。 （B）RT-PCR分析は、OCT4、NANOG、およびRex1の実験および対照条件の異なる細胞株において、幹細胞性マーカーの発現を測定しました。 （C）多能性マーカーのタンパク質発現レベル、OCT4、SOX2、およびFGF2は、hPSCsにウェスタンブロットによって決定した。 このFIGURの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいE。
図5：in vitroで多能性の分析。 （A）定量RT-PCR分析は、幹細胞性マーカーの発現を測定するために使用された、OCT4およびNANOGとhPCCM条件下で成長させた分化した細胞および未分化細胞中での三胚葉マーカーの発現。 。中胚葉、 ネスチン、SOX1：外胚葉、AFP、GATA3：内胚葉のグラフに示すように、測定値は、対照培養条件（OCT4）T、HNF3のβで観察された発現レベルに対して正規化しました。エラーバーは、平均±SDを示します。 （B）H1および中胚葉（デスミン）、外胚葉（TUJ1）を含有していた2週間後に胚様体を形成した実験条件で10継代培養したiPS細胞株、および内胚葉（AFP、GATA4）、免疫蛍光染色によって測定されます。スケールバー：100ミクロン、200ミクロンこの図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図6：2のマトリックスでコーティングされたプレート間HPSCの添付ファイルの比較 H1とiPS細胞-1は、異なる条件、hPCCM 0.1％ゼラチンと対照群に移しました。 （A）HPSCサブ培養後の1日目。 2日HPSCサブ培養後（B）。 5日HPSCサブ培養後（C）。スケールバー：10μmで、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
ヒト微小環境にhPSCsの操作を可能にする、などのbFGFまたはインスリンなどの外因性組換え増殖因子を添加することなくヒトフィーダーを含まない培養条件で、その特性を維持しながら、このモデルは、正常hPSCsを伝播するために開発されました。外因性のbFGF補充が一般的であり、そのようなマトリゲルまたはラミニンなどの基層の適用はhPSCs 14の無フィーダー培養のために不可欠です。
このプロトコルは、単純で実装が容易です。しかし、いくつかのステップは、その成功に不可欠です。最も重要なステップは、胎盤からの絨毛膜細胞の無菌単離であります。胎盤の収集方法により、例えば、マイコプラズマなどの病原体の汚染リスクが高いです。したがって、細胞の単離の間の病原体検査と管理が非常に重要です。さらに、すべての手順は、無菌的に実行する必要があります。 conditioneのコレクションヒト胎盤細胞の培養物からDのメディアは、一般的に容易です。その扱いがやや困難であるため、しかし、HPSC培養の経験が必要とされています。もう一つの重要な点として、このプロトコルを使用して、研究者があることに注意して人気の培養法（約24時間）よりも、このプロトコルではhPSCsの取り付けに必要な時間が長くなるという事実（36〜48時間）を維持する必要があります。この差はhPSCsの生存または増殖には影響を与えません。逆に、このプロトコルに従って培養hPSCsの成長は、従来のプロトコルを用いて培養した細胞よりもより堅牢です。
また、このプロトコルは、系列分化を誘導するためのアプリケーションを持っています。例えば、ヒト胚性生殖細胞様細胞または前駆細胞は、このプロトコルの適用または改変によって有用な細胞または組織に変えることができます。それは、多様な条件で特定の外因性サプリメントを識別するために、よりアクセスプラットフォームを提供します。このプロトコルの1つの制限は、胎盤の買収に関するhPCCM生産の依存性です。したがって、連続的なヒト胎盤の供給が必要です。
それは追加の外因性合成基質なしHPSC増殖のためのex vivoでフィーダーなしのヒト化環境を提供するため、このプロトコルは重要です。この技術をマスターした後、将来の方向性は、動物とhPCCMで培養hPSCsから派生した製品の臨床研究に適用される可能性があり、hPSCsの増殖および添付ファイルに影響を与えるメカニズムを決定するために。これはhPCCMでhPSCsの正常に伝播するための第1の詳細なプロトコルです。注目すべきは、このプロトコルは、幹細胞研究の新しい地平を開くことがありますし、そのアプリケーションと関連する調査結果に関するさらなる研究が保証されています。
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Disclosures
著者らは、利害の衝突を示していません。
Acknowledgments
著者らは、胎盤組織を提供するためにすぐに-チョルホン（医学博士、准教授、産婦人科、医科大学高麗大学）を感謝したいと思います。この作品は、韓国国立研究財団（NRF）、韓国からの助成金（R1211902）によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich Corporation | M4287 | 10 μg/ml |
| Mycoplasma detection kit | TaKaRa Bio Inc. | #6601 | |
| Matrigel | BD Biosciences | #354277 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies Inc. | #05850 | |
| Dispase | Worthington Biochemical Corporation | LS02100 | 1 mg/ml |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Corporation | G2500 | 0.10% |
| BM-Cyclin | Roche | 799 050 | 10 μg/ml |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Nano Drop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc | ||
| iQ SYBR Green qPCR Master Mix | Bio-Rad Laboratories | #170-8882AP | |
| ES Cell Characterization kit | Chemicon International, Inc., | SCR001 | |
| Power cDNA Synthesis Kit | iNtRON Biotechnology | 25011 | |
| QIAamp® DNA Micro kit | Qiagen | 56304 | |
| AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit | Applied Biosystems Inc. | 4322288 | |
| Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems Inc. |
References
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