Protocol
הצהרת אתיקה: מחקר השליה האנושי נערך מכאן ולהבא, באישור דירקטוריון הסקירה המוסדית למחקר אנושי של אוניברסיטת קוריאה (AN09085-001). כל הניסויים בוצעו במתקן חדר נקי נבט-חינם במרכז הרפואי של אוניברסיטת קוריאה. העיצוב ונהלים באמצעות hPSCs הניסוי אושרו על ידי מועצת המנהלים המוסדית הסקירה של המרכז הרפואי של אוניברסיטת קוריאה (AN12277-003).
1. הכנה של מכשירים, תרבות מדיה, ומנות
- כל מנות תרבות מעיל עם ג'לטין 0.1%. מלוח החיטוי שנאגרו פוספט (PBS) ומלקחיים. לעקר מספריים כירורגיות, צינורות microcentrifuge, וגזה ב 121 מעלות צלזיוס מתחת psi £ 15 ליותר מ -15 דקות.
- 0.25% חומצה מוכנה מראש חימם אמין טריפסין-אתילן טטרה-אצטית (טריפסין-EDTA) ותקשורת מראש חימם תרבות המסוננת (DMEM) המכיל 20% בסרום שור עוברי (FBS), 100 U / פניצילין מיליליטר, 100 ג '/ מיליליטר streptomycבלפני תחילת הליכים.
2. בידוד תא משלית האדם
- להשיג רקמת שליה, לאחר לידה בניתוח קיסרית, מהנשים בהריון בריאה עוברת הפלה רגילה או טיפולית ב7-32 שבועות של הריון לאחר קבלת כתב הסכמה מדעת.
- יש לי מומחה יילוד צלחות כוריוני אנושי שליה בניתוח נפרדת (HPCs) מהשליה; דגירה אלה ב0.25% טריפסין- EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ולאחר מכן לשטוף עם 5 מיליליטר PBS.
- לבודד villi כוריוני מHPCs באמצעות מספריים; ברר villi ולשטוף אותם שלוש פעמים עם 1ml PBS. לאחר מיותר, למקם את villi כוריוני לתוך צינור microfuge באמצעות קצה פיפטה; לשטוף את הדגימות עם 500 μl PBS על ידי pipetting למעלה ולמטה, וצנטריפוגה צינורות עבור 120 XG במשך 3 דקות. לשטוף רקמות פעמיים עם 500 μl של מדיום התרבות המחומם מראש.
- תרבות תאים במדיום על צלחות מצופים ג'לטין על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2
- להחליף הבינוני כל 2-3 ימים עד למעבר השלישי. במהלך התרבות, הסרת פסולת תא צף במדיום התרבות; fibroblasts השליה גדל יצרף לצלחת. תרבות התאים כמו פיברובלסטים הנגזרים מHPC עד מעבר -10 ולאחר מכן לקצור אותם לתרבויות hESC לאחר טיפול trypsinization וmitomycin-C (10 מיקרוגרם / מיליליטר).
- לפני הקפאת HPCs כדגימות מניות, להשתמש תגובת שרשרת השעתוק-פולימראז הפוך (RT-PCR) כדי לאשר שHPCs אינם מזוהמים עם פתוגנים שנפוצים להדביק את השליה, כולל mycoplasma (fermentans מ ', hyorhinis מ', מ 'ארגינין, M . Orale, salivarium מ ', מ' hominis, pulmonis מ ', arthritidis מ', neurolyticum מ ', מ' hyopneumoniae,ומ ' capricolum) ומיני חיידקים, urealyticum Ureaplasma, על ידי שימוש בערכה לגילוי mycoplasma.
- עקוב אחר ההוראות של היצרן לבצע RT-PCR, להשתמש בכל צבעי יסוד ותערובות המסופקים בערכה. השתמש בsupernatants של התאים שכבר טיפחו במשך 36 ימים לגילוי mycoplasma. הוסף 3 μl של דגימות אלה לתערובות PCR ולבצע את הליך 1 st PCR במשך 35 מחזורים, כל אחת בהיקף של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ו -72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות.
- בזהירות להוסיף 0.5 μl של מוצר st PCR 1 לתערובת PCR ולבצע את הליך 2 nd PCR במשך 30 מחזורי שימוש באותם תנאים כמו קודם. נתח את המוצרים מוגברים על ידי 1% ג'ל אלקטרופורזה agarose; להחיל 10 μl של כל אחד ממוצרי ה- PCR -1 ו -2 nd לג'לי.
- אם HPCs נמצא להיות מזוהם עם פתוגנים, לחסל אלהבאמצעות שילוב של אנטיביוטיקה (BM-Cyclin), הבא להוראות היצרן. להוסיף מדיום חדש המכיל 10 מיקרוגרם / מיליליטר של BM-Cyclin 1 במשך 3 ימים, ולאחר מכן לטפל בתאים עם 5 מיקרוגרם / BM-Cyclin מיליליטר 2 לעוד 4 ימים. חזור על מחזור זה פעמיים ולאחר מכן לבדוק זיהום mycoplasma שוב.
3. תאים נגזר שלית קציר אדם אוויר בינוני (hPCCM)
- לאחר נטרול זיהום, טיפול בתאים המצורפים (מפגש 85-90%; (1.5 × 10 7 תאים / בקבוק) עם mitomycin-C (10 מיקרוגרם / מיליליטר) עבור 2 שעות ו -30 דקות, ושטף את התאים שלוש פעמים עם 10 מיליליטר PBS. דגירה התאים עם מדיום מראש התחמם ללא mitomycin-צלזיוס למשך 24 שעות.
- יום אחד לאחר הטיפול, דגירה תאים ב 10 מיליליטר בינוני (DMEM-F12 בתוספת 20% החלפת סרום נוק-אאוט [KOSR], 0.1 מ"מ β-mercaptoethanol, NEAA 1%, ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין). לאחר 24 שעות של דגירה, CM קציר בצינור חרוטי 15 מ"ל ולסנן את CM באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
- להוסיף עוד 10 מיליליטר של מדיום ודגירה חדשים. לאסוף את כל supernatants מהתרבויות בכל יום במשך שבוע 1 ולהקפיא את המדיום שנקטפו ב -80 ° C. הימנע להקפיא להפשיר מחזורים חוזרים ונשנים.
4. תאי התרבות של גזע עובריים אנושית (hESCs) ואינדוקציה של תאי גזע pluripotent (iPSCs)
- להשיג שורות תאי גזע עובריות אנושיות, תאי H1 וH9 (רשומים במרשם NIH hESC תחת השם WA01 וWA09, בהתאמה) ומושרה pluripotent בתאי גזע iPSC-1: iPS (עורלה) -1 וiPSC-2 (IISH1i- BM) מWiCell מכון המחקר (מדיסון, ויסקונסין, ארה"ב). צריכים להיות מופשרים תאים בתרבית הבא הוראות היצרן.
- לקבוצת הביקורת, תאי תרבות במנות מצופות מטריקס הקרום במרתף במדיום תרבות בשימוש נרחב בסרום ללא-מזין חופשי ומוגדרת על 37 מעלות צלזיוס וב 5% CO 2. בתחילה, זרע 80-100 גושים של hPSCs אנימנות 35 מ"מ n. לגדל תאים בכלים האלה עד תאי מעבר מפגש ואופן שיגרתי 70-80% לאחת 5-6 ימים, תוך שימוש בשיטות מכאניות או אנזימטי (Dispase) culturing-משנה. לשטוף את התאים פעמיים עם מדיום וצלחת אותם ביחס של 1: 4. החלף את המדיום עם מדיום חדש כל יום.
- לקבוצות ניסוי, תאי התרבות בhPCCM על מנות מראש מצופים עם 0.1% ג'לטין ולבצע passaging השגרתי אחת ל5 ימים, או מכאני או אנזימים. תאי פלייט ביחסים בטווח של 1: 6-1: 10. hPSCs לצרף את הג'לטין בתוך 2 ימים לאחר העברה. החלף את המדיום עם מדיום חדש מדי יום.
5. אפיון של תאי גזע pluripotent האדם
הערה: אפיון hPSCs באמצעות מספר שיטות, כגון צביעת אלקליין phosphatase, immunocytochemistry, בזמן אמת PCR (qRT-PCR), ומערבי סופג.
- מכתים immunofluorescence
- לimmunofluorescencהצביעה, hPSCs תרבות הדואר ולתקן את התאים בתאי שקופית 8-היטב עם 4% (w / v) paraformaldehyde במשך 10 דקות; לאחר מכן, permeabilized את התאים עם 0.1% (V / V) טריטון-X100 במשך 15 דקות, ולחסום את התאים עבור שעה 1 עם 3% (V / V) בסרום סוס הרגיל בPBS המכילים 0.1% (V / V) Tween- 20. לשטוף PBS פעמיים במשך 5 דקות בין כל צעד.
- דגירה תאים עם הנוגדן הראשוני (אוקטובר-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, דילול של 1: 1,000) O / N ב 4 ° C ועם הנוגדנים משני.
- לפני ההתקנה, דגירה תאים עם 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) במשך 5 דקות בחושך. לשטוף את תאי קפדנות שלוש פעמים לכל 5 דקות ויבשות תאים לחלוטין, בחושך. לשמר תאים בינוני הרכבה הקרינה ולבחון אותם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- qRT-PCR
- לבודד RNA המוחלט מהתאים באמצעות ערכת RNeasy מיני פי המפרט של היצרן ולכמת את RNA חילוץ באמצעות ננו גלילת ספקטרופוטומטר. לסנתז cDNA על ידי הוספת 2 מיקרוגרם של RNA הכולל לאוליגו המכיל 20-μl תערובת תגובת פריימרים (DT) והכתב עילי השני הפוכים transcriptase; בצע את ההוראות של היצרן בהליך זה.
- להגביר את cDNA מסונתז עם מערכת iQ Bio-Rad iCycler, באמצעות iQ SYBR ירוק qPCR מיקס מאסטר ורצפי פריימר המתואר במכתב לוח S1. לנרמל את ערכי סף מחזור של גנים של עניין לאלה של דהידרוגנז glyceraldehyde-3-פוספט (GAPDH).
- phosphatase אלקליין מכתים (AP)
- זיהוי פעילות AP באמצעות סלולארי ES אפיון ערכה, על פי הפרוטוקול של היצרן.
- ביום 5, לשאוב התקשורת ולתקן את hPSCs עם paraformaldehyde 4% ב- PBS עבור 12 דקות. אל overfix; תיקון תאים ליותר מ 2 דקות יגרום איון של phosphatase אלקליין. לשאוב מקבע ולשטוף עם 1x לשטוף מאגר. אללאפשר בארות לייבוש בין צעדים.
- להוסיף פתרון מכתים מספיק כדי לכסות את כל טוב (1 מיליליטר לכל גם צלחת 35 מ"מ). דגירה צלחות בחושך ב RT במשך 15 דקות.
- לאחר דגירה, לשטוף כלים עם 1x לשטוף מאגר. תאי כיסוי עם 1x PBS כדי למנוע התייבשות ולבחון ותמונת התאים המוכתמים באמצעות מיקרוסקופ אולימפוס.
- מערבי כתם
- ביצוע ניתוח כתם מערבי כפי שתוארו לעיל ב9. בקצרה, לקבוע ריכוזי חלבון בlysates תא. לפתור כמויות שווה של חלבון על ג'ל אלקטרופורזה סולפט polyacrylamide ג'ל dodecyl נתרן (SDS-עמוד) ולהעביר את החלבונים על הממברנה פלואוריד polyvinylidene (PVDF).
- לחסום את הכתם ולחקור אותו O / N עם נוגדנים עיקריים שונים ב 4 ° C; לאחר מכן דגירה הכתם עם נוגדנים משני HRP-מצומדות עבור שעה 1. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במשך 10 דקות בכל פעם בין incubations. לזהות אותות באמצעות מגיב ECL.
- חזור על טנדם קצר ניתוח (STR)
- hPSCs נקצרו מהשליטה וקבוצות ניסוי באותו הקטע. הדנ"א הגנומי הופק באמצעות ערכת DNA מיקרו, על פי הוראות היצרן.
- להגביר את הדנ"א הגנומי במשך 16 לוקוסים גנטיים שונים באמצעות ערכת AmpF / STR PCR הגברה, על פי המפרט של היצרן ואלקטרופורזה נימים בוצע באמצעות מנתח גנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אחד יתרונות של שיטת הפצת hPSC הזה הוא שהוא משתמש ברכיבים מופרשים מהתאים אנושיים. צעד ciritical ביותר בפרוטוקול הוא הבידוד והתרבות של תאי שמקורם בשליית אדם. זה דורש נתיחה ומדויקת מחלק מדויק של villi צלחת HPC. איור 1 מציג את הליך בידוד תא הנגזר שליה אנושית. תהליך זה הוא פשוט ונוח לבידוד של תאים, ויכול בקלות להתבצע בתוך שעה 1. כפי שמתואר באיור 2, רקמות מחוברת לתאי הצלחת וכמו פיברובלסטים-ג'לטין המצופה צמחו וחסונה. סילוק פסולת ורקמות רקובים במעברים על ידי trypsinization מאפשר הבחירה של תאים ומבטיח תרבות הומוגנית. תאים אלה יכולים לשמש לייצור בינוני מותנה להתפשטות hPSC לאחר האישור של חוסר הזיהום. תנאים אופטימליים הוגדרו כ, אלה שאפשרו לתאים לגדול למפגש 80-85%, לאחר שהצמיחת דואר הופסקה באופן מלאכותי (מידע לא מוצג).
ניתן להעביר hPSCs התרבותי בתאים מזינים או מטריצות סינתטיות למאכלי ג'לטין המצופה בhPCCM. איור 3 מראה שאפשר לקיים קווי hPSC בhPCCM ברמה דומה לזה שנצפה לצלחות Matrigel מצופה (איור 3 א 'וב'). ג'לטין 0.1% לא uesd לתרבות hPSC עד עכשיו. בתנאים שלנו, hPSCs מורחב ומתוחזק pluripotency, דומה לhPSCs בקבוצת הביקורת. כדי לוודא שhPCCM נצפה מטריצות אחרות לתרבות hPSC, hPSCs היו תת-תרבותי על laminin, vitronectin ומנות שאינם מצופים. hPSC מצורף וגדל בhPCCM על laminin- ומנות מצופים vitronectin. עם זאת, לאחר כמה קטעים, מושבות רבות היו מובחנות ולא לשמור, שלא כמו אלו בקבוצת ג'לטין המצופה. לאחר העברה למאכלים שאינם מצופה, אין קובץ מצורף נצפה לhPSCs (איור 3 ג). לגonfirm שhPSCs היה זהה מבחינה גנטית לקבוצת הביקורת לאחר תרבות לטווח ארוך בhPCCM, hPSCs התרבותי במקביל משתי הקבוצות נותח באמצעות חוזר טנדם קצר טכניקה (STR) עבור 16 לוקוסים הגנומי (איור 3D ו- E).
רעיון מקובל לגבי תרבות vivo לשעבר של hPSCs הוא שיש צורך בbFGF לקדם התחדשות עצמית. בהעדר bFGF, hPSCs לאבד את יכולת ההתחדשות העצמית שלהם ולהבדיל 12,13. במצב hPCCM, hPSCs לא אבד את יכולת ההתחדשות העצמית שלהם ויציבות הביע סמני pluripotency בתרבות לטווח ארוך (איור 4 א - ג).
יכולת ההבחנה לתוך התאים של 3 שכבות נבט היא מאפיין מהותי ייחודי של hPSCs. יש לבדוק כל hPSC כדי לאמת את השימור של יכולת זו. כפי שניתן לראות בתרשים 5, hPSCs מובחן באופן ספונטני לתאים של 3 השכבות נבט לאחר 2 שבועות של אינדוקציה בhPCCM (איור 5 א 'וב'). נתונים אלה מצביעים על כך שhPCCM הוא אופטימלי לשימוש קליני.
זמן העיקול על מנות ג'לטין מצופה במהלך העברת hPSC ארוך יותר מזה על מנות מצופות מטריצות מסחריות סינתטיות להתפשטות hPSC. בדרך כלל, תאים מחוברים ביום שלאחר ציפוי עם מצעים סינטטיים. איור מצורף 6 מופעים בג'לטין 0.1% ועל צלחות השליטה. לאחר 24 שעות hPSCs תת תרבות המצורפת מעט יותר על ג'לטין מאשר בשליטה (איור 6 א). hPSCs יש לטפל בזהירות. לאחר 48 שעות, hPSCs צורפו לחלוטין והחל הרחבה על מנות מצופים ג'לטין (איור 6). יתר על כן, hPSCs הופיע לגדול מושבות צפופות ביעילות ונוצר ביום 5 לאחר תת-תרבות על ג'לטין (איור 6 ג). במהלך תקופת ההתקשרות לhPSCs, treatmen זהירלא חשוב ויכול להשפיע על הישרדות והתחדשות עצמית. בתנאי hPCCM, תקופת 48 שעות מומלצת להתקשרות של hPSCs.
איור 1: בידוד תא מvilli כוריוני אנושי שליה () רקמת שליה שליה טרי נשטפה בPBS לאחר trypsinization.. (ב) villi נחתכו לחתיכות באמצעות מספריים כירורגיות מעוקרים. (ג) villi נשטף מספר פעמים בPBS כדי להסיר שאריות וכלי דם. (D - E) villi הועבר לצינור מיקרו צנטריפוגות, טחון (מקסימום) ורחץ. רקמות (F) היו centrifuged באמצעות צנטריפוגות שולחן. (G) תהליך זה חזר על עצמו שלוש פעמים PBS ושתי פעמים במדיום התרבות מחוממת מראש. תאים (H) ורקמות היו זרע יחד על בקבוק ג'לטין מצופה מראש וטופחו במשך 5-7 ימים. התאים מצורפים וצמחו.
איור 2: טיפוח של תאי שמקורם בשליית אדם () כ 1 שבוע לאחר הבידוד, רקמות אנושיות שליה ותאים מצורפים לצלוחיות מצופים ג'לטין ותאים כמו פיברובלסטים-נבטו.. (ב) לאחר המעבר תת-התרבות הראשונה, רקמות הוסרו. הבינוני הוחלף בינוני טרי בכל יום אחר. (ג) לאחר המעבר השלישי, תאים הופיעו הומוגנית יותר. ברים סולם:. 200 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
es / ftp_upload / 53204 / 53204fig3.jpg "/>
איור 3:. אדם בתאי גזע pluripotent בhPCCM על מנות ג'לטין מצופה לאחר 13 קטעים, hPSCs, בתרבית hPCCM על מנות מצופים ג'לטין, הציגו phosphatase אלקליין פעילות הגבוה (AP). H1 () וiPSCs היו בתרבית בתנאי שליטה (mTeSR1 על מנות Matrigel מצופה). H1 (B) וiPSCs היו בתרבית בhPCCM על מנות ג'לטין מצופה. לוח שמאלי: שדה בהיר; פנל ימני: צביעת phosphatase אלקליין. (ג) H1 וiPSC הועברו ותרבותי בכמה מנות מצופים מטריצה להשוואה. כפי שניתן לראות, לאחר 5 hPSCs מעברים היו בתרבית. מנות מצופים laminin, מנות מצופים vitronectin, מנות שאינן מצופים. (D - E) STR ניתוח לhPSCs בתרבית hPCCM לעומת hPSCs שליטה. ברים סולם:. 10 מיקרומטר אנא גללקק כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
כתמי התפשטות תאי גזע pluripotent האדם אינה דורשת bFGF () H1 תא immunofluorescence עם נוגדנים נגד SSEA-4, אוקטובר-4, Sox2, NANOG, TRA-1-60, וTRA-1-81 אחרי 14 קטעים: איור 4. על ג'לטין מצופה מנות בhPCCM. בר סולם: 10 מיקרומטר. ניתוח (ב) RT-PCR שימש למדידת הביטוי של סמני stemness, Oct4, NANOG, וRex1 בשורות תאים השונות בתנאי ניסוי ובקרה. (ג) רמות ביטוי החלבון של סמני pluripotency, Oct4, Sox2, וFGF2, בhPSCs נקבעו על ידי כתמים מערביים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של figur זהדואר.
איור 5: ניתוח של pluripotency במבחנה. ניתוח () qRT-PCR שימש למדידת הביטוי של סמני stemness, Oct4 וNANOG והביטוי של סמני שכבה שלוש-נבט בתאים מובחנים ותאים שלא עברו התמיינות גדל בתנאי hPCCM. כפי שניתן לראות בגרף, מדידות היו מנורמלות לרמות הביטוי נצפו בתנאי תרבות שליטה (Oct4) T, β HNF3:. המזודרם, nestin, SOX1: האאקטודרם, AFP, GATA3: האנדודרם. הברים השגיאה מצביעים על אמצעי ± SD. H1 (B) וקווי iPSC שהיו בתרבית במשך 10 קטעים תחת תנאי ניסוי יצרו גופי embryoid לאחר 2 שבועות שהכילו המזודרם (desmin), האאקטודרם (Tuj1),והאנדודרם (AFP, GATA4), כפי שנמדד על ידי צביעת immunofluorescence. ברים סולם:. 100 מיקרומטר, 200 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6:. השוואה של קובץ מצורף hPSC בין שני לוחות מצופי מטריצת H1 וiPSC-1 הועברו לתנאים שונים, ג'לטין 0.1% בhPCCM וקבוצת ביקורת. יום 1 לאחר תת-תרבות hPSC (). (ב) 2 ימים לאחר תת-תרבות hPSC. (ג) 5 ימים לאחר תת-תרבות hPSC. ברים סולם:. 10 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודל זה פותח כדי להפיץ בהצלחה hPSCs, תוך שמירה על המאפיינים שלהם, בתנאי תרבות חופשי מזין אנושי ללא התוספת של גורמי גדילת רקומביננטי אקסוגניים כגון bFGF או אינסולין, המאפשר המניפולציה של hPSCs במייקרו-סביבה אנושית. תוספי bFGF אקסוגני הוא נפוצים והיישום של substrata כגון Matrigel או laminin הוא חיוני עבור culturing ללא מזין של 14 hPSCs.
פרוטוקול זה הוא פשוט וקל ליישום. עם זאת, כמה צעדים הם קריטיים להצלחה שלו. הצעד החשוב ביותר הוא בידוד ספטית של תאים סיסית שליה מ. בשל שיטות האיסוף לשליה, הסיכון לזיהום של פתוגנים כגון mycoplasma הוא גבוה. לכן, בדיקת הפתוגן וניהול בבידוד של תאים חשובים מאוד. בנוסף, כל ההליכים חייבים להתבצע סביבה נקיה מחיידקים. האוסף של על מצבותקשורת ד מהתרבות של תאי שליה אנושיים היא בדרך כלל קלה. עם זאת, יש צורך בניסיון בתרבויות hPSC כי הטיפול שלהם הוא קצת קשה. כנקודה חשובה נוספת, החוקר באמצעות פרוטוקול זה יש לזכור כי העובדה שהזמן הדרוש לצירוף hPSCs בפרוטוקול זה הוא ארוך יותר (36-48 שעות) מאשר שיטות תרבות הפופולריות (כ 24 שעות). הבדל זה אינו משפיע על כדאיות או התפשטות של hPSCs. להיפך, הצמיחה של hPSCs תרבית על פי פרוטוקול זה היא חזק יותר מזה של תאים בתרבית תוך שימוש בפרוטוקולים קונבנציונליים.
יתר על כן, יש פרוטוקול זה בקשות לאינדוקציה של בידול שושלת. לדוגמא, ניתן להפוך אדם תאים כמו נבט-עובריים או תאים לתאים או רקמות שימושיים על ידי היישום או שינוי של פרוטוקול זה. הוא מספק פלטפורמה נגישה יותר לזהות תוספים אקסוגניים ספציפיים בתנאים מגוונים.מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא התלות של ייצור hPCCM על רכישת שליה. לכן, יש צורך באספקת שליה אנושית מתמשכת.
פרוטוקול זה הוא משמעותי מכיוון שהוא מספק סביבת vivo לשעבר ללא מזין אנושית לריבוי hPSC ללא מצעים סינטטיים אקסוגניים נוספים. כיוונים עתידיים לאחר השליטה בטכניקה זו עשויים להיות מיושמים על בעלי חיים ומחקרים קליניים של מוצרים שמקורם hPSCs בתרבית hPCCM, וכדי לקבוע את המנגנונים המשפיעים על ההתפשטות והתקשרות של hPSCs. זהו הפרוטוקול מפורט הראשון להפצת המוצלחת של hPSCs בhPCCM. יש לציין, פרוטוקול זה עשוי לפתוח אופקים חדשים בחקר תאי גזע ומחקרים נוספים בנושא היישומים שלה וממצאים המשויכים מוצדקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מציינים אין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לזמן קצר-Cheol הונג (MD, Ph.D., פרופסור חבר במחלקה למיילדות וגניקולוגיה, אוניברסיטת קוריאה ספר לרפואה) למתן רקמת שליה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות (R1211902) מקרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF), הרפובליקה של קוריאה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich Corporation | M4287 | 10 μg/ml |
| Mycoplasma detection kit | TaKaRa Bio Inc. | #6601 | |
| Matrigel | BD Biosciences | #354277 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies Inc. | #05850 | |
| Dispase | Worthington Biochemical Corporation | LS02100 | 1 mg/ml |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Corporation | G2500 | 0.10% |
| BM-Cyclin | Roche | 799 050 | 10 μg/ml |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Nano Drop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc | ||
| iQ SYBR Green qPCR Master Mix | Bio-Rad Laboratories | #170-8882AP | |
| ES Cell Characterization kit | Chemicon International, Inc., | SCR001 | |
| Power cDNA Synthesis Kit | iNtRON Biotechnology | 25011 | |
| QIAamp® DNA Micro kit | Qiagen | 56304 | |
| AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit | Applied Biosystems Inc. | 4322288 | |
| Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems Inc. |
References
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
- Amit, M. C., Shakiri, V., Margulets, J. Itskovitz-Eldor Feeder layer and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biol Reprod. 70 (3), 837-845 (2004).
- Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).
- Jin, S., Yao, H., Weber, J. L., Melkoumian, Z. K., Ye, K. A synthetic, xeno-free peptide surface for expansion and directed differentiation of human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (11), e50880 (2012).
- Xu, R. H., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
- Xu, C., et al. Basic fibroblast growth factor supports undifferentiated human embryonic stem cell growth without conditioned medium. Stem Cells. 23 (3), 315-323 (2005).
- Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
- Park, Y., et al. Human feeder cells can support the undifferentiated growth of human and mouse embryonic stem cells using their own basic fibroblast growth factors. Stem Cells Dev. 20 (11), 1901-1910 (2011).
- Park, Y., et al. The efficacy of human placenta as a source of the universal feeder in human and mouse pluripotent stem cell culture. Cell Reprogram. 12 (3), 315-328 (2010).
- Park, Y., et al. Undifferentiated propagation of the human embryonic stem cell lines, H1 and HSF6, on human placenta-derived feeder cells without basic fibroblast growth factor supplementation. Stem Cells Dev. 19 (11), 1713-1722 (2010).
- Seok, K., et al. Human placenta-derived feeders support prolonged undifferentiated propagation of a human embryonic stem cell line, SNUhES3: comparison with human bone marrow-derived feeders. Stem Cells Dev. 16 (3), 421-428 (2007).
- Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
- Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
- Mahmood, A., Harkness, L., Schrøder, H. D., Abdallah, B. M., Kassem, M. Enhanced differentiation of stem cells mesenchymal progenitors by inhibition of TGF-beta/activin/nodal using SB-431542. J Bone Miner Res. 25 (6), 1216-1233 (2010).
