Protocol
Etica dichiarazione: Lo studio è stato condotto placenta umana prospetticamente, con l'approvazione del Institutional Review Board per la ricerca umana della University Korea (AN09085-001). Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in un Germ-Free Clean facility in camera presso il Medical Center Korea University. Il design e le procedure che utilizzano hPSCs sperimentale sono state approvate dal Institutional Review Board della Korea University Medical Center (AN12277-003).
1. Preparazione degli strumenti, terreni di coltura, e piatti
- Coat tutti i piatti della cultura con il 0,1% di gelatina. Salino Autoclave tampone fosfato (PBS) e pinze. Sterilizzare forbici chirurgiche, tubi microcentrifuga, e garze a 121 ° C sotto £ 15 psi per più di 15 min.
- 0,25% tripsina-etilene ammina tetra-acetico preparati pre-riscaldato (tripsina-EDTA) e mezzi di pre-riscaldato cultura filtrato (DMEM) contenente siero bovino fetale 20% (FBS), 100 U / ml di penicillina, e 100 g / ml streptomycin prima di iniziare le procedure.
2. Isolamento delle cellule da placenta umana
- Ottenere tessuto placentare, dopo il parto cesareo, da parte delle donne sane in gravidanza normale fase di aborto o terapeutico a 7-32 settimane di gestazione dopo aver ottenuto il consenso informato scritto.
- Hanno lo specialista ostetrico placenta umana piastre coriali chirurgicamente separati (HPC) dalla placenta; incubare questi in 0,25% tripsina-EDTA a 37 ° C per 20 minuti, e poi lavare con 5 ml di PBS.
- Isolare villi coriali da HPC con le forbici; Tritare i villi e lavarli tre volte con 1 ml di PBS. Dopo macinazione, posizionare i villi coriali in una provetta per microcentrifuga con un puntale; lavare i campioni con 500 microlitri di PBS pipettando su e giù, e centrifugare le provette per 120 xg per 3 min. Lavare tessuti due volte con 500 ml di terreno di coltura pre-riscaldata.
- Cellule culturali in media su piastre di gelatina rivestite a 37 ° C, in 5% di CO 2
- Sostituire il mezzo ogni 2-3 giorni fino al terzo passaggio. Durante la coltura, rimuovendo detriti cellulari galleggianti nel mezzo di coltura; crescita fibroblasti placentari si attaccheranno alla piastra. Coltivare le cellule di fibroblasti, come derivati dal HPC fino al 10 ° passaggio e poi li raccolgono per le culture hESC dopo tripsinizzazione e mitomicina-C (10 mg / ml) trattamento.
- Prima di congelamento HPC come campioni azionari, utilizzare trascrizione inversa-polymerase chain reaction (RT-PCR) per confermare che HPC non sono contaminati da agenti patogeni che normalmente infettano la placenta, tra cui micoplasma (M. fermentans, M. hyorhinis, M. arginina, M . orale, M. salivarium, M. hominis, M. pulmonis, M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae,e M. capricolum) e le specie batteriche, Ureaplasma urealyticum, utilizzando un kit di rilevamento micoplasma.
- Seguire le istruzioni del produttore per effettuare RT-PCR, utilizzare tutte primer e miscele fornite nel kit. Utilizzare il surnatante delle cellule che sono state coltivate per 36 giorni per la rilevazione micoplasma. Aggiungere 3 ml di questi campioni per le miscele PCR ed eseguire la procedura 1 st PCR per 35 cicli, ciascuno costituito da 94 ° C per 30 sec, 55 ° C per 2 min, e 72 ° C per 1 min.
- Aggiungere con cautela 0,5 ml di 1 ° prodotto PCR alla miscela PCR ed eseguire la procedura 2 ° PCR per 30 cicli usando le stesse condizioni di prima. Analizzare i prodotti amplificati di 1% gel di agarosio; applicare 10 ml di ogni del 1 ° e 2 ° prodotti di PCR per i gel.
- Se HPC si trovano ad essere contaminati da agenti patogeni, eliminarliutilizzando una combinazione di antibiotici (BM-ciclina), seguendo le istruzioni del produttore. Aggiungere un nuovo terreno contenente 10 mg / ml di BM-ciclina 1 per 3 giorni, e poi trattare le cellule con 5 mg / ml BM-ciclina 2 per altri 4 giorni. Ripetere questo ciclo per due volte e quindi verificare la presenza di contaminazione da micoplasma di nuovo.
3. Cellule raccolta umana Placenta derivati condizionata Media (hPCCM)
- Dopo aver escluso contaminazione, trattare le cellule attaccate (85-90% di confluenza, (1,5 × 10 7 cellule / fiasco) con mitomicina-C (10 ug / ml) per 2 ore e 30 minuti, e le cellule lavate tre volte con 10 ml PBS. Incubare le cellule con mezzo di pre-riscaldato senza mitomicina-C per 24 ore.
- Un giorno dopo il trattamento, incubare cellule in 10 ml di mezzo (DMEM-F12 integrato con il 20% di knock-out siero sostituzione [KOSR], 0,1 mm β-mercaptoetanolo, 1% NEAA, e l'1% di penicillina-streptomicina). Dopo 24 ore di incubazione, il raccolto CM in un tubo da 15 ml efiltrata del CM con un filtro siringa da 0,22 micron.
- Aggiungere altri 10 ml di nuovi media e di incubazione. Raccogliere tutte surnatanti dalle culture ogni giorno per 1 settimana e congelare il medium raccolto a -80 ° C. Evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento.
4. Cellule Cultura di staminali embrionali umane (hESC) e induzione di cellule staminali pluripotenti (iPSCs)
- Ottenere linee di cellule staminali embrionali umane, H1 e H9 cellule (elencati nel Registro NIH hESC con il nome di WA01 e WA09, rispettivamente) e di cellule staminali indotte pluripotenti-IPSC-1: iPS (prepuzio) -1 e IPSC-2 (IISH1i- BM) dal Research Institute WiCell (Madison, WI, USA). Le cellule devono essere scongelati e coltivate seguendo le istruzioni del produttore.
- Per il gruppo di controllo, le cellule di coltura su piatti matrice di membrana basale rivestite in diffuso mezzo di coltura definito senza siero-libero-alimentazione e a 37 ° C e in 5% di CO 2. Inizialmente, sementi 80-100 ciuffi di hPSCs in 35 mm piatti. Crescere cellule in questi piatti fino a 70-80% di confluenza e di routine cellule passaggio per sub-coltura una volta ogni 5-6 giorni, con metodi meccanici o enzimatici (dispasi). Lavare le cellule due volte con terreno e li piastra in un rapporto di 1: 4. Sostituire il supporto con terreno fresco ogni giorno.
- Per i gruppi sperimentali, le cellule di coltura in hPCCM sui piatti pre-rivestite con 0,1% di gelatina e di eseguire passaging di routine una volta ogni 5 giorni, sia meccanicamente o enzimatica. Cellule piastra a rapporti nella gamma di 1: 6-1: 10. hPSCs allegare alla gelatina entro 2 giorni dopo il trasferimento. Sostituire il supporto con terreno fresco tutti i giorni.
5. Caratterizzazione di cellule staminali pluripotenti umane
NOTA: Caratterizzare hPSCs utilizzando diversi metodi, come la colorazione fosfatasi alcalina, immunocitochimica, quantitativa real-time PCR (qRT-PCR), e western blotting.
- Immunofluorescenza
- Per immunofluorescence di colorazione, hPSCs cultura e fissare le cellule nelle camere di scorrimento 8 pozzetti con il 4% (w / v) paraformaldeide per 10 minuti; poi, le cellule permeabilizzate con 0,1% (v / v) Triton-X100 per 15 min, e bloccare le cellule per 1 ora con 3% (v / v) di siero di cavallo normale in PBS contenente 0,1% (v / v) Tween- 20. Lavare PBS due volte per 5 minuti tra ogni passo.
- Incubare le cellule con l'anticorpo primario (ottobre-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, diluizione di 1: 1.000) O / N a 4 ° C e con l'anticorpo secondario.
- Prima del montaggio, incubare le cellule con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 5 minuti al buio. Lavare le cellule rigorosamente tre volte per 5 minuti ciascuno e secche cellule completamente, nel buio. Conservare le cellule in mezzo di montaggio fluorescenza e osservarli al microscopio a fluorescenza.
- qRT-PCR
- Isolare RNA totale da cellule utilizzando un kit RNeasy mini secondo le specifiche del produttore e quantificare l'RNA estratto utilizzando un Nano goccia spettrofotometro. Sintetizzare cDNA aggiungendo 2 ug di RNA totale per un oligo contenente 20 microlitri miscela di reazione (dT) primer e Superscript II trascrittasi inversa; seguire le istruzioni del produttore in questa procedura.
- Amplificare il cDNA sintetizzato con un sistema iQ Bio-Rad iCycler, utilizzando iQ SYBR Green qPCR Master Mix e le sequenze di primer descritti nella tabella di riferimento S1. Normalizzare i valori di soglia ciclo dei geni di interesse a quelli di deidrogenasi gliceraldeide-3-fosfato (GAPDH).
- La fosfatasi alcalina (AP) colorazione
- Rilevare l'attività AP utilizzando il cellulare ES Caratterizzazione Kit, secondo il protocollo del produttore.
- Il giorno 5, aspirare i media e fissare i hPSCs con paraformaldeide al 4% in PBS per 12 min. Non overfix; fissa cellule per più di 2 min comporterà l'inattivazione di fosfatasi alcalina. Aspirare il fissativo e lavare con 1x Sciacquare tampone. Noni pozzetti si asciughino tra i passaggi.
- Aggiungere soluzione colorante sufficiente a coprire ogni pozzetto (1 ml per pozzetto di un piatto da 35 mm). Incubare le piastre al buio a temperatura ambiente per 15 min.
- Dopo l'incubazione, lavare i piatti con 1x Sciacquare tampone. Celle di copertura con PBS 1x per prevenire l'essiccazione ed esaminare e immagine le cellule colorate utilizzando un microscopio Olympus.
- Western Blot
- Eseguire l'analisi western blot come descritto in precedenza in 9. In breve, determinare le concentrazioni di proteine in lisati cellulari. Risolvere uguali quantità di proteine su un gel elettroforesi solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) gel di sodio dodecil e trasferire le proteine su un fluoruro di polivinilidene (PVDF) membrana.
- Bloccare la macchia e la sonda è O / N con anticorpi primari diversi a 4 ° C; successivamente incubare la macchia con anticorpi secondari HRP-coniugati per 1 ora. Lavare la membrana per tre volte per 10 minuti ogni volta tra incubazione. Rileva segnali mediante un reagente ECL.
- Short Tandem Repeat (STR) Analisi
- hPSCs sono state raccolte dal controllo e gruppi sperimentali allo stesso passo. DNA genomico è stato estratto utilizzando un kit Micro DNA, secondo le istruzioni del produttore.
- Amplificare il DNA genomico per 16 loci genetici diversi utilizzando il kit CF / STR PCR amplificazione, secondo le specifiche del produttore e elettroforesi capillare è stata effettuata utilizzando un analizzatore genetico.
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Representative Results
Un vantaggio di questo metodo di propagazione HPSC è che utilizza componenti secreti dalle cellule umane. Un passo più ciritical nel protocollo è l'isolamento e la coltura di cellule derivate da placenta umana. Ciò richiede ed accurata dissezione da una parte precisa di HPC piastra villi. La Figura 1 mostra la procedura per l'isolamento delle cellule derivate placenta umana. Questo processo è semplice e conveniente per l'isolamento delle cellule, e può essere facilmente eseguita entro 1 ora. Come descritto nella figura 2, i tessuti fissati al piatto e fibroblasto-simili cellule gelatina rivestita germinati robusto. Rimozione di detriti e tessuti cariati durante i passaggi di tripsinizzazione permette la selezione di celle e garantisce una cultura omogenea. Queste cellule possono essere utilizzate per produrre mezzo condizionato per HPSC proliferazione dopo aver confermato la mancanza di contaminazione. Le condizioni ottimali sono stati definiti come quelli che ha permesso alle cellule di crescere fino a 80-85% di confluenza, dopo di che the la crescita è stata artificialmente interrotto (dati non mostrati).
hPSCs coltivate su cellule feeder o matrici sintetiche possono essere trasferiti ai piatti rivestiti di gelatina in hPCCM. La figura 3 mostra che le linee HPSC possono essere mantenuti in hPCCM a un livello simile a quello osservato per le piastre Matrigel rivestite (Figura 3A e B). 0,1% di gelatina non è stato uesd per la cultura HPSC fino ad ora. Nelle nostre condizioni, hPSCs ampliato e mantenuti pluripotenza, simile a hPSCs nel gruppo di controllo. Per confermare che il hPCCM accede altre matrici per la cultura HPSC, hPSCs erano sub-coltivate su laminina, vitronectina e piatti non rivestiti. HPSC attaccato e si è sviluppato in hPCCM su laminin- e piatti vitronectina rivestite. Tuttavia, dopo vari passaggi, molte colonie sono state differenziate e non hanno mantenuto, a differenza di quelle sul gruppo di gelatina rivestita. Dopo il trasferimento ai piatti non rivestiti, nessun attaccamento è stato osservato per hPSCs (Figura 3C). Per confirm che hPSCs erano geneticamente identici al gruppo di controllo, dopo coltura a lungo termine in hPCCM, hPSCs coltivate in parallelo di entrambi i gruppi sono stati analizzati utilizzando un breve tandem repeat (STR) tecnica per il 16 loci genomici (Figura 3D e E).
Una nozione ampiamente accettata per quanto riguarda l'ex vivo cultura hPSCs è che bFGF è necessaria per promuovere l'auto-rinnovamento. In assenza di bFGF, hPSCs perdono la loro capacità di auto-rinnovamento e si differenziano 12,13. Nella condizione hPCCM, hPSCs non hanno perso la loro capacità di auto-rinnovamento e stabilmente espresso marcatori pluripotenza durante cultura a lungo termine (Figura 4A - C).
La capacità di differenziazione nelle cellule di 3 strati germinali è una caratteristica intrinseca unica di hPSCs. Ogni HPSC deve essere testato per verificare la conservazione di questa capacità. Come mostrato in figura 5, hPSCs spontaneamente differenziate in cellules dei 3 strati germinali dopo 2 settimane di induzione a hPCCM (Figura 5A e B). Questi dati indicano che hPCCM è ottimale per l'uso clinico.
Il tempo di attacco su piatti rivestiti di gelatina durante il trasferimento HPSC è più lungo che su piatti rivestiti con matrici commercialmente sintetici per HPSC propagazione. Di solito, le cellule attaccate entro un giorno dopo il rivestimento con substrati sintetici. La Figura 6 mostra allegato sul 0,1% di gelatina e sulle piastre di controllo. Dopo 24 hr hPSCs sub-coltura attaccate leggermente più sulla gelatina che sul controllo (figura 6A). hPSCs devono essere maneggiati con cautela. Dopo 48 ore, hPSCs erano completamente attaccati e hanno iniziato l'espansione su gelatina rivestite piatti (Figura 6B). Inoltre, hPSCs sembravano crescere colonie in modo efficace e formato imballato il giorno 5 dopo sub-cultura in gelatina (Figura 6C). Durante il periodo di attacco per hPSCs, treatmen attentit è importante e può influenzare la sopravvivenza e di auto-rinnovamento. In condizioni hPCCM, un periodo di 48 ore è fortemente raccomandato per il fissaggio di hPSCs.
Figura 1: isolamento delle cellule da placenta umana villi coriali (A) fresco tessuto corionica placentare è stato lavato in PBS dopo tripsinizzazione.. (B) L'villi sono stati tagliati a pezzi con le forbici chirurgiche sterilizzati. (C) Villi sono state lavate diverse volte in PBS per rimuovere i detriti e vasi. (D - E) Villi sono stati trasferiti in un tubo di micro-centrifuga, tritata (massimo) e lavato. (F) I tessuti sono stati centrifugati utilizzando una centrifuga da tavolo. (G) Questo processo è stato ripetuto tre volte in PBS e due volte in terreno di coltura pre-riscaldato. (H) Cells e tessuti sono stati seminati insieme su un pallone di gelatina preverniciato e incubate per 5-7 giorni. Le cellule attaccate e germogliato.
Figura 2: La coltivazione di cellule derivate da placenta umana (A) circa 1 settimana dopo l'isolamento, tessuti placenta e cellule umani collegati al fiaschi gelatina rivestite e fibroblasti simili germogliati.. (B) Dopo il primo passaggio sottocultura, i tessuti sono stati rimossi. Il mezzo è stato sostituito con terreno fresco ogni altro giorno. (C) Dopo il terzo passaggio, le cellule apparivano più omogenea. Bar Scala:. 200 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3:. Umano cellule staminali pluripotenti in hPCCM sui piatti di gelatina rivestite Dopo 13 passaggi, hPSCs, coltivate in hPCCM sui piatti di gelatina rivestite, esposte ad alta fosfatasi alcalina (AP) attività. (A) H1 e iPSCs sono state coltivate in condizioni di controllo (mTeSR1 su piatti Matrigel rivestite). (B) H1 e iPSCs sono state coltivate in hPCCM su piatti di gelatina rivestite. A sinistra: campo chiaro; A destra: fosfatasi alcalina colorazione. (C) H1 e IPSC sono state trasferite e coltivate su diversi piatti di matrice rivestito per il confronto. Come si vede, dopo 5 passaggi hPSCs sono state coltivate. Piatti Laminin rivestite, piatti vitronectina rivestite, piatti non rivestiti. (D - E) STR analisi per hPSCs coltivate in hPCCM rispetto a hPSCs controllo. Bar Scala:. 10 micron prega di cleccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Pluripotenti umane propagazione delle cellule staminali non richiede bFGF (A) H1 cella immunofluorescenza con anticorpi contro SSEA-4, ottobre-4, Sox2, Nanog, TRA-1-60, e TRA-1-81 dopo 14 passaggi su piatti di gelatina rivestite in hPCCM. Scala bar: 10 micron. Analisi (B) RT-PCR è stato utilizzato per misurare l'espressione dei marcatori staminalità, OCT4, NANOG e Rex1 nelle diverse linee cellulari in condizioni sperimentali e di controllo. (C) I livelli di espressione della proteina di marcatori pluripotenza, OCT4, SOX2 e FGF2, in hPSCs sono stati determinati da macchie occidentali. Clicca qui per vedere una versione più grande di questo figure.
Figura 5: Analisi di pluripotenza in vitro. Analisi (A) qRT-PCR è stato utilizzato per misurare l'espressione dei marcatori staminalità, OCT4 e Nanog e l'espressione di marcatori di livello tre germinali in cellule differenziate e cellule indifferenziate coltivate in condizioni hPCCM. Come mostrato nel grafico, le misurazioni sono stati normalizzati ai livelli di espressione osservati nelle condizioni di coltura di controllo (Oct4) T, β HNF3:. Mesoderma, nestina, SOX1: ectoderma, AFP, GATA3: endoderma. Le barre di errore indicano medie ± SD. (B) H1 e linee IPSC che sono state coltivate per 10 passaggi in condizioni sperimentali costituiti corpi embrionali dopo 2 settimane che contenevano mesoderma (desmina), ectoderma (TUJ1),e endoderma (AFP, GATA4), come misurato da immunofluorescenza. Bar Scala:. 100 micron, 200 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6:. Confronto dell'attaccamento HPSC tra due lastre di matrice rivestite H1 e IPSC-1 sono stati trasferiti in condizioni differenti, 0,1% di gelatina in hPCCM e gruppo di controllo. (A) 1 giorno dopo HPSC sub-cultura. (B) 2 giorni dopo HPSC sub-cultura. (C) 5 giorni dopo HPSC sub-cultura. Bar Scala:. 10 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo modello è stato sviluppato per propagare successo hPSCs, pur mantenendo le loro caratteristiche, in condizioni di coltura privo di alimentazione umanizzati senza aggiunta di esogeni fattori di crescita ricombinanti come bFGF o insulina, consentendo la manipolazione di hPSCs in un microambiente umanizzato. Supplementazione esogena bFGF è comune e l'applicazione di substrati come Matrigel o laminina è essenziale per la coltura senza alimentatore di hPSCs 14.
Questo protocollo è semplice e facile da implementare. Tuttavia, alcuni passi sono fondamentali per il suo successo. Il passo più importante è l'isolamento asettico di cellule corion dalla placenta. Per via delle metodologie di raccolta per la placenta, il rischio di contaminazione di agenti patogeni come micoplasma è alta. Pertanto, l'esame patogeno e gestione durante l'isolamento delle cellule sono molto importanti. Inoltre, tutte le procedure devono essere eseguite in modo asettico. La collezione di conditioned supporto dal coltura di cellule placenta umana è generalmente facile. Tuttavia, l'esperienza nelle culture HPSC è necessario perché il loro trattamento è un po 'difficile. Come un altro punto importante, il ricercatore che utilizza questo protocollo deve tenere presente che il fatto che il tempo necessario per il fissaggio di hPSCs in questo protocollo è più lunga (36-48 ore) dei metodi di coltura popolari (circa 24 h). Questa differenza non incide sulla validità o la proliferazione di hPSCs. Al contrario, la crescita di hPSCs coltivate secondo questo protocollo è più robusto rispetto a quello delle cellule in coltura usando protocolli convenzionali.
Inoltre, questo protocollo ha applicazioni per l'induzione della differenziazione lineage. Ad esempio, le cellule germinali, come embrionali o cellule progenitrici umano può essere trasformato in cellule o tessuti utili per l'applicazione o la modifica di questo protocollo. Esso fornisce una piattaforma più accessibile per identificare specifici integratori esogeni in condizioni diverse.Una limitazione di questo protocollo è la dipendenza della produzione hPCCM sull'acquisizione placenta. Pertanto, è necessario un apporto continuo di placenta umana.
Questo protocollo è importante perché fornisce un ambiente umanizzato ex vivo senza caricatore per HPSC propagazione senza ulteriori supporti sintetici esogeni. Direzioni future dopo padroneggiare questa tecnica possono essere applicati agli studi clinici di prodotti derivati da hPSCs coltivate in hPCCM animali e, e per determinare i meccanismi che influenzano la proliferazione e l'attaccamento di hPSCs. Si tratta del primo protocollo dettagliato per la propagazione di successo di hPSCs in hPCCM. In particolare, questo protocollo potrebbe aprire nuovi orizzonti nella ricerca sulle cellule staminali e di ulteriori studi riguardanti le sue applicazioni ei risultati associati sono garantiti.
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Disclosures
Gli autori indicano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Soon-Cheol Hong (MD, Ph.D., Professore Associato, Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia, Medical College Korea University) per la fornitura di tessuto placentare. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni (R1211902) dal National Research Foundation di Corea (NRF), Repubblica di Corea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich Corporation | M4287 | 10 μg/ml |
| Mycoplasma detection kit | TaKaRa Bio Inc. | #6601 | |
| Matrigel | BD Biosciences | #354277 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies Inc. | #05850 | |
| Dispase | Worthington Biochemical Corporation | LS02100 | 1 mg/ml |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Corporation | G2500 | 0.10% |
| BM-Cyclin | Roche | 799 050 | 10 μg/ml |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Nano Drop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc | ||
| iQ SYBR Green qPCR Master Mix | Bio-Rad Laboratories | #170-8882AP | |
| ES Cell Characterization kit | Chemicon International, Inc., | SCR001 | |
| Power cDNA Synthesis Kit | iNtRON Biotechnology | 25011 | |
| QIAamp® DNA Micro kit | Qiagen | 56304 | |
| AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit | Applied Biosystems Inc. | 4322288 | |
| Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems Inc. |
References
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