Protocol
Declaración de Ética: El estudio de la placenta humana se realizó de forma prospectiva, con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional para la investigación humana de la Universidad de Corea (AN09085-001). Todos los experimentos se llevaron a cabo en un centro de la habitación-Germ gratuito Limpio en el Centro Médico de la Universidad de Corea. El diseño y los procedimientos que utilizan hPSCs experimentales fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad del Centro Médico de Corea (AN12277-003).
1. Preparación de instrumentos, medios de cultivo, y platos
- Escudo todas las placas de cultivo con 0,1% de gelatina. Autoclave solución salina tamponada con fosfato (PBS) y fórceps. Esterilizar tijeras quirúrgicas, tubos de microcentrífuga y gasas a 121 ° C bajo 15 libras psi durante más de 15 min.
- 0,25% de tripsina de etileno-amina-tetra acético ácido preparado pre-calentado (tripsina-EDTA) y los medios de pre-calentado de cultivo filtrado (DMEM) que contenía suero bovino fetal al 20% (FBS), 100 U / ml de penicilina, y 100 g / ml streptomycen antes de comenzar los procedimientos.
2. Aislamiento de la célula de placenta humana
- Obtener tejido placentario, después del parto cesárea, de las mujeres embarazadas sanas someterse aborto normal o terapéutica en 7-32 semanas de gestación después de obtener el consentimiento informado por escrito.
- Tener el especialista obstétrica placas coriónica placenta humana quirúrgicamente separadas (HPC) de la placenta; incubar estos en 0,25% de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 20 min, y luego se lava con 5 ml de PBS.
- Aislar vellosidades coriónicas de HPC utilizando tijeras; pelos en las vellosidades y lavarlos tres veces con 1 ml de PBS. Después de picar, colocar las vellosidades coriónicas en un tubo de microcentrífuga utilizando una punta de pipeta; lavar las muestras con 500 l de PBS por pipeteando arriba y abajo, y centrifugar los tubos durante 120 xg durante 3 min. Lavar dos veces con tejidos 500 l de medio de cultivo pre-calentado.
- Células de cultivo en un medio en placas recubiertas de gelatina a 37 ° C, en 5% de CO 2
- Intercambiar el medio cada 2-3 días hasta el tercer pasaje. Durante el cultivo, la eliminación de restos de células flotando en el medio de cultivo; crecimiento de fibroblastos placentarios se adjunte a la placa. Cultura de las células similares a fibroblastos derivados de la HPC hasta el 10º pasaje y luego cosechan para cultivos de células madre después del tratamiento tripsinización y mitomicina C (10 mg / ml).
- Antes de congelar HPCs como muestras de valores, utilice reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) para confirmar que HPCs no están contaminados con patógenos que comúnmente infectan la placenta, incluyendo micoplasma (M. fermentans, M. hyorhinis, M. Arginina, M . orale, M. salivarium, M. hominis, M. pulmonis, M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae,y M. capricolum) y las especies bacterianas, Ureaplasma urealyticum, mediante el uso de un kit de detección de micoplasma.
- Siga las instrucciones del fabricante para realizar RT-PCR, utilice todos los cebadores y mezclas previstas en el kit. Usa los sobrenadantes de las células que han sido cultivadas durante 36 días para la detección de micoplasma. Añadir 3 l de estas muestras a las mezclas de PCR y realice el procedimiento 1 st PCR durante 35 ciclos, consistiendo cada uno de 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 2 min, y 72 ° C durante 1 min.
- Añadir con cuidado 0,5 l de la 1 st producto PCR a la mezcla de PCR y realice el procedimiento 2 nd PCR durante 30 ciclos utilizando las mismas condiciones que antes. Analizar los productos amplificados por 1% electroforesis en gel de agarosa; aplicar 10 l de cada uno de los 1 y 2 de los productos de PCR a los geles.
- Si se encuentran HPCs estar contaminados con patógenos, eliminar estosutilizando una combinación de antibióticos (BM-Ciclina), siguiendo las instrucciones del fabricante. Escribir un medio que contiene 10 mg / ml de BM-ciclina 1 durante 3 días, y luego tratar las células con 5 mg / ml BM-ciclina 2 durante 4 días. Repita este ciclo dos veces y luego comprobar la contaminación por micoplasma nuevo.
3. Las células derivadas de la placenta humana cosecha acondicionado Medio (hPCCM)
- Después de excluir la contaminación, el tratamiento de las células unidas (85-90% de confluencia, (1,5 × 10 7 células / frasco) con mitomicina C (10 mg / ml) durante 2 horas y 30 minutos, y se lavaron las células tres veces con 10 ml PBS. Se incuban las células con medio precalentado sin mitomicina-C durante 24 horas.
- Un día después del tratamiento, se incuban las células en 10 ml de medio (DMEM-F12 suplementado con 20% Knock-Out suero sustitución [KOSR], 0,1 mM β-mercaptoetanol, 1% NEAA, y 1% de penicilina-estreptomicina). Después de 24 h de incubación, la cosecha CM en un tubo cónico de 15 ml y sefiltrado del CM usando un filtro de jeringa de 0,22 micras.
- Añadir otros 10 ml de nuevo medio y la incubación. Recoge todos los sobrenadantes de los cultivos de cada día durante 1 semana y congelar el medio cosechado a -80 ° C. Evite los ciclos de congelación y descongelación repetidas.
4. Las células Cultura de madre embrionarias humanas (hESCs) y la inducción de las células madre pluripotentes (iPSCs)
- Obtener líneas de células madre embrionarias humanas, células H1 y H9 (enumerados en el registro NIH células madre bajo el nombre WA01 y WA09, respectivamente) y-pluripotentes inducidas de células madre IPSC-1: iPS (prepucio) -1 y IPSC-2 (IISH1i- BM), del Instituto de Investigación WiCell (Madison, WI, EE.UU.). Las células deben ser descongelados y cultivadas siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Para el grupo de control, células de cultivo en placas revestidas-Matrix Membrana Basal en medio de cultivo definido-alimentador libre de suero y libre ampliamente utilizado a 37 ° C y en 5% de CO 2. Inicialmente, sembrar matas de 80-100 hPSCs in platos de 35 mm. Crecer células en estos platos hasta el 70-80% de confluencia y rutinariamente células de paso para sub-cultivo una vez cada 5-6 días, utilizando métodos mecánicos o enzimáticos (Dispasa). Lavar las células dos veces con medio y la placa ellos en una proporción de 1: 4. Sustituya el medio con medio fresco cada día.
- Para los grupos experimentales, células de cultivo en hPCCM en los platos pre-recubiertas con gelatina al 0,1% y realizar pases de rutina una vez cada 5 días, ya sea mecánicamente o enzimáticamente. Células de la placa en relaciones en el intervalo de 1: 6-1: 10. hPSCs unen a la gelatina plazo de 2 días después de la transferencia. Sustituya el medio con medio fresco todos los días.
5. Caracterización de las células madre pluripotentes Humanos
NOTA: Caracterizar hPSCs utilizando varios métodos, tales como la tinción de fosfatasa alcalina, inmunocitoquímica, en tiempo real PCR cuantitativa (QRT-PCR), y el Western Blot.
- La tinción de inmunofluorescencia
- Para immunofluorescence tinción, hPSCs de cultivo y fijar las células en 8 pocillos cámaras de diapositivas con 4% (w / v) de paraformaldehído durante 10 min; a continuación, las células se permeabilizaron con 0,1% (v / v) de Triton-X100 durante 15 min, y bloquear las células durante 1 hora con 3% (v / v) de suero de caballo normal en PBS que contenía 0,1% (v / v) Tween- 20. Lave PBS dos veces durante 5 minutos entre cada paso.
- Se incuban las células con el anticuerpo primario (OCT-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, la dilución de 1: 1000) O / N a 4 ° C y con el anticuerpo secundario.
- Antes del montaje, incubar las células con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 5 min en la oscuridad. Lavar las células rigurosamente tres veces durante 5 minutos cada uno y secos células completamente, en la oscuridad. Preservar las células en medio de montaje de fluorescencia y observarlas bajo un microscopio de fluorescencia.
- QRT-PCR
- Aislar el ARN total a partir de células utilizando un kit RNeasy Mini de acuerdo con las especificaciones del fabricante y cuantificar el ARN extraído usando un espectrofotómetro Nano gota. Sintetizar cDNA mediante la adición de 2 g de ARN total a un 20-l mezcla de reacción que contiene oligo (dT) cebadores y Superscript II transcriptasa inversa; siga las instrucciones del fabricante en este procedimiento.
- Amplificar el cDNA sintetizado con un sistema iQ Bio-Rad iCycler, utilizando iQ SYBR Green qPCR Master Mix y las secuencias de los cebadores descritos en el Adicional cuadro S1. Normalizar los valores de umbral de ciclo de los genes de interés a los de la deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH).
- La fosfatasa alcalina (AP) tinción
- Detectar la actividad de AP usando la célula ES Caracterización Kit, de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- El día 5, aspirar los medios de comunicación y corregir los hPSCs con paraformaldehído al 4% en PBS durante 12 min. No overfix; fijar las células durante más de 2 min dará lugar a la inactivación de la fosfatasa alcalina. Aspirar el fijador y enjuague con 1x Enjuague Buffer. Nopermiten que los pozos se sequen entre los pasos.
- Añadir solución de tinción suficiente para cubrir cada pocillo (1 ml por pocillo de una placa de 35 mm). Incubar las placas en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min.
- Después de la incubación, lavar los platos con 1x Enjuague Buffer. Las células de la cubierta con 1x PBS para prevenir el secado y examinan e imagen las células teñidas utilizando un microscopio Olympus.
- Western Blot
- Realizar análisis de transferencia Western según lo descrito anteriormente en 9. Brevemente, determinar las concentraciones de proteína en los lisados celulares. Resolver cantidades iguales de proteína en una electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) gel de dodecil de sodio y transferir las proteínas a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF).
- Bloquee la mancha y la sonda se O / N con diferentes anticuerpos primarios a 4 ° C; posteriormente se incuba la blot con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 1 h. Se lava la membrana tres veces durante 10 min cada vez, entre incubaciones. Detectar señales usando un reactivo ECL.
- Short Tandem Repeat (STR) Análisis
- hPSCs se recogieron de los grupos control y experimental en el mismo pasaje. ADN genómico fue extraído utilizando un kit de ADN Micro, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Amplificar el ADN genómico de 16 loci genético diferente usando el Kit AmpF / STR Amplificación por PCR, de acuerdo con las especificaciones del fabricante y electroforesis capilar se realizó utilizando un analizador genético.
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Representative Results
Una ventaja de este método de propagación HPSC es que utiliza componentes secretados a partir de células humanas. Un paso más ciritical en el protocolo es el aislamiento y cultivo de células de la placenta humanos derivados. Esto requiere la disección precisa y de una parte precisa de HPC placa vellosidades. La Figura 1 muestra el procedimiento para el aislamiento de células derivada de placenta humana. Este proceso es simple y conveniente para el aislamiento de células, y se puede realizar fácilmente dentro de 1 hr. Como se describe en la Figura 2, los tejidos asociadas a las células de plato y similares a fibroblastos recubiertos de gelatina germinados robusta. La eliminación de los desechos y de los tejidos cariados durante los pasajes mediante tripsinización permite la selección de células y asegura una cultura homogénea. Estas células se pueden utilizar para producir medio para la proliferación de HPSC condicionado después de confirmar la falta de contaminación. Las condiciones óptimas se definieron como, las que permiten que las células crezcan a 80-85% de confluencia, después de lo cual THcrecimiento e se detuvo artificialmente (datos no mostrados).
hPSCs cultivadas sobre células alimentadoras o matrices sintéticas pueden ser transferidos a platos recubiertos de gelatina en hPCCM. Figura 3 muestra que las líneas de HPSC se pueden mantener en hPCCM en un nivel similar a la observada para placas recubiertas con Matrigel (Figura 3A y B). 0,1% de gelatina no se ha uesd para la cultura HPSC hasta ahora. En nuestras condiciones, hPSCs expandido y se mantuvieron la pluripotencia, similar a hPSCs en el grupo de control. Para confirmar que el hPCCM acceder a otras matrices para la cultura HPSC, hPSCs fueron sub-cultivadas en laminina, la vitronectina y platos no recubiertos. HPSC adjunta y creció en hPCCM en laminina y platos recubiertos con vitronectina. Sin embargo, después de varios pasajes, muchas colonias fueron diferenciadas y no se mantienen, a diferencia de los del grupo de la gelatina recubiertos. Después de la transferencia a los platos no revestidos, no se observó unión para hPSCs (Figura 3C). Para cONFIRMAR que hPSCs eran genéticamente idénticos al grupo de control después del cultivo a largo plazo en hPCCM, hPSCs cultivadas en paralelo de ambos grupos se analizaron mediante una técnica (STR) short tandem repeat para 16 loci del genoma (Figura 3D y E).
Una noción ampliamente aceptada en relación con el cultivo ex vivo de hPSCs es que bFGF es necesaria para promover la auto-renovación. En ausencia de bFGF, hPSCs pierden su capacidad de auto-renovación y diferenciación 12,13. En la condición hPCCM, hPSCs no perdieron su capacidad de auto-renovación y establemente expresan marcadores de pluripotencia durante el cultivo a largo plazo (Figura 4 A - C).
La capacidad de diferenciación en las células de 3 capas germinales es una característica intrínseca única de hPSCs. Cada HPSC debe probarse para verificar la preservación de esta habilidad. Como se muestra en la Figura 5, hPSCs espontáneamente diferenciarse en célulass de las 3 capas germinales después de 2 semanas de inducción en hPCCM (Figura 5A y B). Estos datos indican que hPCCM es óptimo para el uso clínico.
El tiempo de fijación en platos recubiertos con gelatina durante la transferencia de HPSC es más largo de lo que es en platos recubiertos con matrices comercialmente sintéticos para la propagación HPSC. Por lo general, las células unidas dentro de un día después del recubrimiento con sustratos sintéticos. La Figura 6 muestra fijación en 0,1% de gelatina y en las placas de control. Después de 24 horas hPSCs sub-culta adjuntan un poco más sobre la gelatina que en el control (Figura 6A). hPSCs deben manejarse con precaución. Después de 48 horas, hPSCs estaban completamente unidos y comenzó la expansión en los platos recubiertos de gelatina (Figura 6B). Además, hPSCs parecían crecer colonias envasados con eficacia y formada en el día 5 después de la subcultura de la gelatina (Figura 6C). Durante el período de fijación para hPSCs, treatmen cuidadosast es importante y puede influir en la supervivencia y la auto-renovación. En condiciones hPCCM, un período de 48 horas es muy recomendable para la fijación de hPSCs.
Figura 1: Aislamiento de la célula de placenta humana vellosidades coriónicas (A) tejido coriónico de la placenta fresca se lavó en PBS después de tripsinización.. (B) Las vellosidades se cortaron en piezas utilizando tijeras quirúrgicas esterilizados. (C) Villi se lavaron varias veces en PBS para eliminar los residuos y los vasos. (D - E) Villi se transfirieron a un tubo de microcentrífuga, picada (máximo) y se lavó. (F) Los tejidos se centrifugaron usando una centrífuga de mesa. (G) Este proceso se repitió tres veces en PBS y dos veces en medio de cultivo pre-calentado. (H) Las células y los tejidos se sembraron juntos en un matraz de gelatina pre-revestido y se incubaron durante 5-7 días. Las células unidas y germinados.
Figura 2: El cultivo de células de la placenta humanos derivados de (A) Aproximadamente 1 semana después del aislamiento, los tejidos de placenta humana y células unidas a matraces recubiertos de gelatina y células similares a fibroblastos germinadas.. (B) Después del primer paso de la subcultura, se retiraron los tejidos. El medio se reemplazó por medio fresco cada dos días. (C) Después del tercer paso, las células parecían más homogénea. Las barras de escala:. 200 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3:. Human células madre pluripotentes en hPCCM en platos recubiertos de gelatina Después de 13 pasajes, hPSCs, cultivadas en hPCCM en platos recubiertos de gelatina, mostraron alta actividad de la fosfatasa alcalina (AP). (A) H1 y CMPI se cultivaron en condiciones de control (mTeSR1 en platos recubiertos con Matrigel). (B) H1 y iPSCs se cultivaron en hPCCM en platos recubiertos de gelatina. Panel izquierdo: campo claro; Panel derecho: tinción fosfatasa alcalina. (C) H1 y IPSC se transfirieron y se cultivaron en varios platos de matriz recubiertos para la comparación. Como se muestra, después de 5 pasajes hPSCs se cultivaron. Platos recubiertas con laminina, vitronectina platos recubiertos, platos no revestidos. (D - E) STR análisis para hPSCs cultivarse en hPCCM en comparación con hPSCs de control. Las barras de escala:. 10 micras favor clamer aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. Pluripotentes Humanos propagación de células madre no requiere bFGF (A) H1 tinción de inmunofluorescencia de células con anticuerpos contra SSEA-4, octubre-4, Sox2, NANOG, TRA-1-60 y TRA-1-81 después de 14 pasajes en platos recubiertos con gelatina-en hPCCM. Barra de escala: 10 micras. Se utilizó el análisis (B) RT-PCR para medir la expresión de los marcadores stemness, OCT4, NANOG, y Rex1 en las diferentes líneas celulares en las condiciones experimentales y de control. Los niveles de expresión de proteínas de los marcadores de pluripotencia (C), Oct4, Sox2, y FGF2, en hPSCs se determinaron por transferencias Western. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figure.
Figura 5: Análisis de la pluripotencia in vitro. Se utilizó el análisis (A) qRT-PCR para medir la expresión de los marcadores stemness, Oct4 y NANOG y la expresión de marcadores de capa de tres germinales en células diferenciadas y células indiferenciadas crecido en condiciones hPCCM. Como se muestra en el gráfico, las mediciones se normalizaron a los niveles de expresión observados en las condiciones de cultivo de control (Oct4) T, β HNF3:. Mesodermo, nestina, SOX1: ectodermo, AFP, GATA3: endodermo. Las barras de error indican medias ± SD. (B) H1 y líneas de IPSC que se cultivaron durante 10 pasajes en condiciones experimentales formados cuerpos embrionarios después de 2 semanas que contenían mesodermo (desmina), ectodermo (Tuj1),y endodermo (AFP, GATA4), medido por tinción de inmunofluorescencia. Las barras de escala:. 100 m, 200 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6:. Comparación de unión HPSC entre dos placas de matriz recubiertos H1 y IPSC-1 fueron transferidas a diferentes condiciones, 0,1% de gelatina en hPCCM y el grupo control. (A) 1 día después subcultura HPSC. (B) 2 días después de la subcultura HPSC. (C) 5 días después de subcultura HPSC. Las barras de escala:. 10 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este modelo fue desarrollado para propagar con éxito hPSCs, mientras que el mantenimiento de sus características, en condiciones de cultivo libres de alimentador humanizados sin la adición de factores de crecimiento recombinantes exógenas tales como bFGF o insulina, lo que permite la manipulación de hPSCs en un microambiente humanizado. Suplementación bFGF exógeno es común y la aplicación de sustratos tales como Matrigel o laminina es esencial para el cultivo libre de alimentador de hPSCs 14.
Este protocolo es simple y fácil de implementar. Sin embargo, algunos pasos son fundamentales para su éxito. El paso más importante es el aislamiento aséptico de células chorion de la placenta. Debido a los métodos de recogida de la placenta, el riesgo de contaminación de patógenos tales como micoplasma es alta. Por lo tanto, el examen de patógenos y la gestión durante el aislamiento de las células son muy importantes. Además, todos los procedimientos se deben realizar de forma aséptica. La colección de conditioned medios desde el cultivo de células de placenta humana es generalmente fácil. Sin embargo, se necesita experiencia en culturas HPSC porque su manejo es un poco difícil. Como otro punto importante, el investigador que utiliza este protocolo debe tener en cuenta que el hecho de que el tiempo necesario para la fijación de hPSCs en este protocolo es más largo (36 a 48 h) que los métodos de la cultura popular (aproximadamente 24 h). Esta diferencia no afecta a la viabilidad o la proliferación de hPSCs. Por el contrario, el crecimiento de hPSCs cultivaron de acuerdo con este protocolo es más robusto que el de las células cultivadas usando protocolos convencionales.
Además, este protocolo tiene aplicaciones para la inducción de la diferenciación de linaje. Por ejemplo, las células de gérmenes como embrionarias o células progenitoras humanas se pueden convertir en células útiles o tejidos por la aplicación o modificación de este protocolo. Proporciona una plataforma más accesible para identificar los suplementos exógenos específicos en diversas condiciones.Una limitación de este protocolo es la dependencia de la producción hPCCM en la adquisición de la placenta. Por lo tanto, se necesita un suministro continuo de placenta humana.
Este protocolo es importante porque proporciona un entorno humanizado ex vivo alimentador libre para la propagación HPSC sin sustratos sintéticos exógenos adicionales. Orientaciones futuras después de dominar esta técnica podría aplicarse a los estudios clínicos de los productos derivados de hPSCs cultivadas en hPCCM animales y, y para determinar los mecanismos que afectan a la proliferación y el apego de hPSCs. Este es el primer protocolo detallado para la propagación exitosa de hPSCs en hPCCM. Cabe destacar que este protocolo podría abrir nuevos horizontes en la investigación con células madre y nuevos estudios sobre sus aplicaciones y hallazgos asociados están garantizados.
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Disclosures
Los autores indican que no hay conflictos de interés.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer Pronto-Cheol Hong (MD, Ph.D., profesor asociado del Departamento de Obstetricia y Ginecología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Corea) para proporcionar el tejido placentario. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones (R1211902) de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), República de Corea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich Corporation | M4287 | 10 μg/ml |
| Mycoplasma detection kit | TaKaRa Bio Inc. | #6601 | |
| Matrigel | BD Biosciences | #354277 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies Inc. | #05850 | |
| Dispase | Worthington Biochemical Corporation | LS02100 | 1 mg/ml |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Corporation | G2500 | 0.10% |
| BM-Cyclin | Roche | 799 050 | 10 μg/ml |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Nano Drop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc | ||
| iQ SYBR Green qPCR Master Mix | Bio-Rad Laboratories | #170-8882AP | |
| ES Cell Characterization kit | Chemicon International, Inc., | SCR001 | |
| Power cDNA Synthesis Kit | iNtRON Biotechnology | 25011 | |
| QIAamp® DNA Micro kit | Qiagen | 56304 | |
| AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit | Applied Biosystems Inc. | 4322288 | |
| Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems Inc. |
References
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