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Immunology and Infection

AC-6 공급 시스템을 사용하여 일반 림프 전구 세포에서 쥐 형질 수지상 세포의 체외 세대

doi: 10.3791/53211 Published: November 23, 2015

Abstract

형질 수지상 세포 (올라가고은) 내가 감염 또는 염증 반응 동안 응답 활성화 (IFN-1) 생산 세포를 인터페론 강력한 유형입니다. 불행하게도, PDC 기능의 연구는 림프 기관에 낮은 주파수에 의해 방해하고, 체외 DC 생성을위한 기존의 방법은 주로 올라가고 이상 CDCS의 생산을 선호. 여기에 우리가 효율적으로 체외에서 일반적인 림프 전구 세포 (CLP를)에서 올라가고을 생성하는 독특한 접근 방식을 제시한다. 특히, 프로토콜은 골수로부터 CLP를 정화 및 FLT3 리간드의 존재하에 γ 조사 된 AC-6 피더 세포와 공동 배양함으로써 PDCS를 생성하는 방법을 자세히 설명했다. 이 문화 시스템의 고유 한 특징은 CLP를가 AC-6 세포 아래 마이그레이션 및 조약돌 영역 형성 세포, PDC의 확장을위한 중요한 단계가 될 것입니다. 형태 학적으로 별개의 수지상, 즉 올라가고 및 CDCS는 7 조성 후 약 2 주 생성 된최적 조건 하에서 0-90%의 PDCS. 일반적으로이 방법에 의해 생성 PDCS의 수는 대략 CLP를 시딩 수의 100 배이다. 따라서, 이것은 견고 이들 세포의 발달 및 기능에 추가 연구를 용이하게하기 위해 필요한 PDCS의 다수를 생성되는 신규 한 시스템이다.

Introduction

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수지상 세포 (DCS)는 면역 반응 1을 제어하는데 중요한 역할을 전문 항원 제시 세포이다. DC가 이종 있지만, 그들이 대체로 두 집단으로 분류 될 수 있고, 종래의 DC (CDCS) 및 형질 수지상 (PDCS) 2,3-. 림프 기관 외에 CDCS 및 PDCS 또한 폐, 소장, 피부 (2)를 포함한 조직에서 발견된다. CDCS 및 올라가고의 형태는 수상 돌기 모양의 돌기보다 형질 세포가 같은 것을 올라가고의 모양을 나타내는 CDCS으로 다르​​다. 또한, 일반적인 마우스 DC 마커, CD11c 양성은 더 높게 올라가고보다 CDCS에 표현된다. 올라가고 2보다 MHC 클래스 II의 높은 수준과 보조 자극 분자를 표현 둘 CD24 + CDCS, - CDCS와 CD11b를 - 또한, CDCS는 더는 CD11b + CD24로 나눌 수 있습니다. 성숙한 PDCS는 반면에, 선택적 Siglec-H 및 BST2 4를 발현하는 것으로 나타났다. 에프unctionally, CDCS는 올라가고보다 제시 세포보다 항원은; 그러나 올라가고 내가 바이러스 감염이나 염증 자극 5시 인터페론 유형의 광대 한 양을 생성 할 수 있습니다.

모두 CDCS 및 올라가고는 짧은 수명이며, 따라서 지속적으로 골수 (BM) 6,7 내 조상에서 보충해야합니다. 치명적-조사 된 마우스에 공통 골수 전구 세포 (CMP들) 및 일반 림프 조상 (CLP를)의 입양 전송 CDCS과 올라가고 양쪽 계통 8-10에서 생성 될 수 있음을 보여줍니다. 그러나, RAG1 / 2를 표현하고 고등학교의 궤적 (11, 12)에서 재 배열 DJ 세그먼트를 가지고 올라가고의 부분 집합이있다. 이 세포는 B220 마커의 발현, 핵산 감지 수용체 (TLR7 / TLR9) 및 전사 인자 (SpibBcl11a) (13)를 포함하는 B 림프구와 분자 유사성을 공유하고, 림프 혈통의 서명 될 것으로 모두가 있습니다. 따라서, CLPS 때문에 계보 유사성 올라가고의 체외 발생에 대한 좋은 선택 일 수있다.

인간 및 마우스 모두 CDCS 및 PDCS의 빈도가 매우 낮은 반면 6, 수지상 세포, 특히 CDCS는, (예를 GM-CSF 11,14 또는 FLT3 리간드와 같은 사이토 카인의 존재 BM 또는 전구 세포로부터 in vitro에서 생성 될 수있는 FL ) 공급 장치가없는 시스템 11,15,16를 사용하여. 불행하게도, 그러나, FL 11,15,16을 사용하여 시험 관내에서 PDC의 다수를 생성하는 것은 불가능하다. 이전에, 우리는 PDCS 효율적 AC-6 급전 시스템 (17)을 사용하여 시험 관내에서 CLP를 생성 할 수 있다는 것을 보여 주었다. 배양 시스템에서 AC-6 간질 세포주를 사용하는 장점은 세포 - 세포 접촉 CLP를 PDCS로부터 많은 수의 생성을 지원하는 사이토 카인의 분비를 제공한다는 것이다. 이 시스템으로 생산이 매우 강력하지만, 아래에 설명 된 절차에주의 복제 내가 필요합니다N 순서는 올라가고의 효율적 생성을 보장합니다.

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Protocol

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C57BL / 6 야생형 마우스 국립 실험 동물 센터 (NLAC), 대만에서 구입 하였다. 모든 마우스는 사육 및 특정 병원균이없는 상태에서 유지되었다. 프로토콜 및 동물 사용 절차를 검토하고 의학의 국립 대만 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (허가 번호 : 20120075)에 의해 승인되었다. 또한, 연구진은 실험을 수행하는 동안 동물에 고통, 고통, 또는 고통의 가능성을 줄이기 위해 모든 노력을했다. 장갑을 착용하는 동안 설명하는 모든 절차는 실온에서 수행되었다.

AC-6 피더 세포의 제조 (1)

주 : AC-6.21 (AC-6 짧은) (I. 와이즈맨, 스탠포드 대학에서 제공) 기질 세포 라인 (18)하는 것은 RPMI에서 유지되어야는 15 % 열 - 불 활성화 된 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충. 피더 세포의 역할을하기 위해, AC-6 세포-γ 조사 3,000 방사선 (30Gy) 자신의 확산을 방지하기 위해 공동 문화 전에 일일와 있습니다. 참고 일그들의 통로 번호가 20 인 경우에 AC-6 세포는 유지 보수시 혼잡 방치하면 자신의 분화 지원 능력을 상실하는 경향이있다, 또는.

  1. 워시 AC-6 세포는 한 번에 1 ml의 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)와 열망에 의해 DPBS를 제거합니다. AC-6 37 O C 3-5 분 동안 0.8 ml의 트립신 용액 (0.05 % 트립신 및 DPBS 0.5 mM의 EDTA), 그 다음 5 % CO 2와 함께 세포 배양 배지의 10 볼륨으로 희석하여 반응을 정지 치료 단일 세포 현탁액을합니다.
  2. 5.9x10에서 종자 AC-6 세포는 4 세포 / 웰로 12 웰 플레이트와 5 %, 37 ℃로 배양 CO 2 O / N.
    주 : AC-106 세포의 밀도가 CDC 생성을 선호한다 저밀도 매우 중요하다. 5.9x10의 밀도로 시드 아니라 AC-6 CLP를에서 올라가고의 유도를위한 최적 다음날에 의해 포화 상태에 도달 할 수 / 4 셀.
  3. γ-조사 장치를 이용하여 3000 RAD (30 Gy의)에서 AC-6 세포를 조사.
    노트: AC-6을 조사하는 데 사용되는 투여 량에서 세포 증식을 방지하고, 또 CLP를 행 수지상 분화에 필요한 사이토 카인과 세포 - 세포 접촉을 제공하기에 충분히 오래 생존 그들을 유지하기 위해 최적화된다.
  4. 대기음 매체 (10 % 열 - 불 활성화 FBS, 50 μg의 / ㎖ 겐타 마이신과 50 μM의 β-머 캅토 에탄올로 RPMI) 완전한 RPMI 1 ㎖로 대체합니다.

마우스 2. 격리 BM 세포

  1. CO 2 질식 자궁 전위에 의해 쥐를 희생. 해부 트레이에 마우스를 놓고 70 % 에탄올로 소독. 중반 복부에 절개를하고 하반신을 덮고있는 피부를 포함하여 마우스의 말단 부분에서 피부를 제거합니다.
  2. 반 멸균 후드에서 쥐를 해부하다. 대퇴골과 경골을 해제하려면, 무릎 관절 아래 위의 대퇴골과 경골 클립. 가위를 사용하여 뼈에서 근육을 분리하고 RPMI을 완료 5 ㎖를 포함하는 6cm 페트리 접시에 뼈를 배치합니다.
  3. 멸균 문화 후드로 이동합니다. 완전한 RPMI와 27G 바늘에 연결된 3 ML의 주사기를 채우십시오. 가위를 사용하여 뼈의 양쪽 끝을 잘라, 부드럽게 각각의 끝에서 완료되면 RPMI를 주입하여 뼈에서 골수를 플러시 27G 바늘을 삽입합니다.
  4. 세포 상하 3-5 배 바늘없는 주사기를 사용하여 배양 접시에서 부드러운 피펫 팅에 의해 단일 ​​세포 현탁액을 제조.
  5. 500 XG에서 5 분 동안 세포를 원심 분리기와 뜨는을 가만히 따르다.
  6. 1 mL의 ACK 완충액 (150 mM의 CL NH 4, 10 mM의 KHCO 3, 0.1 mM의 EDTA) 1 분 동안 배양하고 완전 RPMI 10 부피로 희석하여 반응을 정지와를 Lyse 적혈구. 세포가 중력에 의해 죽은 세포 덩어리 및 조직 파편을 펠렛하기 위해 5 분간 방치한다.
    참고 :이 때문에 가능한 세포의 정착에 세포가 손실 될 수로 이상 5 분을 서 있지 마십시오.
  7. 새로운 튜브 떠나 파편에 천천히 캔트 세포 함유 뜨는원래 튜브 뒤에.
  8. 다음, 세포 펠렛 제거하고 상층 액을 버린다 500 XG에서 5 분 동안 원심 분리기.
  9. 총 BM 세포를 재현 탁 FACS 완충액 (1X PBS + 2 % FBS +를 1mM EDTA) 100 μL (전형적으로 4-6 X 107 BM 세포 한 마우스로부터 획득된다).

3. FACS 분석 및 CLP를의 정렬

  1. 된 Fc 수용체를 차단하기 위해 1 ~ 2 분 동안 항 CD16 / 32 (하이 브리 도마 상층 액 10 클론 2.4G2, 50 μL / 반응 또는 1-2 μg의 / 반응) FACS 버퍼에 세포에 (단계 2.9)를 추가합니다.
    주 : 안티 CD16 / 32 또한 과립구, 단핵구, 및 B 림프구를 비롯한 된 Fc 수용체를 발현하는 세포에 대한 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 첨가 된 Fc 블록이라고 부른다.
  2. 동시에 주변 광을 피하고, 얼음에 15 분 동안 (4 × 7 셀) 다음과 같은 형광 염료 표지 항체와 세포를 얼룩. 항체 : PE - 복합 혈통 마커 항 CD3 포함 (0.2 μg의 각) (17A2) 항 CD8 (53에서 6.7 사이), 항 B220 (RA3-6B2), 항 CD19 (eBio1D3), 항 -CD11b (M1 / 70), 안티 GR-1 (RB6-8C5), 안티 Thy1.1 (HIS51), 안티 NK1.1 (PK136), 안티 TER119 (TER-119), 및 안티 MHC-II (NIMR-4), 0.2 μg의 항 - C-KIT-를 PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 μg의 안티 무서-1-FITC (D7), 0.4 μg의 안티 - M-CSFR-APC (AFS98), 0.2 μg의 항 IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
  3. 500 X g에서 5 분 동안 3 ML의 외과 버퍼와 세포 및 원심 분리기를 씻으십시오.
  4. 300 ㎕의 FACS에 세포가 40 μM 셀 스트레이너 버퍼 및 필터를 통해 세포를 재현 탁.
  5. 남아있는 세포를 복구하고 동일한 셀 스트레이너를 사용하여 튜브를 정렬 멸균 외과로 필터링 추가 100 μL FACS 완충액으로 튜브를 씻으십시오.
  6. 신호 검출에 대해 적절한 필터 및 전압을 사용하여 염색 후 즉시 유세포 분석을 수행한다. PE- 및 PE-Cy7-labelded 항체 및 633 nm의 라스를 검출하기 위해 561 nm의 레이저, FITC-, Cy5.5를 PerCP - 표지 된 항체를 검출하기 위해 488 nm의 레이저를 사용하여ER은 APC 표지 항체를 검출한다.
  7. 씨 - 킷트 INT 무서 INT-1의 M-CSFR - - + IL-7Rα (단계 3.2에서 염색 등) 셀 소터를 사용하여 정렬 밖으로는 CLP를 다음 마커에 따른 LIN. 쿠션 완전 RPMI 8ml의 함유 15ml를 튜브에 세포를 수집 정렬.
  8. 런의 ​​끝에서 셀 소터와 같이 분류 세포의 절대 수를 기록한다. 통상적으로, 5 × 4 CLP를 한 마우스로부터 BM을 얻을 수있다.

4. 공동 배양 CLP를 및 AC-6

  1. 500 XG에서 10 분 동안 단계 3.7에서 분류 세포를 원심 분리하고 상층 액을 5 × 104 세포 / ㎖의 주위 세포 밀도를 얻기 위해 충분히 완전한 RPMI과 세포 펠렛을 재현 탁. 씨앗 500 세포 / 웰로 단계 1.4에서 준비 피더 세포를 포함하는 12 웰 플레이트.
  2. 추가 100 NG FL 19 ㎖ / (후-Flt3L-IG는 M. 만츠, Universi 의해 제공 발현 시스템을 이용하여 내부에서 생성 된타이 병원 취리히, 스위스), 37 O C, 현미경 DC 개발의주기적인 영상 감시와 5 % CO 2에서 품어.
    참고 : 시판되는 재조합 인간 또는 마우스 FL FL은 DC의 개발을 지원하기 위해 후 - Flt3L-IG 대용으로 사용될 수있다.
  3. 12 일에 뜨는에서 세포를 수집하고 결과 상층 액을 결합 RPMI 배지를 완료 ㎖로 0.5 회 우물을 씻는다. 셀 스크레이퍼로 부착 세포를 0.5 ml의에게 신선한 매체를 추가하고 스크랩.
  4. 500 x g에서 5 분 동안 세포 함유 배지에서 두 부분을 결합하고 원심.
  5. 50 μL FACS 버퍼에 가만히 따르다 뜨는에 resuspend 세포. 50 μL 항 CD16 / 32 하이 브리 도마 뜨는 추가 된 Fc 수용체를 차단하는 1-2 분 동안 품어.
  6. 열거하고 다음 항체 (0.05 μg의 각) 항 중 CD11c-APC (N418), 항 -CD11b-FITC 및 항 B220-PE 모든 세포를 염색.
  7. 설명으로 세척하고 원심 분리기 세포단계 3.3에서 D.
  8. 중 CD11c의 + 100 μL FACS 버퍼 게이트에서 세포를 재현 탁하고 CDCS (중 CD11c + CD11b를 + B220 -)에 대해 분석하고 올라가고 (중 CD11c + CD11b를 - B220의 +) (17).

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Representative Results

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4-6x10 7 BM 세포의 총 일반적으로 대퇴골 한 6 ~ 8 주령, 야생형 C57BL / 6 마우스의 경골에서 격리됩니다. CLP를 밖으로 정렬하려면, 총 BM 세포는 혈통 마커 (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b를, GR-1, Thy1.1, NK1.1, TER119 및 MHC-II), 안티에 대한 PE - 복합 항체로 염색 -c-KIT-를 PerCP / Cy5.5, 안티 무서-1-FITC, 안티 - M-CSFR-APC 및 항 IL-7Rα-PE / Cy7는 분석하고 세포 분류기로 분류. CLP에 대한 선별 전략은 그림 1에 나타낸다. 일반적으로, 5 × 4 CLP를 한 C57BL / 6 마우스에서 얻을 수 있습니다. 더 CLP를 얻으려면 3-4 생쥐로부터 BM 세포를 결합 할 수 있고, 프로토콜이 정렬되기 전에 적절하게 조정.

5.9x10 6 AC-6 피더 세포와 500 CLP를의 공 배양 후, 조약돌 영역 형성 세포 (CAFC)은 하루에 3-4으로 나타나기 시작합니다. 8 일째으로 둥근 모양 올라가고가 표시 및 CAFC (그림 2A)의 상단에 일시 중지합니다. PDC의 수는 D 주변 봉우리12-14 님이하는 포인트 올라가고은 전체 개발 다음과 같은 고사를 받아야하기 시작하고, 숫자는 점차 감소하기 시작한다. CDC의 식민지가 하루 6-8에서 PDC 식민지 이후에 나타나며, CDCS의 형태가 큰, 스핀들 등을들 수 있으며, 부착 (그림 2B).

일반적 5-6x10 4 세포 공동 배양 2 주 후에 CLP를 500에서 생성 될 수있다. 안티의 CD11c-APC와 세포를 염색 한 후, 항 -CD11b-FITC 및 안티 B220-PE는, 흐름에 의한 분석은 세포 계측법 보여줍니다 올라가고의 비율 (중 CD11c + CD11b를 - B220의 +) 및 CDCS (중 CD11c + CD11b를 + B220 - ) 91 %와 6 %, 각각 (그림 3)입니다. 따라서,이 방법은 PDCS (100) 배만큼 확장 될 수있다.

그림 1
CLP를 그림 1. 게이팅 전략. BM 세포 이소하나의 마우스에서 lated는 형광 표지 항체로 염색 및 LIN과 같이 정의 하였다 CLP를, 분석 하였다 - C-키트 INT 무서-1 INT의 M-CSFR -. IL-7Rα + 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2
형태론 CLP-AC-6 공 배양에 CDC와 PDC 식민지의 그림 2. 500 CLP를이 / ㎖ FL 100 NG의 존재 γ-조사 AC-6 피더 세포와 공 배양 하였다. (A) PDC의 식민지 일 8시, 10 , 12, 및 (B) 하루 8, 12에서 CDC 식민지, 16은 200 × (스케일 바 50 μm의)에서 광학 현미경 하에서 촬영 된. larg의를 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 어 버전.

그림 3
CLP-파생 올라가고 및 CDCS 그림 3. 유세포 분석. 다섯 백 CLP를하고 γ-조사 AC-6 피더 세포 (5.9x10 4 / ㎖) / ㎖ 겨 플로리다 (100의 존재 12 일 동안 시험 관내에서 동시 배양 하였다 ). 세포는 안티의 CD11c-APC, 항 -CD11b-FITC 및 항 B220-PE로 염색하고 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 세포가 처음의 CD11c의 +에 문 다음 CDCS (중 CD11c + CD11b를 + B220 -)을 분석 하였다 및 올라가고 (중 CD11c + CD11b를 - B220의 +). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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여기에서 우리는 CLP를 소수의에서, 특히 체외 배양 수지상의 강력한 생성을위한 시스템 및 올라가고을 설명합니다. 이 배양 시스템의 고유성은 피더로서 AC-106 세포, 간질 세포주의 이용에 기인한다. 이 방법은 예컨대 IL-7, SCF, M-CSF 및 FL 20뿐만 아니라 사이토 카인을 제공하기 위해 도시 한 내용뿐만 아니라, 필요한 세포 간 접촉 (21)은 DC 개발을 지원한다. AC-106 세포는 여러 선조 8,16,22에서 시험 관내 DC 개발 연구를 용이하게하기 위해 이전에 사용되어왔다. 우리는 CLP를 PDCS로부터의 효율적인 분화를 지원하는 AC-6 피더 세포의 최적의 농도를 시드하는 것이 중요하다는 것을 발견. 특히, PDC 개발에 적합 다음날, 포화 상태에 5.9x10 12 웰 플레이트 결과 4 γ-조사 AC-6 세포를 파종. 낮은 AC-6 세포 밀도 (3.9x10 4 / 웰 12 웰 플레이트에) CDC의 developmen는을 지원하는 경향이있다T (24). 따라서, 배양 시스템 (23)을 확장 할 때의 조건을 최적화하기 위해 AC-106 세포의 농도가 1 시드 여러 것을 권장한다. 또한, AC-106 세포가 빈틈없이 통로 번호에주의를 포함하여 유지하고, 포화 상태에 도달하도록 허용하지 않을 수 있다는 것이 중요하다. 혼잡 또는 통로 번호가 20보다 큰 경우에 방치하면, 이들 세포가 시험관 내에서 조혈을 지원하는 능력을 상실하는 경향이있다. 또한, 플로리다의 농도는 또한 DC의 개발에 영향을 미칩니다. 높은 용량으로 (100-200 NG / ㎖) 올라가고은 주로 24을 생성하는 동안 특히, 낮은 용량에서 (25-50 NG / ㎖) CDCS는 우선적으로 개발된다. AC-6 세포 밀도 및 FL 투여 이외에, 효율적이 배양 시스템에서 DC 개발 지원 FBS의 배치의 신중한 선택 절차의 성공 핵심이다.

체외에서 유래 CDCS 및 올라가고은 창피 수 있지만과의 CD11c + CD11b를 - - 그들의 표면 마커, 즉의 CD11c + CD11b를 + B220에 의해 tinguished B220 +, 각각 자신의 모폴로지는 현미경으로 식별 할 수 있습니다. 올라가고는 (그림 2), 둥근 모양의 작은 및 서스펜션에서 성장하는 동안 CDCS는 방추형, 큰 및 부착입니다. DC 분화의 반응 속도도 올라가고 이전 및 CDCS 나중에 나타나는으로 다르​​다. 또한, PDC 개발의 공정은 상당히 높은 AC-6 농도는 발전 처리를 고속화와 AC-6 세포 밀도에 의해 영향을 받는다. 또한 PDCS 개발 완료되므로,이 배양 계에 비해 PDCS CDCS의 비율이 서서히 이후 시점에서 다음 증가 죽기 시작 주목해야한다. 올라가고는 세포 사멸을 받아야 시작할 때 따라서,주기적인 현미경으로 DC 개발의 모니터링 및 유동 세포 계측법은 매우 결정하기 위해 권장합니다.

참고로, describ혼성 방식은 또한 CDP가 다른 DC 전구 세포에도 적용 할 수있다; 그러나, 이러한 세포에서 생성 된 주요 DC 인구도 높은 AC-6 농도 또는 플로리다 투여 량, CDCS (17)이다. CDP가의 낮은 PDC 가능성이 CDP-공급 장치 (11) 지대없는 16 시스템, 두 개의 서로 다른 체외 배양 시스템을 사용하여 다른 그룹의 보고서와 일치한다. 이러한 결과는 AC-6 피더 시스템 충실히 다른 전구 세포의 분화 잠재력을 반영 할 수 있음을 시사한다.

B220의 + -이 문화 시스템에서 생성 된 올라가고은하는 CD11c + CD11b를합니다. 또한, 이들은보다 CDCS 17, Tcf4 (E2-2 인코딩) 및 Rag1 두 PDC 특정 유전자의 상대적으로 높은 수준의, 그러나 (Id2)와, CDC-특정 유전자의 낮은 수준을 발현. 이러한 PDCS는 Siglec-H 및 BST2, 뮤린 PDCS의 특성으로 간주 마커 부족하더라도, 여전히 높은 수준의 생산 IFN-I보다 수CDCS을하고 수 포성 구내염 바이러스 (VSV) (24)에 감염된 경우 CD86을 상향 조절. 이것은이 올라가고는 불완전 차별화 있지만, 여전히 작동하는지 제시한다. 또한, 우리는 이미 성공적으로이 기술은 DC 개발의 연구를위한 가치있는 것을 확인, CLP를 17 일부터 PDC 개발에 IFN-I와 플로리다의 시너지 역할을 묘사하기 위해이 방법을 사용했다.

결론적으로, 우리는 여기 PDCS의 발달 또는 기능적 연구를 용이하게 할 수있는 AC-6 피더 공 배양 시스템을 사용하여, CLP를 소수으로부터 PDCS를 생성하는 간단하지만 효율적인 방법을 제시한다.

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Acknowledgments

우리는 박사에 감사드립니다. 시약을 제공 마르쿠스 만츠와 어빙 와이즈맨. 우리는 또한 각각 의학 및 NTU 병원의 국립 대만 대학에서 유세포 분석 및 우선의 셀 정렬 핵심 시설과 두 번째 핵심 연구소가 제공하는 서비스를 인정합니다. 이 작품은 과학 기술, 대만의 교육부에 의해 지원되었다 (가장 102-2320-B-002-030-MY3)과 국민 건강 연구소, 대만 (NHRI-EX102-10256SI과 NHRI-EX103-10256SI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 Biolegend 108408 linage marker
Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 Biolegend 108708 linage marker
Anti-mouse  CD11b (PE), cloneM1/70 Biolegend 101208 linage marker
Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 Biolegend 115508 linage marker
Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 Biolegend 103208 linage marker/FACS
Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 Biolegend 100308 linage marker
Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 Biolegend 100707 linage marker
Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 Biolegend 107608 linage marker
Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 Biolegend 116208 linage marker
Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 eBioscience 12-0900-83 linage marker
Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 Biolegend 135510 FACS
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 Biolegend 105824 FACS
Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 Biolegend 108106 FACS
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 Biolegend 135014 FACS
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 Biolegend 117328 FACS
Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 Biolegend 101206 FACS
FACSAria III BD Biosciences Cell sorter
FACS sorting tube  BD Biosciences 352054
FlowJo FlowJo LLC Flow analysis sofrware

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
  2. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).
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AC-6 공급 시스템을 사용하여 일반 림프 전구 세포에서 쥐 형질 수지상 세포의 <em>체외 세대</em>
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Chang, S., Pai, L. M., Lee, C. K. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. Vis. Exp. (105), e53211, doi:10.3791/53211 (2015).More

Chang, S., Pai, L. M., Lee, C. K. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. Vis. Exp. (105), e53211, doi:10.3791/53211 (2015).

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