In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.
Plasmacytoid dendritiska celler (pDCs) är kraftfulla typ I interferon (IFN-I) producerande celler som aktiveras som svar på infektion eller under inflammatoriska svar. Tyvärr är studiet av PDC-funktionen hindras av deras låga frekvens i lymfoida organ och befintliga metoder för in vitro DC generation gynnar främst produktionen av CDCs över pDCs. Här presenterar vi en unik metod för att effektivt generera pDCs från vanliga lymfoida stamceller (CLPS) in vitro. Specifikt beskrev protokollet beskriver hur du renar CLPS från benmärg och generera pDCs genom samodling med y-bestrålade AC-6 feeder-celler i närvaro av Flt3 ligand. En unik egenskap hos denna kultur systemet är att CLPS migrerar under AC-6-celler och bli gatsten område bildande celler, ett viktigt steg för att expandera pDCs. Morfologiskt distinkta DC, nämligen pDCs och CDCs, genererades efter ca 2 veckor med en sammansättning av 70-90% pDCs under optimala förhållanden. Typiskt är antalet pDCs som genereras genom detta förfarande ungefär 100-faldigt av antalet CLPS sådda. Därför är detta ett nytt system som man kraftfullt generera ett stort antal pDCs för att underlätta fortsatta studier i utvecklingen och funktionen hos dessa celler.
Dendritiska celler (DC) är professionella antigenpresenterande celler som spelar en viktig roll i att kontrollera immunsvar 1. Medan utvecklingsländerna är heterogena, kan de i stort sett delas in i två populationer, konventionell DCs (CDCs) och plasmacytoid DC (pDCs) 2,3. Förutom lymfoidorgan är CDCs och pDCs också i vävnader inklusive lungor, tarm och hud 2. Morfologin hos CDCs och pDCs skiljer, med CDCs uppvisar dendritliknande liknande utsprång och formen på pDCs är mer plasmacell-liknande. Dessutom är den gemensamma mus DC markör, CD11c, högre uttryckt på CDCs än på pDCs. Dessutom kan CDCs delas upp ytterligare i CD11b + CD24 – CDCs och CD11b – CD24 + CDCs, vilka båda uttrycker högre nivåer av MHC klass II och samstimulerande molekyler än gör pDCs 2. Mogna pDCs, å andra sidan, har visats att selektivt uttrycka Siglec-H och BST2 4. Functionally, CDCs är bättre antigenpresenterande celler än är pDCs; kan dock pDCs producera en stor mängd typ I interferon på virusinfektion eller inflammatorisk stimulering 5.
Både CDCs och pDCs är kortlivade, och därför måste ständigt fyllas från stamceller i benmärgen (BM) 6,7. Adoptiv överföring av gemensamma myeloida stamceller (CmpS) och de gemensamma lymfoida progenitorceller (CLPS) i letalt bestrålade möss visar att CDCs och pDCs kan genereras från båda linjerna 8-10. Det finns dock en delmängd av pDCs som uttrycker RAG1 / 2 och besitter omlagrade DJ segment på IgH-locuset 11,12. Dessa celler delar också molekylära likheter med B-lymfocyter, inklusive uttryck av B220 markör, nukleinsyra kännande receptorer (TLR7 / TLR9), och transkriptionsfaktorer (SPIB och Bcl11a) 13, har alla tros vara underskrifter lymfoida. Därför CLPs kan vara bra val för in vitro generation pDCs grund av härstamning likhet.
Medan frekvensen av både CDCsen och pDCs hos människor och möss är mycket låg 6, DCs, särskilt CDCs, kan genereras in vitro från BM eller progenitorer i närvaro av cytokiner, såsom GM-CSF 11,14 eller Flt3-ligand (FL ) med hjälp av matarfria system 11,15,16. Olyckligtvis är det emellertid inte möjligt att framställa ett stort antal pDCs in vitro med användning FL 11,15,16. Tidigare visade vi att pDCs effektivt kan genereras in vitro från CLPS med hjälp av AC-6 matningssystemet 17. Fördelen med att använda en AC-6 stromala cellinje i odlingssystemet är att det ger cell-cellkontakt och utsöndring av cytokiner som stödjer generering av stora antal pDCs från CLPS. Även om produktion med detta system är ganska robust, noggrann replikering av de förfaranden som beskrivs nedan krävs iör att säkerställa en effektiv generering av pDCs.
Här beskriver vi ett in vitro-odlingssystem för den robusta generationen DC och pDCs i synnerhet från ett litet antal CLPS. Det unika med denna odlingssystemet är på grund av användningen av AC-6-celler, en stromala cellinje, som matare. Detta tillvägagångssätt har visat sig ge inte bara de cytokiner, såsom IL-7, SCF, M-CSF och FL 20, men också den cell-cellkontakt 21 nödvändigt för att stödja DC utveckling. AC-6-celler har tidigare använts för att underlätta studier av <…
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma för Dr.. Markus Manz och Irving Weissman för åstad reagens. Vi erkänner också den tjänst som tillhandahålls av flödescytometrisk analys och cellsortering Core Facility av första och andra kärn Laboratory vid National Taiwan University College of Medicine och NTU sjukhus, respektive. Detta arbete stöddes av ministeriet för vetenskap och teknik, Taiwan (MEST 102-2320-B-002-030-My3) och de nationella Health Research Institutes, Taiwan (NHRI-EX102-10256SI och NHRI-EX103-10256SI).
Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 | Biolegend | 108408 | linage marker |
Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 | Biolegend | 108708 | linage marker |
Anti-mouse CD11b (PE), cloneM1/70 | Biolegend | 101208 | linage marker |
Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 | Biolegend | 115508 | linage marker |
Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 | Biolegend | 103208 | linage marker/FACS |
Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 | Biolegend | 100308 | linage marker |
Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 | Biolegend | 100707 | linage marker |
Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 | Biolegend | 107608 | linage marker |
Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 | Biolegend | 116208 | linage marker |
Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 | eBioscience | 12-0900-83 | linage marker |
Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 | Biolegend | 135510 | FACS |
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 | Biolegend | 105824 | FACS |
Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 | Biolegend | 108106 | FACS |
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 | Biolegend | 135014 | FACS |
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 | Biolegend | 117328 | FACS |
Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 | Biolegend | 101206 | FACS |
FACSAria III | BD Biosciences | Cell sorter | |
FACS sorting tube | BD Biosciences | 352054 | |
FlowJo | FlowJo LLC | Flow analysis sofrware |