Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

In vitro Generation af murint Plasmacytoide dendritiske celler fra fælles Lymfoid progenitorer ved hjælp af AC-6 Feeder System

doi: 10.3791/53211 Published: November 23, 2015

Abstract

-plasmacytoide Dendritiske celler (pdCs) er stærke type I interferon (IFN-i) producerende celler, der aktiveres som reaktion på infektion eller under inflammatoriske reaktioner. Desværre undersøgelse af PDC-funktionen er hæmmet af deres lave frekvens i lymfoide organer, og eksisterende metoder til in vitro-DC generation overvejende favorisere produktionen af CDCS løbet pdCs. Her præsenterer vi en unik tilgang til effektivt at generere pdCs fra fælles lymfoide progenitorer (CLPs) in vitro. Specifikt protokollen beskrevet detaljer, hvordan man oprense CLPs fra knoglemarv og generere pdCs ved co-dyrkning med y-bestrålet AC-6 fødeceller i nærværelse af Flt3 ligand. En unik egenskab ved denne kultur-systemet er, at CLPs migrere nedenunder AC-6 celler og bliver brostensbelagte område-dannende celler, et afgørende skridt for at udvide pdCs. Morfologisk forskellige DC'er, nemlig pdCs og CDCS, blev genereret efter cirka 2 uger med en sammensætning 70-90% pdCs under optimale betingelser. Typisk er antallet af pdCs genereret ved denne fremgangsmåde er omtrent 100 gange antallet af CLPs podede. Derfor er dette et nyt system med at generere robust det store antal pdCs nødvendige for at lette yderligere undersøgelser af udvikling og funktion af disse celler.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dendritiske celler (DC'er) er professionelle antigenpræsenterende celler, som spiller en vigtig rolle i at kontrollere immunresponser 1. Mens DC'er er heterogene, kan de groft inddeles i to populationer, konventionel DCs (CDCS) og plasmacytoide DCs (pdCs) 2,3. Ud over lymfoide organer, er CDCS og pdCs også fundet i væv, herunder lunge, tarm og hud 2. Morfologi CDCS og pdCs afviger med CDCS udviser dendritceller fremspring og formen af ​​pdCs er mere plasma-celle-lignende. Desuden er den fælles muse DC markering, CD11, mere stærkt udtrykt på CDCS end på pdCs. Desuden kan CDCS opdeles yderligere i CD11 + CD24 - CDCS og CD11b - CD24 + CDCS, som begge udtrykker højere niveauer af MHC klasse II og costimulerende molekyler end gøre pdCs 2. Modne pdCs, på den anden side, har vist sig at udtrykke selektivt Siglec-H og BST2 4. Functionally, CDCS er bedre antigen-præsenterende celler, end er pdCs; dog kan pdCs producere en stor mængde af type I-interferon efter virusinfektion eller inflammatorisk stimulering 5.

Både CDCS og pdCs er kortvarig, og derfor skal der konstant genopfyldes fra stamfædre i knoglemarven (BM) 6,7. Adoptiv overførsel af fælles myeloide progenitorer (CMPs) og fælles lymfoide progenitorer (CLPs) i dødeligt bestrålede mus-viser, at CDCS og pdCs kan genereres fra begge slægter 8-10. Men der er en delmængde af pdCs som udtrykker RAG1 / 2 og besidder omlejrede DJ segmenter på IgH locus 11,12. Disse celler deler også molekylære ligheder med B-lymfocytter, herunder udtryk for B220 markør, nukleinsyre-sensing receptorer (TLR7 / TLR9), og transkriptionsfaktorer (SPIB og Bcl11a) 13, har alle menes at være underskrifter fra den lymfoide afstamning. Derfor CLPs kan være gode valg for in vitro-generering af pdCs grund af afstamning lighed.

Mens hyppigheden af både CDCS og pdCs hos mennesker og mus er meget lav 6, DC'er, især CDCS, kan genereres in vitro fra BM eller progenitorceller i nærvær af cytokiner, såsom GM-CSF 11,14 eller Flt3 ligand (FL ) ved hjælp af feeder-fri systemer 11,15,16. Desværre er det ikke muligt at fremstille store antal af pdCs in vitro under anvendelse FL 11,15,16. Tidligere vi demonstreret, at pdCs effektivt kan genereres in vitro fra CLPs ved hjælp af AC-6 fødesystem 17. Fordelen ved at anvende AC-6 stromacellelinje i kulturen er, at det giver celle-celle-kontakt og udskillelse af cytokiner, der understøtter dannelsen af ​​et stort antal pdCs fra CLPs. Selv om produktionen med dette system er ganske robust, omhyggelig replikation af de procedurer, der er beskrevet nedenfor kræves in For at sikre en effektiv generation af pdCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

C57BL / 6 vildtype-mus blev købt fra National Laboratory Animal Center (NLAC), Taiwan. Alle mus blev avlet og holdt under specifikke patogenfrie betingelser. Protokoller og bruge dyr procedurer blev revideret og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for National Taiwan University College of Medicine (Tilladelse nummer: 20120075). Desuden forskerne gjort alt for at mindske risikoen for smerte, lidelse eller angst i dyrene, mens de udfører eksperimenter. Alle beskrevne procedurer blev udført ved RT mens iført handsker.

1. Fremstilling af AC-6 celler Feeder

Bemærk: AC-6,21 (AC-6 i korte) stromacellelinje 18 (tilvejebragt af I. Weissman, Stanford University) bør opretholdes i RPMI suppleret med 15% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS). At tjene som fødeceller, AC-6 celler er γ-bestrålet med 3.000 rad (30Gy) en dag før co-kultur for at forhindre deres proliferation. Bemærk thpå AC-6 celler tendens til at miste deres differentiering-understøttende evne hvis venstre overfyldte under vedligeholdelse, eller hvis deres passage nummer er over 20.

  1. Wash AC-6 celler en gang med 1 ml Dulbeccos phosphatbufret saltvand (DPBS) og fjern DPBS ved aspiration. Treat AC-6 celler med 0,8 ml trypsin-opløsning (0,05% trypsin og 0,5 mM EDTA i DPBS) i 3-5 min ved 37 ° C, 5% CO2 og derefter standse reaktionen ved fortynding med 10 volumener dyrkningsmedium til gøre enkelt cellesuspension.
  2. Seed AC-6 celler ved 5.9x10 4 celler / brønd i 12-brønds plader og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO 2 O / N.
    Bemærk: Densiteten af ​​AC-6 celler er meget vigtigt, da en lavere densitet vil favorisere CDC generation. Podning med en densitet på 5.9x10 4 celler / brønd vil give AC-6 for at nå konfluens ved den næste dag, som er optimal for afledning af pdCs fra CLPs.
  3. Bestråle AC-6 celler ved 3000 rad (30 Gy) under anvendelse af γ-strålerøret.
    Note: Den anvendte dosis til at bestråle AC-6 er optimeret til at forhindre cellerne i prolifererende og alligevel holde dem levedygtige længe nok til at levere de cytokiner og celle-celle-kontakt er nødvendige for differentiering af DC'er fra CLPs.
  4. Aspirer medium og erstatte med 1 ml komplet RPMI (RPMI med 10% varmeinaktiveret FBS, 50 ug / ml gentamycin og 50 uM β-mercaptoethanol).

2. Isoler BM Celler fra mus

  1. Sacrifice mus ved CO 2 kvælning og cervikal dislokation. Placer mus på en dissektion bakke og sterilisere med 70% ethanol. Lave et snit i midten af ​​underlivet og fjerne huden fra den distale del af musen, herunder huden, der dækker de nedre ekstremiteter.
  2. Dissekere mus i en semi-sterile hætte. For at frigøre lårben og skinneben, klip ovenfor lårben og skinneben under knæet fælles. Frigør musklerne fra knoglerne ved hjælp af en saks og placere knoglerne i en 6 cm petriskål indeholdende 5 ml komplet RPMI.
  3. Flyt til en steril kultur hætte. Fyld en sprøjte 3 ml forbundet til en 27G nål med komplet RPMI. Skær begge ender af knoglerne ved hjælp af en saks, og indsæt 27G nål til at skylle marven ud af knoglerne ved forsigtigt at injicere komplet RPMI én gang fra hver ende.
  4. Der fremstilles en enkelt cellesuspension ved forsigtig pipettering cellerne op og ned 3-5 gange i dyrkningsskålen ved hjælp af sprøjten uden nålen.
  5. Centrifuger cellerne i 5 minutter ved 500 xg og dekanter supernatanten.
  6. Lyserer røde blodlegemer med 1 ml ACK buffer (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA) inkubering i 1 min og standsning af reaktionen ved fortynding med 10 volumener komplet RPMI. Tillad celler til at stå i 5 minutter for at pelletere ned døde celleklynger og vævsrester af tyngdekraften.
    Bemærk: Du må ikke stå mere end 5 min, da dette vil resultere i celle tab som følge af afregning af levedygtige celler.
  7. Langsomt dekanteres celle-holdige supernatant til et nyt rør forlader snavsbag i den oprindelige rør.
  8. Centrifugeres i 5 minutter ved 500 xg for at pelletere cellerne, derefter fjerne og kassere supernatanten.
  9. Resuspender samlede BM-celler (typisk 4-6 x 10 7 BM celler opnås fra en mus) i 100 pi FACS buffer (1x PBS + 2% FBS + 1 mM EDTA).

3. FACS-analyse og sortering af CLPs

  1. Tilføj anti-CD16 / 32 (hybridoma supernatanten klon 2.4G2, 50 pi / reaktion eller 1-2 ug / reaktion) i celler i FACS-buffer (trin 2.9) i 1-2 min for at blokere Fc-receptorer.
    Bemærk: Anti-CD16 / 32, også kaldet Fc blok, som tilsættes for at forhindre ikke-specifik binding af antistoffer til celler, der udtrykker Fc-receptorer, herunder granulocytter, monocytter og B-lymfocytter.
  2. Samtidig farvning celler med følgende fluorescerende farvestof-mærkede antistoffer (for 4x10 7 celler) i 15 minutter på is, undgår omgivende lys. Antistoffer: PE-konjugerede afstamning markører (0,2 ug hver), herunder anti-CD3 (17a2), anti-CD8 (53-6.7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD19 (eBio1D3), anti-CD11b (M1 / 70), anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti- Thy 1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-TER119 (TER-119), og anti-MHC-II (Nimr-4), 0,2 ug anti-c-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 ug anti-Sca-1-FITC (D7), 0,4 ug anti-M-CSFR-APC (AFS98) og 0,2 ug anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
  3. Vask cellerne med 3 ml FACS-buffer, og centrifugeres i 5 minutter ved 500 x g.
  4. Resuspender cellerne i 300 pi FACS buffer og filterceller gennem en 40 uM cellefilter.
  5. Vask rør med yderligere 100 pi FACS-buffer til at inddrive eventuelle resterende celler og filtreres over i en steril FACS sortering rør ved hjælp af den samme celle si.
  6. Udfør flowcytometrisk analyse umiddelbart efter farvningen ved hjælp af passende filtre og spændinger for detekteringssignal. Brug 488 nm laser til at registrere de FITC-, PerCP-Cy5.5-mærkede antistoffer, 561 nm laser til at registrere PE- og PE-Cy7-labelded antistoffer og 633 nm lasER at detektere APC-mærket antistof.
  7. Sortere ud CLPs henhold til følgende markører lin - c-kit int Sca-1 int M-CSFR - IL-7Rα + (som farvet i trin 3.2) med en cellesorterer. Indsamle de sorterede celler i et 15 ml rør indeholdende 8 ml komplet RPMI som en pude.
  8. Optag det absolutte antal sorterede celler som vist ved cellesorteringsapparatet ved afslutningen af ​​kørslen. Typisk kan 5x10 4 CLPs fås hos BM af en mus.

4. cokultur CLPs og AC-6

  1. Centrifuger sorterede celler fra trin 3.7 i 10 minutter ved 500 xg, fjern supernatanten og resuspender cellepelleten med tilstrækkelig komplet RPMI for at opnå en celletæthed omkring 5x10 4 celler / ml. Seed 500 celler / brønd i 12-brønds plade indeholdende fødeceller fremstillet i trin 1.4.
  2. Tilsæt 100 ng / ml FL 19 (hu-Flt3L-Ig genereres internt ved hjælp af et ekspressionssystem, som M. Manz, University Hospital Zurich, Schweiz) og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 med periodisk visuel overvågning af udviklingen DC under et mikroskop.
    Bemærk: Kommercielt tilgængelig rekombinant humant eller muse FL FL kan anvendes som en erstatning for hu-Flt3L-Ig til at støtte DC udvikling.
  3. Opsamle cellerne i supernatanten på dag 12 og brøndene vaskes en gang med 0,5 ml komplet RPMI-medium kombinere de resulterende supernatanter. Tilføj 0,5 ml frisk medium og skrot de adhærente celler med en celle skraber.
  4. Kombiner celle-holdige medium fra begge dele og centrifugeres i 5 minutter ved 500 x g.
  5. Dekanteres supernatanten og resuspender cellerne i 50 pi FACS-buffer. Der tilsættes 50 pi anti-CD16 / 32 hybridomsupernatant og inkuberes i 1-2 min for at blokere Fc-receptorer.
  6. Opregne og plette alle cellerne med følgende antistoffer (0,05 ug hver) anti-CD11c-APC (N418), anti-CD11-FITC og anti-B220-PE.
  7. Vask og centrifuger celler som beskriverd i trin 3.3.
  8. Resuspender cellerne i 100 ul FACS-buffer, gate på CD11 c + og analysere for CDCS (CD11c + CD11b + B220 -) og pdCs (CD11c + CD11b - B220 +) 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I alt 4-6x10 7 BM-celler er typisk isoleret fra lårben og skinneben i en 6-8 uger gamle, vildtype C57BL / 6 mus. At sortere ud CLPs de samlede BM-celler farvet med PE-konjugeret antistoffer mod afstamning markører (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy 1.1, NK1.1, TER119 og MHC-II), anti -c-Kit-PerCP / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-CSFR-APC og anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analyseres og sorteres med en cellesorterer. Den sortering strategi for CLP er vist i figur 1. Typisk 5x10 4 CLPs fremstillet af en C57BL / 6 mus. For at få flere CLPs, kan BM celler fra 3-4 mus kombineres og protokol justeres før sorteringen.

Efter cokultur af 500 CLPs med 5.9x10 6 AC-6 feederceller, brostensbelagte område-dannende celler (CAFC) begynder at dukke efter dag 3-4. Ved dag 8, rund form pdCs vises, og suspenderer oven på CAFC (figur 2A). Antallet af pdCs toppe omkring day 12-14 på hvilket tidspunkt pdCs begynder at undergå apoptose efter deres fulde udvikling, og tallene begynder gradvist at falde. CDC kolonier vises senest PDC kolonier, på dag 6-8, og morfologien af CDCS er større, spindel-lignende, og vedhængende (figur 2B).

Typisk kan 5-6x10 4 celler dannes ud fra 500 CLPs efter 2 ugers cokultur. Efter farvning af cellerne med anti-CD11-APC, anti-CD11-FITC og anti-B220-PE, analyse ved flowcytometri viser, at andelen af pdCs (CD11c + CD11b - B220 +) og CDCS (CD11c + CD11b + B220 - ) er 91% og 6% (figur 3). Derfor, med denne metode pdCs kan udvides så meget som 100-fold.

Figur 1
Figur 1. Gating strategier for CLPs. BM-celler isones fra en mus blev farvet med fluorescens-mærkede antistoffer og analyseret for CLPs, som blev defineret som lin - c-Kit int Sca-1 int M-Tjekkoslovakiet -. IL-7Rα + Klik her for at se en større version af dette tal .

Figur 2
Figur 2. morfologi CDC og pdc kolonier i CLP-AC-6 cokulturer. 500 CLPs blev dyrket sammen med y-bestrålet AC-6 fødeceller i nærvær af 100 ng / ml FL. (A) PDC kolonier på dag 8, 10 og 12, og (B) CDC kolonier på dag 8, 12 og 16 blev fotograferet under lysmikroskopi ved 200 x (skala bar 50 pm). Klik her for at se et largER version af denne figur.

Figur 3
Figur 3. Flow cytometrisk analyse af CLP-afledte pdCs og CDCS. Fem hundrede CLPs og y-bestrålet AC-6 fødeceller (5.9x10 4 / ml) blev samdyrket in vitro i 12 dage i nærvær af FL (100 ng / ml ). Cellerne blev farvet med anti-CD11-APC, anti-CD11-FITC og anti-B220-PE og analyseret ved flowcytometri. Celler blev først gated på CD11c + og derefter analyseret for CDCS (CD11c + CD11b + B220 -) og pdCs (CD11c + CD11b - B220 +). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her beskriver vi et in vitro kultursystem for den robuste generation af DC'er og pdCs navnlig fra et lille antal CLPs. Det unikke ved denne dyrkningssystem skyldes anvendelsen af ​​AC-6 celler, en stromacellelinje, som foderautomater. Har vist denne fremgangsmåde for at tilvejebringe ikke kun cytokiner, såsom IL-7, SCF, M-CSF og FL 20, men også celle-celle-kontakt 21 nødvendigt at støtte DC udvikling. AC-6 celler er blevet anvendt tidligere for at lette undersøgelsen af in vitro DC udvikling fra flere progenitorer 8,16,22. Vi fandt, at det er afgørende at pode en optimal tæthed af AC-6 fødeceller at understøtte den effektive differentiering af pdCs fra CLPs. Specifikt såning 5.9x10 4 y-bestrålet AC-6-celler i 12-brøndsplader resulterer i sammenflydning den næste dag, som er egnet til pDC udvikling. En lavere AC-6 celletæthed (3.9x10 4 / brønd i 12-brønds plade) har tendens til at støtte CDC UDVIKLINGSt 24. Derfor anbefales det at første frø adskillige koncentrationer af AC-6 celler med henblik på at optimere betingelser, når opskalering af dyrkningssystemet 23. Desuden er det også vigtigt, at AC-6 celler omhyggeligt bevares, meget opmærksom på passage nummer, og aldrig tilladt at nå konfluens. Hvis venstre overfyldte eller hvis deres passage nummer er større end 20, disse celler tendens til at miste evnen til at understøtte hæmatopoiese in vitro. Derudover er koncentrationen af ​​FL påvirker også DC udvikling. Specifikt ved lave doser (25-50 ng / ml) CDCS er fortrinsvis udviklet, mens ved høje doser (100-200 ng / ml) pdCs overvejende genereres 24. Ud over at AC-6 celletæthed og FL dosering, omhyggelig udvælgelse af en batch af FBS, der effektivt understøtter DC udviklingen i denne kultur-systemet er centralt for succesen af ​​proceduren.

Mens in vitro-afledte CDCS og pdCs kan være dissig især ud ved deres overflademarkører, nemlig CD11c + CD11b + B220 - og CD11c + CD11b - B220 + henholdsvis deres morfologier også ses med mikroskopi. CDCS er større, spindel-formet og er klæbende, mens pdCs er mindre, rund og vokse i suspension (figur 2). Kinetikken for DC differentiering adskiller sig også med pdCs forekommer tidligere og CDCS senere. Derudover er processen med pDC udvikling væsentligt påvirket af AC-6 celletæthed med højere AC-6 densitet fremskynde udviklingsprocessen. Det skal bemærkes, at pdCs begynder at dø efter den fuldstændige udvikling og dermed forholdet mellem CDCS versus pdCs i dette dyrkningssystem øges gradvist på senere tidspunkter. Derfor er periodisk monitorering af DC udvikling ved mikroskopi og flowcytometri stærkt anbefales med henblik på at bestemme, hvornår pdCs begynder at undergå apoptose.

Af note, described fremgangsmåde kan også anvendes på andre DC-progenitorer, såsom CDPs; Men den væsentligste DC population genereret fra disse celler er CDCS 17, selv ved høje AC-6 tætheder eller FL doser. Den lave pDC potentiale CDPs er i overensstemmelse med rapporter fra forskellige grupper ved hjælp af enten CDP-feeder 11 eller arkføder-fri 16 systemer, to forskellige in vitro dyrkningssystemer. Disse resultater antyder, at AC-6 fødesystem trofast kan afspejle differentieringen potentiale forskellige progenitorer.

PdCs genereret fra dette dyrkningssystem er CD11c + CD11b - B220 +. Desuden har de udtrykker relativt høje niveauer af Tcf4 (koder E2-2) og RAG1, to pDC-specifikke gener, men lavere niveauer af ID2 en CDC-specifikt gen, end at gøre CDCS 17. Selvom disse pdCs mangler Siglec-H og BST2, markører anses karakteristisk for murine pdCs, er de stadig i stand til at producere højere niveauer af IFN-I endgøre CDCS og opregulere CD86, når inficeret med vesikulær stomatitis-virus (VSV) 24. Dette antyder, at disse pdCs, men ufuldstændigt differentieret, er stadig funktionel. Desuden har vi allerede med succes anvendt denne metode til at afgrænse en synergistisk rolle IFN-I og FL i PDC udvikling fra CLPs 17, bekræfter, at denne teknik er værdifuldt for studiet af DC udvikling.

Afslutningsvis her præsenterer vi en enkel, men effektiv, metode til at generere pdCs fra et lille antal CLPs ved hjælp af AC-6 feeder cokultur system, som kan lette udviklingsmæssige eller funktionelle studier af pdCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for Drs. Markus Manz og Irving Weissman til tilvejebringelse reagenser. Vi anerkender også den service, som den flowcytometrianalyse og Cell Sortering Core Facility for første og anden Core Laboratory ved National Taiwan University College of Medicine og NTU hospital hhv. Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Taiwan (MEST 102-2320-B-002-030-MY3) og National Health Research Institutes, Taiwan (NHRI-EX102-10256SI og NHRI-EX103-10256SI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 Biolegend 108408 linage marker
Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 Biolegend 108708 linage marker
Anti-mouse  CD11b (PE), cloneM1/70 Biolegend 101208 linage marker
Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 Biolegend 115508 linage marker
Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 Biolegend 103208 linage marker/FACS
Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 Biolegend 100308 linage marker
Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 Biolegend 100707 linage marker
Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 Biolegend 107608 linage marker
Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 Biolegend 116208 linage marker
Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 eBioscience 12-0900-83 linage marker
Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 Biolegend 135510 FACS
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 Biolegend 105824 FACS
Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 Biolegend 108106 FACS
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 Biolegend 135014 FACS
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 Biolegend 117328 FACS
Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 Biolegend 101206 FACS
FACSAria III BD Biosciences Cell sorter
FACS sorting tube  BD Biosciences 352054
FlowJo FlowJo LLC Flow analysis sofrware

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
  2. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S. Development and Function of Dendritic Cell Subsets. Immunity. 40, 642-656 (2014).
  4. Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).
  5. Liu, Y. J. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).
  6. Merad, M., Manz, M. G. Dendritic cell homeostasis. Blood. 113, 3418-3427 (2009).
  7. Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells. Immunity. 33, 905-916 (2010).
  8. Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).
  9. Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 97, 3333-3341 (2001).
  10. D'Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).
  11. Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121, 11-19 (2013).
  12. Shigematsu, H., et al. Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin. Immunity. 21, 43-53 (2004).
  13. Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions. Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).
  14. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).
  15. Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).
  16. Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).
  17. Chen, Y. L., et al. A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors. J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).
  18. Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule. Cell. 48, 1009-1021 (1987).
  19. Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development. J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).
  20. Szilvassy, S. J., et al. Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells. Blood. 87, 4618-4628 (1996).
  21. Arcanjo, K., et al. Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024. J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).
  22. Onai, N., et al. A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential. Immunity. 38, 943-957 (2013).
  23. Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21. Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).
  24. Chen, Y. -L., Chang, S., Chen, T. -T., Lee, C. -K. Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand. PLoS ONE. 10, (8), e0135217 (2015).
<em>In vitro</em> Generation af murint Plasmacytoide dendritiske celler fra fælles Lymfoid progenitorer ved hjælp af AC-6 Feeder System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, S., Pai, L. M., Lee, C. K. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. Vis. Exp. (105), e53211, doi:10.3791/53211 (2015).More

Chang, S., Pai, L. M., Lee, C. K. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. Vis. Exp. (105), e53211, doi:10.3791/53211 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter