In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.
-plasmacytoide Dendritiske celler (pdCs) er stærke type I interferon (IFN-i) producerende celler, der aktiveres som reaktion på infektion eller under inflammatoriske reaktioner. Desværre undersøgelse af PDC-funktionen er hæmmet af deres lave frekvens i lymfoide organer, og eksisterende metoder til in vitro-DC generation overvejende favorisere produktionen af CDCS løbet pdCs. Her præsenterer vi en unik tilgang til effektivt at generere pdCs fra fælles lymfoide progenitorer (CLPs) in vitro. Specifikt protokollen beskrevet detaljer, hvordan man oprense CLPs fra knoglemarv og generere pdCs ved co-dyrkning med y-bestrålet AC-6 fødeceller i nærværelse af Flt3 ligand. En unik egenskab ved denne kultur-systemet er, at CLPs migrere nedenunder AC-6 celler og bliver brostensbelagte område-dannende celler, et afgørende skridt for at udvide pdCs. Morfologisk forskellige DC'er, nemlig pdCs og CDCS, blev genereret efter cirka 2 uger med en sammensætning 70-90% pdCs under optimale betingelser. Typisk er antallet af pdCs genereret ved denne fremgangsmåde er omtrent 100 gange antallet af CLPs podede. Derfor er dette et nyt system med at generere robust det store antal pdCs nødvendige for at lette yderligere undersøgelser af udvikling og funktion af disse celler.
Dendritiske celler (DC'er) er professionelle antigenpræsenterende celler, som spiller en vigtig rolle i at kontrollere immunresponser 1. Mens DC'er er heterogene, kan de groft inddeles i to populationer, konventionel DCs (CDCS) og plasmacytoide DCs (pdCs) 2,3. Ud over lymfoide organer, er CDCS og pdCs også fundet i væv, herunder lunge, tarm og hud 2. Morfologi CDCS og pdCs afviger med CDCS udviser dendritceller fremspring og formen af pdCs er mere plasma-celle-lignende. Desuden er den fælles muse DC markering, CD11, mere stærkt udtrykt på CDCS end på pdCs. Desuden kan CDCS opdeles yderligere i CD11 + CD24 – CDCS og CD11b – CD24 + CDCS, som begge udtrykker højere niveauer af MHC klasse II og costimulerende molekyler end gøre pdCs 2. Modne pdCs, på den anden side, har vist sig at udtrykke selektivt Siglec-H og BST2 4. Functionally, CDCS er bedre antigen-præsenterende celler, end er pdCs; dog kan pdCs producere en stor mængde af type I-interferon efter virusinfektion eller inflammatorisk stimulering 5.
Både CDCS og pdCs er kortvarig, og derfor skal der konstant genopfyldes fra stamfædre i knoglemarven (BM) 6,7. Adoptiv overførsel af fælles myeloide progenitorer (CMPs) og fælles lymfoide progenitorer (CLPs) i dødeligt bestrålede mus-viser, at CDCS og pdCs kan genereres fra begge slægter 8-10. Men der er en delmængde af pdCs som udtrykker RAG1 / 2 og besidder omlejrede DJ segmenter på IgH locus 11,12. Disse celler deler også molekylære ligheder med B-lymfocytter, herunder udtryk for B220 markør, nukleinsyre-sensing receptorer (TLR7 / TLR9), og transkriptionsfaktorer (SPIB og Bcl11a) 13, har alle menes at være underskrifter fra den lymfoide afstamning. Derfor CLPs kan være gode valg for in vitro-generering af pdCs grund af afstamning lighed.
Mens hyppigheden af både CDCS og pdCs hos mennesker og mus er meget lav 6, DC'er, især CDCS, kan genereres in vitro fra BM eller progenitorceller i nærvær af cytokiner, såsom GM-CSF 11,14 eller Flt3 ligand (FL ) ved hjælp af feeder-fri systemer 11,15,16. Desværre er det ikke muligt at fremstille store antal af pdCs in vitro under anvendelse FL 11,15,16. Tidligere vi demonstreret, at pdCs effektivt kan genereres in vitro fra CLPs ved hjælp af AC-6 fødesystem 17. Fordelen ved at anvende AC-6 stromacellelinje i kulturen er, at det giver celle-celle-kontakt og udskillelse af cytokiner, der understøtter dannelsen af et stort antal pdCs fra CLPs. Selv om produktionen med dette system er ganske robust, omhyggelig replikation af de procedurer, der er beskrevet nedenfor kræves in For at sikre en effektiv generation af pdCs.
Her beskriver vi et in vitro kultursystem for den robuste generation af DC'er og pdCs navnlig fra et lille antal CLPs. Det unikke ved denne dyrkningssystem skyldes anvendelsen af AC-6 celler, en stromacellelinje, som foderautomater. Har vist denne fremgangsmåde for at tilvejebringe ikke kun cytokiner, såsom IL-7, SCF, M-CSF og FL 20, men også celle-celle-kontakt 21 nødvendigt at støtte DC udvikling. AC-6 celler er blevet anvendt tidligere for at lette undersøgelsen af i…
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for Drs. Markus Manz og Irving Weissman til tilvejebringelse reagenser. Vi anerkender også den service, som den flowcytometrianalyse og Cell Sortering Core Facility for første og anden Core Laboratory ved National Taiwan University College of Medicine og NTU hospital hhv. Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Taiwan (MEST 102-2320-B-002-030-MY3) og National Health Research Institutes, Taiwan (NHRI-EX102-10256SI og NHRI-EX103-10256SI).
Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 | Biolegend | 108408 | linage marker |
Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 | Biolegend | 108708 | linage marker |
Anti-mouse CD11b (PE), cloneM1/70 | Biolegend | 101208 | linage marker |
Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 | Biolegend | 115508 | linage marker |
Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 | Biolegend | 103208 | linage marker/FACS |
Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 | Biolegend | 100308 | linage marker |
Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 | Biolegend | 100707 | linage marker |
Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 | Biolegend | 107608 | linage marker |
Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 | Biolegend | 116208 | linage marker |
Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 | eBioscience | 12-0900-83 | linage marker |
Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 | Biolegend | 135510 | FACS |
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 | Biolegend | 105824 | FACS |
Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 | Biolegend | 108106 | FACS |
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 | Biolegend | 135014 | FACS |
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 | Biolegend | 117328 | FACS |
Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 | Biolegend | 101206 | FACS |
FACSAria III | BD Biosciences | Cell sorter | |
FACS sorting tube | BD Biosciences | 352054 | |
FlowJo | FlowJo LLC | Flow analysis sofrware |