Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

במבחנה הדור של תאי דנדריטים Murine Plasmacytoid מנפוצים הלימפה אבות באמצעות מערכת מזין AC-6

doi: 10.3791/53211 Published: November 23, 2015

Abstract

תאים הדנדריטים Plasmacytoid (PDC) הם סוג חזק אני אינטרפרון תאים (IFN-I) ייצור המופעלים בתגובה לזיהום או בתגובות דלקתיות. למרבה הצער, מחקר של פונקצית PDC מתעכבת לפי התדירות הנמוכה שלהם באיברי הלימפה, ושיטות קיימות במבחנת דור DC בעיקר להעדיף הייצור של cDCs על pDCs. כאן אנו מציגים גישה ייחודית ליצירת יעילות pDCs מאבות הלימפה נפוצים (CLPs) במבחנה. באופן ספציפי, הפרוטוקול מתואר פרטים כיצד לטהר CLPs ממח עצם וליצור pDCs ידי coculturing עם AC-6 תאים מזינים מוקרן γ בנוכחות יגנד FLT3. מאפיין ייחודי של מערכת זו התרבות הוא שCLPs להעביר מתחת לAC-6 תאים ולהפוך לתאי יוצרי שטח מרוצפים, צעד קריטי להרחבת pDCs. DCs מורפולוגית המובהק, כלומר pDCs וcDCs, נוצרו לאחר כ -2 שבועות עם הרכב של 7pDCs 0-90% בתנאים אופטימליים. בדרך כלל, מספר pDCs שנוצר בשיטה זו הוא בערך פי 100 ממספר CLPs זרע. לכן, מדובר במערכת חדשנית שבה ליצירה וחסונה המספר הגדול של pDCs הנדרש כדי להקל על מחקרים נוספים להתפתחות והתפקוד של תאים אלה.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תאים דנדריטים (DCS) הם תאי מציגי אנטיגן מקצועיים שמשחקים תפקיד חשוב בשליטה על תגובות 1 חיסונית. בעוד DCs הוא הטרוגנית, הם יכולים להיות מסווגים באופן כללי לשתי אוכלוסיות, DCS קונבנציונלי (cDCs) וDCs plasmacytoid (PDC) 2,3. בנוסף לאיברי הלימפה, cDCs וpDCs נמצאים גם ברקמות כוללים סרטן ריאות, מעי, ועור 2. המורפולוגיה של cDCs וpDCs שונה, עם cDCs מציג תחזיות כמו דנדריט-והצורה של pDCs להיות כמו תא-יותר פלזמה. בנוסף, סמן העכבר הנפוץ DC, CD11c, באה לידי ביטוי גבוה יותר על cDCs מאשר על pDCs. יתר על כן, cDCs ניתן לחלק עוד יותר לתוך CD11b + CD24 - cDCs וCD11b - CD24 + cDCs, אשר שניהם מבטאים רמות גבוהות יותר של כיתת MHC II ומולקולות costimulatory מאשר לעשות pDCs 2. pDCs מבוגרים, לעומת זאת, הוכח להביע Siglec-H וBST2 4 סלקטיבי. Functionally, cDCs הוא אנטיגן טוב יותר מאשר הצגת תאי pDCs; עם זאת, pDCs יכול לייצר כמות עצומה של סוג אני אינטרפרון על זיהום בנגיף או גירוי דלקתי 5.

cDCs וpDCs שניהם קצרים, ולכן, חייב להתחדש כל הזמן מאבות במח העצם (BM) 6,7. העברת מאמצת של אבות משותפים מיאלואידית (CMPS) ואבות הלימפה נפוצים (CLPs) לעכברים קטלני-המוקרנים מוכיחה כי יכולים להיות שנוצרו cDCs וpDCs משני השושלות 8-10. עם זאת, יש קבוצת משנה של pDCs המבטא RAG1 / 2 ויש מגזרי DJ מחדש במוקד IGH 11,12. תאים אלה גם לשתף דמיון מולקולרי עם לימפוציטים מסוג B, כוללים ביטוי של סמן B220, קולטני חישת חומצות גרעין (TLR7 / TLR9), וגורמי שעתוק (Spib וBcl11a) 13, כולל את כל האמינו להיות חתימות של השושלת הלימפה. לכן, CLPים עשוי להיות בחירה טובה עבור דור במבחנה של pDCs בגלל דמיון שושלת.

בעוד התדירות של שני cDCs וpDCs בבני אדם ועכברים היא מאוד נמוכה 6 פלורידה, DCS, במיוחד cDCs, יכול להיות שנוצר במבחנה מBM או אבות בנוכחות ציטוקינים, כגון GM-CSF 11,14 או יגנד FLT3 ( ) באמצעות מערכות ללא מזין 11,15,16. למרבה הצער, עם זאת, לא ניתן לייצר מספר גדול של pDCs במבחנה באמצעות FL 11,15,16. בעבר הראה כי pDCs יכול להיות שנוצר במבחנה ביעילות מCLPs באמצעות מערכת המזין AC-6 17. היתרון של שימוש בקו תא סטרומה AC-6 במערכת התרבות הוא שהיא מספקת מגע תאי תאים והפרשה של ציטוקינים התומכים בדור של מספר הגדול של pDCs מCLPs. למרות שייצור עם מערכת זו הוא די חזק, השכפול זהיר של ההליכים המתוארים להלן נדרש אניכדי n כדי להבטיח דור יעיל של pDCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

/ 6 עכברי wild-type C57BL נרכשו מהמרכז הלאומי בעלי החיים במעבדה (NLAC), טייוואן. כל העכברים התרבו וכל זמן תחת תנאי הפתוגן ללא ספציפיים. פרוטוקולים ונהלי שימוש בבעלי החיים היו נבדקו ואושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של לאומית טייוואן המכללה לרפואה של האוניברסיטה (הרשאה מס ': 20,120,075). בנוסף, חוקרים עשו כל מאמץ כדי לצמצם את הפוטנציאל לכאב, לסבל, או מצוקה בבעלי החיים בעת ביצוע ניסויים. כל ההליכים המתוארים בוצעו ב RT בכפפות.

1. הכנת AC-6 תאי מזין

הערה: AC-6.21 (AC-6 בקיצור) שורת תאי סטרומה 18 (המסופקת על ידי י 'וייסמן, אוניברסיטת סטנפורד) יש לשמור בRPMI בתוספת 15% בסרום חום מומת שור עוברי (FBS). לשמש כתאים מזינים, AC-6 תאים עם 3,000 rad (30Gy) יום אחד לפני שיתוף התרבות למניעת תפוצתם מוקרן γ. ה הערהבAC-6 תאים נוטים לאבד את היכולת לתמוך ב- ההתמיינות שלהם אם נותרו צפוף בתחזוקה, או אם מספר המעבר שלהם הוא מעל 20.

  1. לשטוף AC-6 תאים פעם אחת עם 1 מיליליטר פוספט שנאגר מלוח של Dulbecco (DPBS) ולהסיר DPBS על ידי שאיפה. פנק את AC-6 תאים עם 0.8 מיליליטר פתרון טריפסין (טריפסין 0.05% ו -0.5 מ"מ EDTA בDPBS) במשך 3-5 דקות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולאחר מכן לעצור את התגובה על ידי דילול זה עם 10 כרכים של מדיום תרבות להפוך את ההשעיה תא בודדת.
  2. זרע AC-6 תאים ב5.9x10 4 תאים / גם לתוך 12 גם צלחות ולדגור על 37 מעלות צלסיוס, 5% CO 2 O / N.
    הערה: הצפיפות של AC-6 תאים היא מאוד חשובה כמו צפיפות נמוכה תעדיף דור ה- CDC. זריעה בצפיפות של 5.9x10 4 תאים / גם יאפשר AC-6 כדי להגיע confluency ידי למחרת, שהוא אופטימלי לגזירה של pDCs מCLPs.
  3. מכשיר את AC-6 תאים ב3,000 רד (30 Gy) באמצעות γ-irradiator.
    הערה: המינון שניתן ללהקרין AC-6 הוא מותאם כדי למנוע את התאים ממתרבים ועדיין לשמור אותם קיימא מספיק זמן כדי לספק את ציטוקינים ומגע תאי תאים דרושים להתמיינות של DCs מCLPs.
  4. בינוני לשאוב ולהחליף עם 1 מיליליטר מלא RPMI (RPMI עם FBS מומת חום 10%, 50 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin וβ-mercaptoethanol 50 מיקרומטר).

2. תאים בודד בע"מ מעכברים

  1. להקריב עכברים על ידי CO 2 מחנק ונקע בצוואר הרחם. מניחים את העכברים על מגש לנתיחה ולעקר עם 70% אתנול. עושה חתך באמצע הבטן-ולהסיר את העור מחלקו האחורי של העכבר כולל העור מכסה את הגפיים התחתונים.
  2. לנתח עכברים במכסת מנוע חצי סטרילי. כדי לשחרר את עצם הירך וtibiae, קליפ עצם הירך מעל ומתחת tibiae מפרק הברך. לנתק את השרירים מהעצמות באמצעות מספריים ולמקם את העצמות בצלחת פטרי 6 סנטימטר המכילה 5 מ"ל להשלים RPMI.
  3. לעבור למכסת מנוע תרבות סטרילית. ממלאי מזרק 3 מיליליטר מחובר למחט 27G עם RPMI השלם. חותך את שני הקצוות של העצמות באמצעות מספריים, ולהכניס את מחט 27G כדי לשטוף את מוח מהעצמות בעדינות על ידי הזרקת RPMI השלם פעם אחת מכל קצה.
  4. הכן השעיה תא בודדת על ידי pipetting העדין התאים למעלה ולמטה 3-5 פעמים בצלחת התרבות באמצעות המזרק ללא המחט.
  5. צנטריפוגה התאים 5 דקות בXG 500 ולמזוג supernatant.
  6. תאי דם אדום Lyse עם חיץ 1 מיליליטר ACK (150 מ"מ NH 4 Cl, 10 מ"מ KHCO 3, 0.1 מ"מ EDTA) דוגרים דקות 1 ולעצור את התגובה על ידי דילול עם 10 כרכים של RPMI השלם. לאפשר לתאים לעמוד במשך 5 דקות כדי גלולה למטה גושי תאים מתים ופסולת רקמות על ידי כוח הכבידה.
    הערה: אל תעמוד יותר מ 5 דק 'כמו זה יגרום באובדן תא עקב שיקוע של תאי קיימא.
  7. supernatant המכיל תא לאט למזוג לפסולת צינור עוזבת חדשהמאחורי בצינור המקורי.
  8. צנטריפוגות במשך 5 דקות ב XG 500 לגלולת התאים, ולאחר מכן להסיר ולבטל את supernatant.
  9. Resuspend כולל תאים בע"מ (בדרך כלל 4-6 x 10 7 BM תאים מתקבלים מעכבר אחד) ב -100 μl חיץ FACS (1x PBS + 2% + 1 המ"מ EDTA FBS).

3. FACS ניתוח ומיון של CLPs

  1. להוסיף אנטי-CD16 / 32 (2.4G2 שיבוט supernant hybridoma, 50 μl / תגובה או 1-2 מיקרוגרם / תגובה) לתאים במאגר FACS (שלב 2.9) במשך 1-2 דקות כדי לחסום קולטני Fc.
    הערה: אנטי-CD16 / 32 גם נקרא בלוק FC, אשר מתווסף למניעה מחייבת הלא ספציפית של נוגדנים לתאים לבטא קולטנים Fc כוללים גרנולוציטים, מונוציטים, ולימפוציטים מסוג B.
  2. במקביל להכתים תאים עם הנוגדנים הבאים ניאון שכותרתו צבע (ל4x10 7 תאים) במשך 15 דקות על קרח, הימנעות אור הסביבה. נוגדנים: סמני שושלת PE-מצומדת (0.2 מיקרוגרם לכל אחד) כולל אנטי-CD3 (17 א2), אנטי-CD8 (53-6.7), אנטי-B220 (RA3-6B2), אנטי-CD19 (eBio1D3), אנטי-CD11b (M1 / 70), אנטי-Gr-1 (RB6-8C5), אנטי Thy1.1 (HIS51), אנטי-NK1.1 (PK136), אנטי-TER119 (TER-119), ואנטי-MHC-II (נימר-4), 0.2 מיקרוגרם אנטי-ג-קיט-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 מיקרוגרם אנטי SCA-1-FITC (D7), 0.4 מיקרוגרם אנטי-M-CSFR-APC (AFS98), ושל 0.2 מיקרוגרם אנטי-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
  3. לשטוף את תאים עם FACS חיץ 3 מיליליטר, וצנטריפוגות במשך 5 דקות ב 500 x גרם.
  4. Resuspend תאי 300 FACS μl חיץ ותאי סינון דרך מסננת תא 40 מיקרומטר.
  5. שטוף את הצינור עם חיץ FACS 100 μl נוסף להתאושש כל תאים הנותרים ולסנן לFACS סטרילי מיון צינור תוך שימוש באותה מסננת תא.
  6. לבצע ניתוח התזרים cytometric מייד לאחר הצביעה באמצעות מסננים ומתחים מתאימים לגילוי אות. השתמש 488 ננומטר לייזר כדי לזהות את הנוגדנים שכותרת PerCP-Cy5.5 FITC-,, 561 ננומטר לייזר כדי לזהות פטרוביץ, ונוגדני PE-labelded-Cy7 ואס 633 ננומטראה לזהות את הנוגדן שכותרתו APC.
  7. מיין את CLPs פי הסמנים הבאים לין - SCA-1 int M-CSFR int c-kit - IL-7Rα + (כמוכתם בשלב 3.2) באמצעות סדרן תא. לאסוף תאים הממוינים בצינור 15 מיליליטר המכיל 8 מיליליטר של RPMI מלא ככרית.
  8. רשום את המספר המוחלט של תאים ממוינים, כפי שמוצג על ידי סדרן התא בסוף הריצה. בדרך כלל, ניתן להשיג 5x10 4 CLPs מBM של עכבר אחד.

4. CLPs וCoculture AC-6

  1. צנטריפוגה תאים הממוינים מצעד 3.7 במשך 10 דקות ב 500 XG, להסיר את supernatant וresuspend התא גלולה עם מספיק RPMI השלם כדי להשיג צפיפות תאים סביב 5x10 מיליליטר / 4 תאים. תאי זרע 500 / גם לתוך הצלחת 12-המכילה גם תאים מזינים מוכנים בשלב 1.4.
  2. הוספת 100 ng / ml FL 19 (הו-Flt3L איג שנוצר בבית באמצעות מערכת ביטוי הניתנת על ידי מ 'מנז, Universiטאי החולים ציריך, שווייץ) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עם ניטור חזותי תקופתי של פיתוח DC תחת מיקרוסקופ.
    הערה: FL האנושי רקומביננטי ניתן להשיג בחנויות או עכבר פלורידה יכולה לשמש כתחליף לhu-Flt3L איג לתמוך בפיתוח DC.
  3. לאסוף את התאים בsupernatant ביום 12 ולשטוף את הבארות פעם אחת עם 0.5 מ"ל להשלים בינוני RPMI שילוב supernatants וכתוצאה מכך. הוסף 0.5 מיליליטר בינוני טרי וגרוטאות התאים חסיד עם מגרד תא.
  4. מערבבים את המדיום המכיל תאים משני החלקים וצנטריפוגות במשך 5 דקות ב 500 x גרם.
  5. תאי supernatant ו resuspend למזוג במאגר FACS 50 μl. להוסיף אנטי-CD16 supernatant 50 μl / 32 hybridoma דגירה במשך 1-2 דקות כדי לחסום קולטני Fc.
  6. למנות ולהכתים את כל התאים עם הנוגדנים הבאים (0.05 מיקרוגרם לכל אחד) נגד CD11c-APC (N418), אנטי-CD11b-FITC, ואנטי-B220-PE.
  7. לשטוף ו צנטריפוגות התאים כמו לתארד בשלב 3.3.
  8. Resuspend תאי 100 μl FACS חיץ, שער ב+ CD11c ולנתח לcDCs (CD11c + CD11b + B220 -) וpDCs (CD11c + CD11b - + B220) 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כולל של 4-6x10 7 תאים BM מבודדים בדרך כלל מעצמות ירך וtibiae של C57BL / 6 עכבר אחד 6-8 WK-ישן, wild-type. כדי למיין את CLPs, הכולל תאי BM מגואלות נוגדני PE מצומדות נגד סמני שושלת (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, TER119, וMHC-II), אנטי -c-קיט-PerCP / Cy5.5, אנטי SCA-1-FITC, אנטי-M-CSFR-APC ואנטי-IL-7Rα-PE / Cy7, ניתחו ומסודרים עם סדרן תא. אסטרטגית המיון לCLP מוצגת באיור 1. בדרך כלל, 5x10 4 CLPs מתקבל מC57BL אחד / 6 עכבר. כדי להשיג יותר CLPs, תאי BM 3-4 עכברים עשויים להיות משולבים ופרוטוקול מותאם בהתאם לפני המיון.

בעקבות coculture של 500 CLPs עם 5.9x10 6 AC-6 תאים מזינים, תאים מרוצפים יוצרי אזור (CAFC) מתחילים להופיע ביום 3-4. ביום 8, pDCs עגול מופיע ולהשעות על גבי CAFC (איור 2 א). מספר pDCs פסגות סביב דאיי 12-14 שבי pDCs הנקודה להתחיל לעבור אפופטוזיס הבא הפיתוח המלא שלהם, והמספרים מתחילים להקטין בהדרגה. מושבות CDC מופיעות תאוחרנה ממושבות PDC, ביום 6-8, והמורפולוגיה של cDCs גדולה יותר, כמו-ציר, וחסיד (איור 2).

בדרך כלל, יכולים להיות שנוצרו בין 500 CLPs 5-6x10 4 תאים לאחר 2 שבועות של coculture. לאחר מכתים את התאים עם אנטי CD11c-APC, אנטי-CD11b-FITC ואנטי-B220-PE, ניתוח על ידי cytometry זרימה מראה כי אחוז pDCs (CD11c + CD11b - + B220) וcDCs (CD11c + CD11b + B220 - ) הוא 91% ו -6%, בהתאמה (איור 3). לכן, בשיטה זו ניתן להרחיב pDCs ככל פי 100.

איור 1
ISO איור 1. אסטרטגיות gating לCLPs. תאים בע"מlated מעכבר אחד הוכתמו נוגדני fluorescently שהכותרת ונותח לCLPs, שהוגדרו כלין - int c-kit SCA-1 int M-CSFR -. IL-7Rα + אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .

איור 2
איור 2. מורפולוגיה של מושבות CDC וPDC בCLP-AC-6 cocultures. 500 CLPs היה cocultured עם AC-6 תאים מזינים מוקרן γ בנוכחות 100 ng / ml פלורידה. () מושבות PDC ביום 8, 10 ו -12, ו- (ב) מושבות CDC ביום 8, 12, ו -16 צולמו במיקרוסקופ אור ב200 x (סרגל קנה מידה 50 מיקרומטר). אנא לחץ כאן לצפייה בlargגרסה אה של נתון זה.

איור 3
איור 3. ניתוח תזרים cytometric של pDCs נגזר CLP וcDCs. חמש מאה CLPs וAC-6 תאים מזינים מוקרן γ (5.9x10 4 / מיליליטר) היו cocultured במבחנה במשך 12 ימים בנוכחות פלורידה (100 ng / ml ). התאים היו מוכתמים אנטי-CD11c-APC, אנטי-CD11b-FITC, ואנטי-B220-PE ונותחו על ידי cytometry זרימה. תאים היו מגודר ראשון ב+ CD11c ולאחר מכן ניתחו עבור cDCs (CD11c + CD11b + B220 -) וpDCs (CD11c + CD11b - + B220). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כאן אנו מתארים מערכת במבחנה תרבות לדור החזקה של DCS, וpDCs בפרט, ממספר קטן של CLPs. ייחודה של מערכת זו התרבות הוא עקב השימוש של AC-6 תאים, שורת תאי סטרומה, כהאכלה. גישה זו הוכחה לספק לא רק ציטוקינים, כגון IL-7, SCF, M-CSF ופלורידה 20, אלא גם את קשר תאי תאים 21 הדרוש כדי לתמוך בפיתוח DC. AC-6 תאים כבר השתמש בעבר כדי להקל על הלימוד במבחנה פיתוח DC מכמה אבות 8,16,22. מצאנו שזה קריטי לזרע צפיפות אופטימלית של תאי AC-6 מזין לתמוך בידול יעיל של pDCs מCLPs. באופן ספציפי, זריעת 5.9x10 4 מוקרן γ AC-6 תאים בתוצאות 12 גם צלחות בconfluency למחרת, אשר מתאים לפיתוח PDC. צפיפות נמוכה AC-6 תאים (3.9x10 4 / גם בצלחת 12 גם) נוטה לתמוך developmen CDCלא 24. לכן, מומלץ לכמה ריכוזי זרע הראשונים של AC-6 תאים על מנת לייעל את התנאים כאשר דרוג את מערכת התרבות 23. יתר על כן, חשוב גם שAC-6 התאים יישמרו בקפדנות, כוללים תשומת לב קפדנית למספר מעבר, ולא אפשרו להגיע confluency. אם נותר צפוף או אם מספר מעברם גדול מ -20, תאים אלה נוטים לאבד את היכולת לתמוך hematopoiesis במבחנה. בנוסף, הריכוז של פלורידה משפיע גם על התפתחות DC. באופן ספציפי, במינונים נמוכים cDCs (25-50 ng / ml) הם מעדיפים שפותחו, ואילו במינונים גבוהים (100-200 ng / ml) pDCs הם בעיקר שנוצרו 24. בנוסף לAC-6 צפיפות תאים ומינון פלורידה, בחירה זהירה של קבוצה של FBS שיעילות תומכת בפיתוח DC במערכת זו התרבות היא מרכזית להצלחה של ההליך.

בעוד במבחנה cDCs וpDCs -derived יכולים להיות דיסtinguished על ידי סמני פני השטח שלהם, כלומר CD11c + CD11b + B220 - וCD11c + CD11b - B220 +, בהתאמה, המורפולוגיות ניכרו גם על ידי מיקרוסקופ. cDCs גדול יותר, ציר בצורת וחסיד, ואילו pDCs הם קטנים, עגולים בצורה ולגדול בהשעיה (איור 2). קינטיקה של בידול DC גם שונה, עם pDCs מופיע מוקדם יותר וcDCs מאוחר יותר. בנוסף, בתהליך של פיתוח PDC מושפע באופן משמעותי על ידי AC-6 צפיפות תאים עם AC-6 צפיפות גבוהה זרוז התהליך ההתפתחותי. יש לציין כי pDCs מתחיל למות הבא פיתוח מלא וכך, היחס של cDCs לעומת pDCs במערכת זו התרבות מגדיל בהדרגה בנקודות זמן מאוחר יותר. לכן, ניטור תקופתי של פיתוח DC על ידי מיקרוסקופ וcytometry זרימה מומלץ מאוד על מנת לקבוע מתי pDCs להתחיל לעבור אפופטוזיס.

ראוי לציין, describשיטת אד יכולה להיות מיושמת גם לאבות DC אחרים, כגון CDPs; עם זאת, אוכלוסיית DC העיקרית שנוצרה מהתאים אלה הן cDCs 17, אפילו בAC-6 צפיפות גבוהה או מינוני פלורידה. פוטנציאל PDC הנמוך של CDPs עולה בקנה אחד עם דיווחים מקבוצות שונות או באמצעות CDP-מזין 11 או-מזין חופשי 16 מערכות, שתי מערכות תרבות שונות במבחנה. תוצאות אלו מצביעות על כך שמערכת המזין AC-6 בנאמנות יכולה לשקף את פוטנציאל ההתמיינות של אבות שונים.

PDCs שנוצר ממערכת זו התרבות הוא CD11c + CD11b - + B220. יתר על כן, הם מבטאים רמות גבוהות יחסי של Tcf4 (מקודד E2-2) וRag1, גני שני PDC-ספציפיים, אך רמות נמוכות יותר של ID2, גן CDC-ספציפי, מאשר לעשות cDCs 17. למרות pDCs אלה חסרי Siglec-H וBST2, סמנים נחשבים אופייני pDCs עכברי, הם עדיין מסוגלים לייצר רמות גבוהות יותר של IFN-אני מאשרלעשות cDCs וupregulate CD86 כאשר נגוע בוירוס stomatitis שלפוחי (VSV) 24. הדבר מצביע על כך pDCs אלה, אם כי באופן חלקי הבדיל, עדיין תפקודי. יתר על כן, יש לנו כבר השתמש בהצלחה בשיטה זו כדי להתוות תפקיד סינרגיסטי של IFN-אני ופלורידה בפיתוח PDC מCLPs 17, המאשר כי טכניקה זו היא רבת ערך ללימוד פיתוח DC.

לסיכום, אנו מציגים כאן פשוט, אך יעילה, שיטה ליצירת pDCs ממספר קטן של CLPs באמצעות מערכת AC-6 מזין coculture, אשר יכול להקל על מחקרים התפתחותיים או פונקציונליים של pDCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

אנו מודים לבני זוג. מרקוס מנז ואירווינג וייסמן למתן חומרים כימיים. אנחנו גם מכירים את השירות הניתן על ידי Cytometric ניתוח הזרימה ותא מתקן המיון Core הראשון והמעבדה הליבה השנייה בלאומית טייוואן אוניברסיטת קולג 'של בית חולים לרפואה וNTU, בהתאמה. עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע והטכנולוגיה, טייוואן (רוב 102-2,320-B-002-030-MY3) ומכוני מחקר הבריאות הלאומי, טייוואן (NHRI-EX102-10256SI וNHRI-EX103-10256SI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 Biolegend 108408 linage marker
Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 Biolegend 108708 linage marker
Anti-mouse  CD11b (PE), cloneM1/70 Biolegend 101208 linage marker
Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 Biolegend 115508 linage marker
Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 Biolegend 103208 linage marker/FACS
Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 Biolegend 100308 linage marker
Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 Biolegend 100707 linage marker
Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 Biolegend 107608 linage marker
Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 Biolegend 116208 linage marker
Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 eBioscience 12-0900-83 linage marker
Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 Biolegend 135510 FACS
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 Biolegend 105824 FACS
Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 Biolegend 108106 FACS
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 Biolegend 135014 FACS
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 Biolegend 117328 FACS
Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 Biolegend 101206 FACS
FACSAria III BD Biosciences Cell sorter
FACS sorting tube  BD Biosciences 352054
FlowJo FlowJo LLC Flow analysis sofrware

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
  2. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S. Development and Function of Dendritic Cell Subsets. Immunity. 40, 642-656 (2014).
  4. Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).
  5. Liu, Y. J. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).
  6. Merad, M., Manz, M. G. Dendritic cell homeostasis. Blood. 113, 3418-3427 (2009).
  7. Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells. Immunity. 33, 905-916 (2010).
  8. Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).
  9. Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 97, 3333-3341 (2001).
  10. D'Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).
  11. Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121, 11-19 (2013).
  12. Shigematsu, H., et al. Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin. Immunity. 21, 43-53 (2004).
  13. Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions. Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).
  14. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).
  15. Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).
  16. Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).
  17. Chen, Y. L., et al. A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors. J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).
  18. Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule. Cell. 48, 1009-1021 (1987).
  19. Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development. J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).
  20. Szilvassy, S. J., et al. Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells. Blood. 87, 4618-4628 (1996).
  21. Arcanjo, K., et al. Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024. J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).
  22. Onai, N., et al. A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential. Immunity. 38, 943-957 (2013).
  23. Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21. Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).
  24. Chen, Y. -L., Chang, S., Chen, T. -T., Lee, C. -K. Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand. PLoS ONE. 10, (8), e0135217 (2015).
<em>במבחנה</em> הדור של תאי דנדריטים Murine Plasmacytoid מנפוצים הלימפה אבות באמצעות מערכת מזין AC-6
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, S., Pai, L. M., Lee, C. K. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. Vis. Exp. (105), e53211, doi:10.3791/53211 (2015).More

Chang, S., Pai, L. M., Lee, C. K. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. Vis. Exp. (105), e53211, doi:10.3791/53211 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter