Summary

In Vitro geração de células dendríticas plasmocitóides Murino de comum Linfóide Progenitores usando o sistema de alimentação AC-6

Published: November 23, 2015
doi:

Summary

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

Abstract

Células dendríticas plasmocit�des (PDCs) são poderoso tipo I interferon (IFN-a) que produzem células que são activados em resposta a infecção ou durante as respostas inflamatórias. Infelizmente, estudo da função PDC é prejudicada pela sua baixa freqüência em órgãos linfóides, e os métodos existentes para a geração in vitro DC predominantemente favorecer a produção de CDCs sobre pDCs. Aqui nós apresentamos uma abordagem única para gerar de forma eficiente pDCs de progenitores linfóides comuns (CLPs) in vitro. Especificamente, o protocolo descrito detalhes como purificar os CLPs de medula óssea e geram pDCs por coculturing com AC-6 células alimentadoras irradiadas com y na presença de ligando Flt3. Uma característica única do presente sistema de cultura é que as CLPs migrar sob o AC-6 e as células tornam-se as células formadoras de área de paralelepípedo, um passo crítico para a expansão pDCs. DCs morfologicamente distintas, a saber pDCs e CDCs, foram gerados após cerca de 2 semanas com uma composição de 70-90% pDCs em condições óptimas. Tipicamente, o número de pDCs geradas por este método é cerca de 100 vezes do número de CLPs semeadas. Portanto, este é um novo sistema com o qual gerar robustamente o grande número de pDCs necessárias para facilitar estudos adicionais sobre o desenvolvimento e a função destas células.

Introduction

As células dendríticas (CDs) são células apresentadoras de antigénios profissionais, que desempenham um papel importante no controlo da resposta imunitária 1. Enquanto as DCs são heterogéneos, eles podem ser classificados em duas populações, as DCs convencional (CDCs) e DCS plasmocitoides (PDCs) 2,3. Além de órgãos linfóides, CDCs pDCs e também são encontradas em tecidos incluindo o pulmão, intestino, pele e 2. A morfologia dos CDCs e pDCs difere, com CDCs expositoras projeções dendríticos-like e forma de pDCs ser como célula-mais de plasma. Além disso, o DC marcador rato comum, CD11c, é mais altamente expresso em CDCs que em pDCs. Além disso, os CDCs pode ainda ser dividido em CD11b + CD24 CDCs e CD11b CD24 + CDCs, sendo que ambos expressam níveis mais elevados de MHC classe II e de moléculas co-estimuladoras do que fazer pDCs 2. PDCs maduros, por outro lado, têm sido mostrados para expressar selectivamente Siglec-H e BST2 4. Functionally, CDCs são melhores células apresentadoras de antígeno que são pDCs; No entanto, pDCs pode produzir uma grande quantidade de interferão de tipo I sobre a infecção do vírus ou estimulação inflamatória 5.

Ambos os CDCs e pDCs são de curta duração e, portanto, deve ser constantemente reabastecidos de progenitores dentro da medula óssea (BM) 6,7. A transferência adoptiva de células progenitoras comuns mielóides (PGZC) e progenitores linfóides comuns (CLPs) em ratinhos letalmente irradiados demonstra que CDCs e pDCs pode ser gerada a partir de ambas as linhagens 8-10. No entanto, há um subconjunto de pDCs que expressam RAG1 / 2 e possuem segmentos rearranjados DJ no locus de IgH 11,12. Estas células também partilhar semelhanças moleculares com linfócitos B, incluindo a expressão do marcador B220, receptores de detecção de ácidos nucleicos (TLR7 / TLR9), e factores de transcrição (e SPIB BCL11A) 13, dispõe de todos Acredita-se que as assinaturas de linhagem linfóide. Portanto, CLPs podem ser boas escolhas para in vitro geração de pDCs por causa da semelhança linhagem.

Enquanto a frequência dos dois CDCs pDCs e em humanos e em ratos é muito baixo 6, DCs, particularmente CDC, podem ser geradas in vitro a partir de progenitores BM ou na presença de citocinas, tais como GM-CSF 11,14 ou ligando Flt3 (FL ) usando sistemas de livre-feeder 11,15,16. Infelizmente, no entanto, não é possível produzir um grande número de pDCs in vitro utilizando FL 11,15,16. Anteriormente tínhamos demonstrado que pDCs pode ser gerada de forma eficiente in vitro a partir CLPs que utilizam o sistema de alimentação de CA 6-17. A vantagem de utilizar a linha de células do estroma AC-6 no sistema de cultura é que ela proporciona um contacto célula-célula e a secreção de citoquinas que suportam a geração de grandes números de pDCs de CLPs. Embora a produção com este sistema é muito robusto, replicação cuidadosa dos procedimentos descritos a seguir é necessário iara garantir a geração eficiente de pDCs.

Protocol

Murganhos C57BL / 6 de tipo selvagem foram adquiridos a partir do Centro Nacional de Animais de Laboratório (NLAC), Taiwan. Todos os ratinhos foram criados e mantidos sob condições isentas de agentes patogénicos específicos. Protocolos e procedimentos de uso dos animais foram revisadas e aprovadas pelo cuidado e uso de animais Comitê Institucional da National Taiwan University College of Medicine (Permit Number: 20120075). Além disso, os pesquisadores fizeram todos os esforços para reduzir o potencial de dor, sofrimento, angústia o…

Representative Results

Um total de 7 4-6×10 células de MO são tipicamente isoladas a partir de fémures e tíbias de um 6-8 semanas de idade, de tipo selvagem C57BL / 6 mouse. Para resolver CLPs, células totais BM estão manchadas com anticorpos PE-conjugada contra marcadores de linhagem (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, GR-1, Thy1.1, NK1.1, Ter119, e MHC-II), anti -C-PerCP-Kit / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-CSFR-APC e anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analisadas e classificadas com um classificador de células. A estratégia de triagem para…

Discussion

Aqui, descrevemos um sistema de cultura in vitro para a geração robusta de DCs, e pDCs em particular, a partir de um pequeno número de CLPs. A singularidade deste sistema de cultura é devido ao uso de AC-6, células de uma linha celular de estroma, como alimentadores. Esta abordagem tem sido mostrado para fornecer não só as citocinas, tais como IL-7, SCF, M-CSF e FL 20, mas também o contacto célula-célula 21, necessário para suportar o desenvolvimento DC. AC-6 células têm sido …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Somos gratos a Drs. Markus Manz e Irving Weissman para a prestação de reagentes. Reconhecemos também o serviço prestado pela Citometria de Fluxo de Análise e Seleção celular Núcleo Facilidade da Primeira e Segunda laboratório central no National Taiwan University College of Medicine e NTU hospital, respectivamente. Este trabalho foi financiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan (MOST 102-2320-B-002-030-MY3) e os Institutos Nacionais de Investigação de Saúde, Taiwan (INDH-EX102-10256SI e INDH-EX103-10256SI).

Materials

Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 Biolegend 108408 linage marker
Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 Biolegend 108708 linage marker
Anti-mouse  CD11b (PE), cloneM1/70 Biolegend 101208 linage marker
Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 Biolegend 115508 linage marker
Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 Biolegend 103208 linage marker/FACS
Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 Biolegend 100308 linage marker
Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 Biolegend 100707 linage marker
Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 Biolegend 107608 linage marker
Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 Biolegend 116208 linage marker
Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 eBioscience 12-0900-83 linage marker
Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 Biolegend 135510 FACS
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 Biolegend 105824 FACS
Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 Biolegend 108106 FACS
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 Biolegend 135014 FACS
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 Biolegend 117328 FACS
Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 Biolegend 101206 FACS
FACSAria III BD Biosciences Cell sorter
FACS sorting tube  BD Biosciences 352054
FlowJo FlowJo LLC Flow analysis sofrware

References

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Chang, S., Pai, L., Lee, C. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. Vis. Exp. (105), e53211, doi:10.3791/53211 (2015).

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