Introduction
Den vigtigste fysiologiske rolle af skeletmuskulaturen mitokondrier er at producere ATP mod oxidativ phosphorylering 1. Vigtigere, spiller skeletmuskulatur mitokondrier en særlig rolle i arbejdskapacitet 2, aldring 3, degenerative sygdomme 4 og type II diabetes 5. Som et aldrende samfund, og type II diabetes er den 7. hyppigste dødsårsag i USA 6, er behovet for metoder, der vurderer mitokondriefunktion blevet stadig mere udbredt i biomedicinsk forskning 7,8. Konkret måling af ilt forbrug har særlig stor nytteværdi i vurderingen af mitokondrie funktion, da det repræsenterer en koordineret funktion mellem mitochondriale og nukleare genomer til at udtrykke funktionelle komponenter af oxidativ fosforylering 9.
Flere teknologier findes der muliggøre måling af iltforbruget i intakte celler og isolered mitokondrier 7-10. Desuden er der blevet udviklet assays for flere celletyper og væv, og i en række arter, der giver mulighed for måling af mitokondrielle veje og respiratorisk kontrol 9,11,12. Men der er i øjeblikket et tomrum i litteraturen i forhold til udarbejdelsen af alle disse analyser ved hjælp af isolerede mitokondrier fra mus skeletmuskulatur til brug i mikroplade baseret forbrug ilt teknologier. Vigtigere, er brug af mikrotiterplade-baseret respirometriske analyser voksende blandt mitokondrielle biologer og giver mulighed for høj kapacitet målinger ved hjælp minimale mængder af isolerede mitokondrier 9. Derfor blev en samling af mikrotiterplade-baseret respirometriske assays udvikles, der gør det muligt at indkredse hvor abnormiteter og / eller tilpasninger kan forekommer i elektrontransportkæden (ETC). Desuden blev to yderligere mikroplade baserede respirometriske analyser udviklet, der gør det muligt at vurdere koordineringen between tricarboxylsyre (TCA) cyklus og ETC og mellem ß-oxidation og ETC. Vigtigt er det, de præsenterede metoder giver en klar og koncis måde at måle mekanistiske ændringer i mitokondriefunktion i et almindeligt anvendt dyremodel.
Protocol
BEMÆRK: Denne protokol begynder efter man har isoleret mitokondrier fra rød skeletmuskulatur. Mitokondrier blev isoleret som tidligere beskrevet fra ~ 75 - 100 mg af rød skeletmuskulatur 13. Mellem 5 - 10 pg / pl af mitokondrie protein vil blive nået fra denne mængde væv ved at resuspendere den endelige mitokondrie pellet i ≤ 50 ul isolation buffer for mitokondrier (IBM) 2 (Se Frisard et al 13).
1. Opsætning
- Forbered arbejder stamopløsninger (tabel 1) og mitokondrie assay-opløsning (MAS) blandinger (tabel 2) for efterfølgende analyser.
Bemærk: De fleste af forberedelsen af analyserne kan gøres på forhånd, da de fleste bestande løsninger og MAS kan gemmes. - Hydrere en respirometrisk Assaykassette i 1 ml kalibreringsopløsning natten før forsøget i en ikke-CO2-inkubator ved 37 ° C.
- Dagen for eksperimentet take ud frosne bestande (substrater og mitochondriske modulatorer, MAS mix, MAS w / o BSA, tabel 1) og optøning i 37 ° C bad eller inkubator.
- Forbered alle substratopløsninger (tabel 3) og injektioner (tabel 4-5) og juster pH som ønsket (pH 7,4). Efter at pH er justeret, opbevares på is.
- Program multi-brønd iltforbrug måling maskine til ordentlig mix, vent, og måle parametre (se tabel 6) og label baggrund og gruppe / tilstand brønde ved først at indtaste analyse software, efterfulgt af "Standard" tilstand.
- Træde ind i "Gæst" forum og klik på "Assay Wizard". Når i "Assay Wizard", klik på "protokol" for at ændre mix, vent, og måle parametre. Mærk baggrunden brønde under "Back. Korrektion "fanen og sørg for at markere" Gør korrektion baggrund ".
- Label condlinger ved først at klikke på "Grupper og Labels" fanen, efterfulgt af "Group Info" fanebladet. Efter disse parametre er indtastet, skal du klikke på "Afslut", efterfulgt af "Gem skabelon".
2. assaykørsel
- Indlæse injektionsopløsninger i et assay run patron og starte kalibreringen ved først at indtaste analyse software, efterfulgt ved at indtaste "Standard" mode. Træde ind i "Gæst" forum. Åbn skabelonen er gemt i trin 1.5 under "XF" drev, under fanebladet "Skabeloner". Når åben, skal du klikke på "Start" for at starte kalibreringen.
Bemærk: analysekørsel patron skal indtastes i maskinen med det takkede hjørne til nederste venstre. Det tager ca. 30 min. Pas på at injicere løsninger ind i de rigtige porte. Injektioner i tabel 4-5 er opført i rækkefølge efter læsning. - Forsigtigt, men blandes grundigt mitochondria lager ved at omrøre opløsningen med en 200 pi pipette tip, efterfulgt af triturering forsigtigt bestanden med en 200 pi pipettespids, der har haft sin åbning udvidet ved at skære ~ 3 mm ud over enden af spidsen med en saks.
- Udfør en bicinchoninsyre (BCA) assay for at bestemme proteinkoncentrationen af mitokondrie lager.
- Brug af stamkoncentration erhvervet fra trin 2.3, resuspender 10 ug mitokondrieprotein / 200 pi af succinat / rotenon substrat mix (tabel 3). Resuspender 14 ug mitokondrieprotein / 200 pi af de resterende substrat blandinger (Dette skal gøres for hvert substrat mix) (tabel 3). Placer alle mitokondrielle protein / substrat blander på is.
Bemærk: Den optimale mængde mitokondrie-protein per brønd for hvert assay blev bestemt som tidligere beskrevet 9. Det blev bestemt, at pyruvat / malat, palmitoyl carnitin / malat, glutamat / malat end elektron flow assays udnytter 3.5 ug mitokondrieprotein, mens succinat / rotenon analysen anvender 2,5 ug mitokondrieprotein per brønd. Derfor forskeren skal resuspendere nok mitokondrieprotein til 4 replikater i dette trin, da begge 2,5 ug eller 3,5 ug pr 50 pi indlæses per brønd (Se trin 2.6). - Bland mitokondrier / substratopløsninger forsigtigt, men grundigt ved at omrøre opløsningen med en 200 pi pipette tip, efterfulgt af triturering forsigtigt bestanden med en 200 pi pipettespids, der har haft ~ 3 mm fra enden afskåret.
- Placer en cellekultur plade på is og i tre eksemplarer, belastning 50 pl / brønd af hver af mitokondrier / substrat blandinger. Udviklerne af mikrotiterplade-baseret respirometrisk assay anbefaler efterlader mindst to tomme (ingen mitokondrier) brønde, helst på hver side på celledyrkningspladen.
- Spin celledyrkningspladen ved 2.000 g i 20 minutter ved 4 ° C. Mens pladen er spinning, varme op substratopløsninger i et 37 ° C vandbad.
- Efter spin er færdig, omhyggeligt indlæse 450 pi af hver substratopløsning oven på deres respektive brønde (dvs. indlæse pyruvat / malat substrat til brøndene, der har mitokondrier oprindeligt resuspenderet i denne substratopløsning). Vær sikker på at indlæse pladen ved RT. Bemærk: Tomme brønde skal belastes med 500 pi substrat. Blanke brønde udpeget til flow elektron-analysen skal ilægges med elektron flow substrat (Pyruvat / Malate + FCCP), mens de koblede assay tomme brønde kan indlæses med enhver kobling assay substrat.
Bemærk: Hvis du udfører de koblede og elektron flow-analyser på den samme plade, må forskeren overflytte baggrunden brønde til de respektive analyser efter analysekørsel er komplet ved hjælp af platformen "XF Reader" via "Instrument" fanen. Én gang inden indstillingen "instrument", klik på "Administration"fanen, efterfulgt af "Background Correction". Hit "End Instrument Setup Mode" når du er færdig. Dette skyldes kombinationen af ascorbat / TMPD kan forbruge O 2, således et separat baggrund korrektion er nødvendig for hvert assay type. - Efter tilsætningen af 450 ul af substrat til hver brønd, se laget af mitokondrier i brønden for at sikre mitokondrier er dispergeret jævnt i en enkelt monolag (20X forstørrelse [Se Rogers 9, figur 4]). Brønde, der ikke synes at have en jævnt fordelt monolag kan fjernes post hoc.
- Efter kontrol for mitokondrie vedhæftning, indsætte mikropladen i respirometrisk assay instrument og starte analysen køres ved at klikke på "OK".
Bemærk: Kalibreringen fra trin 2.1 skal være komplet, før kørslen påbegyndes. Når forskeren klikker "OK", vil maskinen skubbe værktøjet plade, der blev anvendt til kalibrering.- <li> Fjern værktøjet pladen og placere celledyrkningspladen som indeholder mitokondrierne på bakken. Den blå hak på celledyrkningspladen skal placeres i nederste venstre hjørne af bakken. Klik på "Fortsæt" for at starte analysekørsel.
- Når pladen er skubbet ud, fjerne og celledyrkningspladen og patron kasseres, og klikke på "Fortsæt" på skærmen. Kørslen bliver automatisk gemt som en .xls fil i "Data" fil.
- Næste forandring "Middle Point" til "Point-to-Point Rates" under "hastighed Data vises som:" valgmulighed. Klik på "OK" for at anvende disse ændringer.
- Klik på "Nå Group Mode" fanen nederst til venstre på skærmen til at gruppere brønde af lignende betingelser sammen. Klik til sidst på "Sample Mean / Standard Error" fanen mod midten af skærmen, til venstre. Alternativt kan disse kommandoer sættes op før analysen begynder i indstillingen "Wizard Assay".
Bemærk: Hver af disse betingelser vil have en gennemsnitlig ± standardafvigelse vises for hver sats og hver tilstand. Der er sats målinger pr betingelse (stat 2 [Kobling] / State3u [Electron Flow] åndedræt efterfulgt af fire injektioner). Brug middelværdien af den stat 2 satsen for den anden måling, fastlægge stat 4o ved den mindste punkt efter oligomycin injektion, anvende den maksimale punkt for stat 3 og statens 3U efter ADP og FCCP injektion henholdsvis og bruge den mindste punkt for antimycin induceret respiration for koblingen Analyser. Brug det maksimale punkt for pyruvat / malat induceret stat 3u åndedræt, skal du bruge minimumpunkt for rotenon induceret respiration, anvende den maksimale punkt for succinat induceret stat 3U åndedræt, og brug den mindste punkt for antimycin induceret respiration for Electron Flow analysen. Alle forsøg blev udført 3 gange og de viste data er resultaterne af et repræsentativt sporing.
Representative Results
Figur 1 repræsenterer iltforbrug satser (OCR) til pyruvat / malat, succinat / rotenon, palmitoyl carnitin / malat, og glutamat / Malate analyser (Kobling Analyser). Disse assay tracings vises som Oxygen Forbrug Rate eller OCR, vs. tid, der er baggrund correceted, og vises som punkt-til-punkt-satser. Hvert panel repræsenterer iltforbrug i forskellige mitokondrie tilstande som beskrevet af Chance og Williams 14. Det første panel repræsenterer basal iltforbrug eller stat 2. Det andet panel, efter injektion af ADP, repræsenterer maksimal koblet respiration eller stat 3. Det tredje panel, efter injektion af oligomycin A (en hæmmer af Complex V), repræsenterer respiration på grund til proton lækage eller stat 4o. Den fjerde panel, efter injektion af FCCP repræsenterer maksimal afkoblet åndedræt eller stat 3U. Endelig femte panel, efter injektion af antimycin, betegner inhibering af oxidative respiration. Især all mitokondrie stater har minimal standardafvigelse. Dette skyldes grundig blanding af mitokondrie materiel og mitokondrier / substrat blandinger, og opnåelse af et enkelt monolag af mitokondrier efter tilslutning centrifugering (trin 2.6). På den anden side, lastning ulige mitokondrier i hver brønd og ikke skabelsen af et indre monolag af mitokondrier i brønd mikropladen fører til øget standardafvigelse i hvert tilstand som vist i figur 2.
De kurver i figur 1 display plateauer for hver mitokondrie stat og for hvert substrat. Plateauet nås efter to måleserier antyder god mitokondrie kvalitet, og at mitokondrierne forblive adhæreret til brønden gennem hele assayet. Desuden kan opnåelsen af plateau maksimale satser være mere ønskelig, da dette gør det muligt for forskeren at tage gennemsnittet OCR på disse mitochondriale stater og dermed reducere skævhed, der kan opståved vilkårligt at vælge et punkt.
Mængden af mitokondrier pr brønd blev bestemt ved optimering forsøg. Den optimale mængde af mitokondrier per brønd bør resultere i State 2 satserne mellem 100-200 pmol / min / brønd og statslige 3 satser <1.500 pmol / min / brønd, idet disse værdier er inden for det dynamiske oxygen tasteafstand af multi-brønds oxygen måling af forbrug maskine. Lastning for meget mitokondrieprotein per brønd kan resultere i OCRs uden dynamikområde instrumentet (figur 3A). Figur 3 viser loading 3,5 ug mitokondrieprotein per brønd (blå sporing) sammenlignet med lastning 2,5 ug mitokondrieprotein per brønd (rød sporing) til succinat / rotenon assay. Lastning for meget mitokondrieprotein per brønd kan også føre til konsumption af oxygen i mikrokammeret af brønden, hvilket forhindrer nøjagtig måling af OCR for hver successiv måling 9 (figur 3B </ strong>). Point-to-point OCR er den øjeblikkelige ændringshastighed af OCR. Hvis fladt, OCR er stabil / stabil, men hvis faldende, så der kan være en biologisk eller teknisk problem. Den stejle fald i OCR i staten 3 og stat 3U respiration (figur 3A) er forårsaget af mitokondrier udmattende ilttilførslen inden udgangen af målingen (figur 3B).
Figur 4 repræsenterer OCR vs. tid for strømmen af elektroner assay. Opsporing korrigeres og vises som beskrevet for figur 1. Det første panel i dette assay repræsenterer State 3u respiration på pyruvat / malat via Complex I. Det andet panel, efter injektion af rotenon, betegner inhibering af kompleks I medieret respiration. Det tredje panel, efter injektion af succinat, repræsenterer substrat stimuleret stat 3U med elektroner ind i ETC på Complex II (Complex II medieret respiration). Det fjerde panel, efter injektion af Antimycin A, betegner inhibering af Complex III og dermed samlede respiration. Endelig femte panel, efter injektion af ascorbat / TMPD, repræsenterer Kompleks IV medieret respiration. I lighed med de kurver i figur 1, alle mitochondriale stater har minimal standardafvigelse, og hver sats har eller næsten har nået et plateau.
Figur 1. Kobling Assays. (A) 10 mM pyruvat / 5 mM malat, (B) 10 mM succinat / 2 pM rotenon, (C) 40 uM palmitoyl carnitin / 1 mM malat, og (D) 10 mM glutamat / 10 mM malat koblet mitokondrielle respiration assay kurver som bestemt ved multi-brønds måling af oxygenforbrug. Værdier er udtrykt som middelværdi ± SD. Mitokondrieprotein indlæst per brønd var 3,5 ug for alle assays bortset succinat / rotenon, som udnytter 2,5 ug mitokondrieprotein per brønd. Data repræsenterer n = 3 parrede biologiske replikater. OCR = Oxygen Forbrug Pris; ADP = adenosindiphosphat; Oligo = oligomycin A; FCCP = carbonyl cyanide- 4 - (trifluormethoxy) phenylhydrazon; Anti-A = Antimycin A; PYR = Pyruvate; SUCC = Succinat; ROT = Rotenon; PAL-C = palmitoyl carnitin; GLUT = glutamat. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Meget variabel Pyruvat / Malate analysen. Meget variabel 10 mM pyruvat / 5 mM malat assay forårsaget af ufuldstændigt blande mitokondrier fra mitokondrie bestand i underlaget / MAS mix, hvilket fører til variabel mitokondrie proTEIN belastning i hver brønd. Mitokondrieprotein indlæst per brønd var 3,5 ug. Data repræsenterer n = 3 parrede biologiske replikater. OCR = Oxygen Forbrug Pris; ADP = adenosindiphosphat; Oligo = oligomycin A; FCCP = carbonyl cyanide- 4 - (trifluormethoxy) phenylhydrazon; Anti-A = Antimycin A; PYR = pyruvat. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Overbelastning mitokondrieprotein for succinat / Rotenon analysen. (A) oxygenforbrug satser uden dynamikområde af multi-brønds iltforbrug måling maskinen med lastning 3.5 ug mitokondrieprotein per brønd (blå sporing) sammenlignet med lastning 2,5 ug mitokondrieprotein per brønd (rød sporing). (B ) Oxygen spænding nærmer sig nul efter ADP og FCCP injektioner forårsaget ved at indlæse overdreven mitokondrie protein (3,5 ug) per brønd (blå sporing) sammenlignet med lastning en optimal mængde (2,5 mg) af mitokondrie protein per brønd (rød sporing). Data repræsenterer N = 3 parrede biologiske replikater pr mitokondrieprotein beløb. OCR = Oxygen Forbrug Pris; ADP = adenosindiphosphat; Oligo = oligomycin A; FCCP = carbonyl cyanide- 4 - (trifluormethoxy) phenylhydrazon; Anti-A = Antimycin A; SUCC = Succinat; ROT = Rotenon; O 2 = oxygen; mm Hg = millimeter kviksølv. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Electron Flow analysen. 5 mM pyruvat / 1 mM malat + 4 uM FCCP, elektron flav mitokondrielle respiration assay sporing som bestemt ved multi-brønds måling af oxygenforbrug. Værdier er udtrykt som middelværdi ± SD. Mitokondrieprotein indlæst per brønd var 3,5 ug. Data repræsenterer n = 3 parrede biologiske replikater. OCR = Oxygen Forbrug Pris; Anti-A = Antimycin A; ASC = Ascorbat; TMPD = N, N, N ', N' -tetramethyl- p-phenylendiamin. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagens | Stock Concentration | MW | Slutvolumen | Mass Tilføjet | Kommentarer / Beskrivelse | ||||||
| (M) | (g / mol) | (ml) | (g eller ml) | ||||||||
| EGTA, pH 7,2 | 0.1 | 380,35 | 100 ml 1M Tris Base | 3,801 g | Opbevares ved 4 ° C | ||||||
| HEPES | 1 | 238,3 | 250 ml DIH 2 O | 59. 57 g | Opbevares ved 4 ° C | ||||||
| MgCl2, hexahydrat | 1 | 203,31 | 250 ml DIH 2 O | 50.82 g | Opbevares ved 4 ° C | ||||||
| Pyruvat pH 7,4 | 0.1 | 88.06 (Leveres som 14,11 M opløsning) | 40 ml DIH 2 O | 0,283 ml pyrodruesyre | Lav 1 ml portioner og opbevares ved -20 ° C, gør frisk hver anden uge | ||||||
| Succinat pH 7,4 | 0,5 | 118,09 | 100 ml DIH 2 O | 9,4 g succinic syre | Lav 1 ml portioner og opbevares ved -20 ° C | ||||||
| Malate, pH 7,4 | 0,5 | 134,09 | 100 ml 95% ethanol | 6,7 g æblesyre | Lav 200 pi prøver og opbevares ved -20 ° C | ||||||
| TMPD | 0.01 | 164,25 | 10 ml | 0,0164 g | Lav 300 pi prøver og opbevares ved -20 ° C; Bland med en ækvimolær mængde af ascorbat til at holde TMPD reduceret | ||||||
| Palmitoyl-L-carnitin-chlorid | 0.01 | 436,07 | 1,14 ml 95% ethanol | 0,005 g | Gør 40 pi prøver og opbevares ved -20 ° C | ||||||
| Oligomycin A | 0,006 | 791,06 | 0,987 ml 95% ethanol | 0,005 g | Lav 20 portioner og opbevare gl ved -20 ° C | FCCP | 0.01 | 254,17 | 3,9 ml 95% ethanol | 0,01 g | Gør 40 pi prøver og opbevares ved -20 ° C |
| Rotenon | 0.001 | 394,4 | 10 ml 95% ethanol | 0,0039 g | Opbevares ved -20 ° C | ||||||
| Antimycin | 0,005 | 548,63 | 9.12 ml 95% ethanol | 0,025 g | Opbevares ved -20 ° C | ||||||
| K + ADP | 0,5 | 501,32 | 3,9 ml DIH 2 O | 1,0 g | Opbevares ved -20 ° C | ||||||
| Æblesyre, pH 7,4 | 0,5 | 134,09 | 40 ml | 2,68 g | Lav 200 pi prøver og opbevares ved -20 ° C |
| Reagens | Stock Concentration | Mass Tilføjet | Slutmolariteten / Procent |
| (M) | (g eller ml) | ||
| Saccharose | - | 11,98 g | 70 mM |
| Mannitol | - | 20.04 g | 220 mm |
| Monobasisk kaliumphosphat | - | 0,34 g | 5 mM |
| MgCl2, hexahydrat | 1 | 2,5 ml | 5 mM |
| HEPES | 1 | 1,0 ml | 2 mM |
| EGTA | 0.1 | 5,0 ml | 1 mM |
| Væsentlige Fatty Acid Free-BSA | - | 1,0 g | 0,20% |
. Tabel 2. MAS Mix pH 7,4, 500 ml: Alikvote 25 ml og opbevares ved -20 ºC * Bemærk: Udeluk BSA for MAS mix bruges til assay injektioner.
| Substrat Medium | Slutkoncentration | Mængde på lager (pl) | Mængde MAS * (ml) |
| Pyruvat / Malate | 10 mM / 5 mM | Pyruvat: 1.000 | 9 |
| Malate: 100 | |||
| Succicinate / Rotenon | 10 mM / 2 uM | Succinat: 200 | 10 |
| Rotenon 20 | |||
| * Pyruvat / Malate + FCCP | 5 mM / 1 mM / 4 uM | Pyruvat: 500 | 10 |
| FCCP: 4 | |||
| Malate: 20 | |||
| Palmitoyl L-carnitin / Malate | 40 pM / 1 mM | Palmitoylcarnitin: 40 Malate: 20 | 10 |
| Glutamat / Malate | 10 mM / 10 mM | Glutamat: 400 | 10 |
| Malate: 200 |
Tabel 3. Substratopløsninger pH 7,4: Gøre frisk dagen af forsøget. * Electron flow assay opløsning.
| Injektion Medium | Koncentration | Mængde på lager (pl) | <td> Mængde af MAS (ml)Mængde injiceret i Cartridge | Slutkoncentration | |
| (Efter injiceret i plade) | |||||
| ADP | 50 mM | 300 pi | 3 | 50 pi | 5,0 mM |
| Oligomycin A | 20 uM | 10 pi | 3 | 55 pi | 2,0 uM |
| FCCP | 40 uM | 12 pi | 3 | 60 pi | 4,0 uM |
| Antimycin | 40 uM | 24 pi | 3 | 65 pi | 4,0 uM |
Tstand 4. Injektioner til Koblede Analyser pH 7,4:. Gøre frisk dagen af forsøget. * Kobling assays indbefatter (men er ikke begrænset til) pyruvat / malat, succinat / rotenon, palmitoyl carnitin / malat, og glutamat / malat.
| Injektion Medium | Koncentration | Mængde på lager (g eller ul) | Mængde MAS (ml) | Mængde injiceret i Cartridge | Slutkoncentration (Efter injiceret i plade) |
| Rotenon | 20 uM | 60 pi | 3 | 50 pi | 2,0 uM |
| Succinat | 50 mM | 300 pi | 3 | 55 pi | 5,0 mM |
| Antimycin | 40 uM | 24 μ; l | 3 | 60 pi | 4,0 uM |
| TMPD / Ascorabte | 1 mM, 100 mM | TMPD: 300 pi | 3 | 65 pi | 100 uM, 10 mM |
| Ascorbat: 0,059 g |
Tabel 5. Injektioner for Electron Flow Assay pH 7,4:. Gøre frisk dagen af forsøget
| Kommando | Tid (min) | # Cyklusser |
| Kalibrere | ||
| Vent | 10 min (for at tillade pladen at varme fra adhærencetrin) | |
| Bland | 1 min | 2 |
| MigASURE | 2 min | |
| Indsprøjte en | ||
| Bland | 1 min | 2 |
| Mål | 2 min | |
| Injicere B | ||
| Bland | 1 min | 2 |
| Mål | 2 min | |
| Injicere C | ||
| Bland | 1 min | 2 |
| Mål | 2 min | |
| Injicere D | ||
| Bland | 1 min | 2 |
| Mål | 2 min |
Tabel 6. Instrument Run protokol.
Discussion
De metoder, der præsenteres i denne artikel giver trin-for-trin instruktioner til udførelse af en samling af mikrotiterplade-baseret respirometriske assays under anvendelse af mitokondrier isolerede 75-100 mg mus skeletmuskulatur. Disse assays kan udføres med stor præcision, hvilket fremgår af den stramme standardafvigelse mellem tredobbelte brønde. Vigtigere, tillader disse respirometriske analyser indkredsning af, hvor abnormiteter og / eller tilpasninger kan forekommer i ETC, TCA-cyklus, β-oxidation vej, substrat transportører mv i et almindeligt anvendt dyremodel.
Det er vigtigt at understrege rationalet for anvendelse af forskellige brændsler og inhibitorer, der anvendes i denne protokol. Pyruvat / malat og glutamat / malat respirometriske assays muliggøre vurdering af kompleks I medieret respiration, samt en vurdering af deres respektive transportører, og i tilfælde af glutamat, den deaminase 15. Alternativt kombinationen afsuccinat / rotenon det muligt at vurdere mitokondrie respiratoriske flux gennem Kompleks II i ETC siden rotenon hæmmer kompleks I og succinat giver elektroner til Kompleks II via reduktion af flavinadenindinukleotid (FADH 2) 15. Disse analyser giver substrat specifikke oplysninger om, kobling effektivitet og maksimal åndedræt. Strømmen af elektroner assayet er enestående ved, at kombinationen af substrater og inhibitorer giver mulighed for vurdering af flere komplekser i mitokondrie respiratoriske flux 9. Den oprindelige substrat blanding af pyruvat / malat + FCCP giver mulighed for evaluering af maksimal respiration drevet af kompleks I, mens injektion af rotenon efterfulgt af succinat muliggør vurderingen maksimal respiration drevet af Complex II. Injektionen af antimycin, en inhibitor af Complex III, efterfulgt af injektion af ascorbat / TMPD tillade for evalueringen af respiration drevet af Complex IV siden ascorbat / TMPD er enelektrondonor til cytochrom C / Complex IV. Mens ingen oplysninger om koblingseffektivitet opnås, metoden er ideel til meget små stikprøvestørrelser, som udelukker kører flere substrater selvstændigt. Endelig kan brugen af palmitoyl carnitin / malat muliggør vurderingen af koordinering mellem β-oxidation og ETC siden den reducerende ækvivalent fremstillet ved oxidering af palmitinsyre (β-oxidation) indgå i ETC gennem elektron overførsel flavoprotein 15. Det skal bemærkes, at koblingen og elektronflow assays også kan anvendes i tandem til at identificere ændringer i mitokondriefunktion grund af nogle intervention (lægemiddelbehandling genmanipulation).
Den høje præcision opnås for disse assays skyldes primært grundig blanding af mitokondrier, hvad enten det er før proteinbestemmelse eller med substratet løsninger. Langs disse linjer, er når mitokondrier resuspendend i underlaget opklaringns, er det afgørende at blande denne opløsning grundigt før lastning celledyrkningspladen som beskrevet i trin 2.2 med en udvidet åbning pipettespids. Manglende blandes grundigt mitokondrier vil føre til stor variation inden assayet. Desuden, ved hjælp af en smal åbning pipettespids vil skabe forskydningskræfter under blanding mitokondrier og øger muligheden for at beskadige mitochondriemembraner og frigivelse af cytochrom C. trin vedhæftning (2,7) er også et afgørende skridt i denne protokol. Manglende dreje loaded celledyrkningspladen længe / hurtigt nok vil resultere i ufuldstændig vedhæftning af mitokondrier til brønden, hvilket fører øget variabilitet mellem brønde og målinger.
Den beskrevne protokol er blevet optimeret til at omfatte: lastning en optimal mængde af mitokondrie protein per brønd, bruger de rigtige koncentrationer / tilberedningsmetoder at lave lager og substratopløsninger, ændre analysekørsel at sikre mitokondrie tilstand plateaus, og passende blanding af mitokondrie lager og mitokondrie / substrat blandinger. Forud for disse optimering indsats, forfatterne stødt faldgruber i analysen løb. Følgende diskuterer fejlfinding metoder / ændringer, der var nyttige i at optimere denne protokol. Med hensyn til en optimal belastning, vil lastning for lidt mitokondrier ikke fremkalde en solid respons, under indlæsning for meget mitokondrier vil udtømme ilten i mikrokammer og føre til unøjagtige målinger. Rogers et al 9 indeholder eksempler på bestemmelse af optimale lastning mængder af mitokondrier pr godt for mikrotiterplade-baseret respirometriske analyser. Oftere, er for meget mitokondrier indlæst per brønd som det fremgår af staten 2 satser løbet 100-200 pmol / min / brønd og stat 3 rater> 1500 pmol / min / brønd. Hvis over lastning sker, udføre et eksperiment med varierende koncentration af mitokondrie protein (f.eks mellem 1 -. 10 ug) for at fremkalde OCRs inden den dynamiske range af iltforbrug måling maskine. Forberedelse og bruge de rigtige koncentrationer af substrater og lagre er af allerstørste betydning. Brug altid den sure form af substrater / injektioner og justere pH med kaliumhydroxid eller HCI; natrium buffere / løsninger anbefales ikke. Desuden resuspenderes substrater / bestande i DMSO eller 100% ethanol vil medføre svigt eller fejl måling. Sørg for at bruge 95% ethanol, hvor noteret. Det er almindeligt for palmitoyl carnitin at udfælde af 95% ethanol efter optøning af frossen stamme, hvilket forårsager store forskelle. Sørg for at varme op palmitoyl carnitin materiel og vortex godt før brug. Desuden kan en meget variabel pyruvat / malat analyseresultat skyldes pyruvat stock væsen> 2 uger gammel. Vær sikker på at omskabe frosne portioner af pyruvat hver 2. uge. Den analysekørsel blev ændret til 2-min-målinger for at sikre mitokondrie statslige plateauer. Hvis der ønskes observation af konsumption af ADP, forskeren kanforlænge måling tid under fanen "protokollen" under "Wizard Assay" forum. Endelig opstår stor variation, når mitokondrie lager og mitokondrier plus substratopløsninger ikke homogeniseres fuldt før pålæsning. Hvis variabilitet mellem brøndene er høj efter analysekørsel, skal du sørge for fuldt ud at blande substratopløsningen før næste eksperiment. Vortexes aldrig mitokondrier / substratopløsninger snarere omrøres, mask og forsigtigt tritureres med en udvidet åbning pipettespids.
Der er nogle begrænsninger ved denne teknik, som er værd at bemærke. For det første er antallet af brønde på celledyrkningspladen anvendt til disse assays er relativt lav (dvs.., 24 brønde og mindst 2 udpeget til tomme brønde). Hvis det ønskes at udføre alle 5 af disse assays på én plade, forskeren er kun i stand til at undersøge svarene fra en mus ad gangen. Imidlertid bør det bemærkes, at 96-brønds instrumenter til rådighed til higheR gennemløb. Det andet er der iboende styrker og svagheder i vurderingen af mitokondriel dysfunktion i isolerede mitokondrier i forhold til i intakte celler 1. Nogle svagheder omfatter have mindre fysiologisk relevans i forhold til intakte celler og inducerende artefakter fra isolation processen. Endelig succesen af denne metode er betinget af kvaliteten af det mitokondrielle isolation processen.
Selv om nogle af disse assays er blevet enten udviklet i forskellige systemer eller er blevet valideret i andre dyremodeller, de metoder, der præsenteres heri, er den første til at syntetisere alle de ovennævnte assays til optimal anvendelse i en multi-brønds iltforbrug måling maskine ved hjælp af musen skeletmuskel. Det er vigtigt, kan alle 5 af disse assays udføres med mængden af mitokondrier isoleret fra ~ 75 - 100 mg af muse skeletmuskulatur, hvilket giver høj kapacitet med minimal materiale. Af stor betydning, evne multi-brøndsforbrugsteknologier oxygen til at udføre assays med minimale mængder mitokondrier, kombineret med en optimeret isoleringsmetode, tillader forskeren at udføre en lang række andre forsøg med den resterende del af skeletmuskelvæv (f.eks., western blots, RT-PCR, enzymatiske assays, etc.), som ofte er en kamp med denne dyremodel.
Afslutningsvis metoder præsenteret heri giver trin-for-trin instruktioner til udførelse af en samling af mikrotiterplade-baseret respirometriske assays under anvendelse minimale mængder af mus skeletmuskulatur. Vigtigt er det, de præsenterede metoder kræver minimal mængder væv og mitokondrier. Når styr, vil de heri beskrevne teknikker tillader forskerne at bestemme en potentiel mekanisme af en forbindelse eller genprodukt på mitokondrie iltforbrug i et almindeligt anvendt dyremodel.
Disclosures
George W. Rogers er ansat i Seahorse Bioscience, der fremstiller det instrument, som disse analyser blev udviklet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | Store at RT |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | Store at RT |
| Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0% | Sigma Aldrich | P5379 | Store at RT |
| Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0% | Sigma Aldrich | M9272 | Store at RT |
| HEPES minimum 99.5% titration | Sigma Aldrich | H3375 | Store at RT |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | Store at RT |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | Store at 4 °C |
| Acid Free- BSA | |||
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4 °C |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at RT |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at RT |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at RT |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | Store at RT |
| 99%, powder [TMPD] | |||
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20 °C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2 - 8 °C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20 °C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20 °C |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at RT |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
References
- Brand, M., Nicholls, D.
- Wang, H., Hiatt, W. R., Barstow, T. J., Brass, E. P. Relationships between muscle mitochondrial DNA content, mitochondrial enzyme activity and oxidative capacity in man: alterations with disease. European Journal of Applied Physiology and Occupational Physiology. 80, 22-27 (1999).
- Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. The mitochondrial genome in aging and senescence. Ageing Research Reviews. 18C, 1-15 (2014).
- Nunnari, J., Suomalainen, A.
- Dube, J. J., et al. Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance. Endocrinology and Metabolism. 307, E1117-E1124 (2014).
- Disease Control and Prevention Services. National diabetes statistics report: estimates of diabetes and its burden in the United States. , US Department of Health and Human Services. Atlanta, GA. (2014).
- Guarino, R. D., et al. Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration. Biotechnology and Bioengineering. 86, 775-787 (2004).
- Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nature Protocols. 1, 2563-2572 (2007).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6, e21746 (2011).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, C125-C136 (2007).
- Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods (San Diego, Calif.). 26, 292-297 (2002).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Frisard, M. I., et al. Low levels of lipopolysaccharide modulate mitochondrial oxygen consumption in skeletal muscle. Metabolism. 64, 416-427 (2015).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Advances in Enzymology and Related Subjects of Biochemistry. 17, 65-134 (1956).
- Mitochondrial pathways and respiratory control. Gnaiger, E. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck. (2007).
