Introduction
Den huvudsakliga fysiologiska rollen av skelettmuskel mitokondrier är att producera ATP från oxidativ fosforylering 1. Viktigt, skelettmuskel mitokondrier spelar en särskild roll i fysisk kapacitet 2, åldrande 3, degenerativa sjukdomar 4 och typ II diabetes 5. Som ett åldrande samhälle, och typ II diabetes är den 7: e vanligaste dödsorsaken i USA 6, har behov av metoder som utvärderar mitokondriefunktionen blivit allt vanligare i biomedicinsk forskning 7,8. Specifikt mätning av syreförbrukning har exceptionellt stort nyttovärde i bedömningen av mitokondriell funktion eftersom den representerar en samordnad funktion mellan mitokondriella och nukleära genomen att uttrycka funktionella komponenter av oxidativ fosforylering 9.
Flera tekniker finns som möjliggör mätning av syreförbrukningen i intakta celler och isolerad mitokondrier 7-10. Dessutom har analyser utvecklats för flera celltyper och vävnader, och i en mängd olika arter som gör det möjligt att mäta mitokondriella vägar och andningskontroll 9,11,12. Det finns dock för närvarande ett tomrum i litteraturen när det gäller sammanställningen av alla dessa analyser med hjälp av isolerade mitokondrier från mus skelettmuskulatur för användning i mikro baserad teknik syreförbrukning. Viktigt är användningen av mikrobaserad respirometric analyser ökar bland mitokondriella biologer och möjliggör hög genomströmning mätningar med minimala mängder av isolerade mitokondrier 9. Därför var en samling av mikrobaserad respirometric analyser utvecklats som tillåter precisera var avvikelser och / eller anpassningar kan förekomma i elektrontransportkedjan (ETC). Dessutom har ytterligare två mikrobaserade respirometric analyser utvecklats som gör det möjligt att bedöma samordningen between trikarboxylsyra (TCA) cykel och ETC och mellan ß-oxidation och ETC. Det är viktigt att de presenterade metoderna ger ett klart och koncist sätt att mäta mekaniska förändringar i mitokondriefunktion i en vanligt förekommande djurmodell.
Protocol
OBS: Detta protokoll börjar efter en har isolerat mitokondrier från röd skelettmuskel. Mitokondrier isolerades som tidigare beskrivits från ~ 75 - 100 mg av rött skelettmuskel 13. Mellan 5-10 mikrogram / l av mitokondrie protein kommer att uppnås från detta belopp av vävnad genom att återsuspendera sista mitokondriella pelleten i ≤50 il isoleringsbuffert för mitokondrier (IBM) 2 (se Frisard et al 13).
1. Inställning
- Bered arbetsstamlösningar (tabell 1) och mitokondriella analyslösningen (MAS) blandningar (tabell 2) för efterföljande analyser.
Notera: De flesta av förberedelserna för analyserna kan göras i förväg som de flesta lager lösningar och MAS kan lagras. - Fukta en respirometric analyspatron i 1 ml kalibreringslösning natten innan experimentet i en icke-CO 2 inkubator vid 37 ° C.
- Dagen för experimentet, tAKE ut frysta lager (substrat och mitokondriella modulatorer, MAS mix, MAS w / o BSA, Tabell 1) och islossning i 37 ° C bad eller inkubator.
- Förbered alla substratlösningar (Tabell 3) och injektioner (tabell 4-5) och justera pH-värdet enligt önskemål (pH 7,4). Efter det att pH justeras, lagra på is.
- Programmera flera brunnar syreförbrukning mätning maskinen till rätt mix, vänta, och mäta parametrar (se tabell 6) och etikett bakgrund och grupp / skick brunnar genom att först ange analysprogram, följt av "Standard" läge.
- Gå in i "Gäst" forum och klicka på "Assay Wizard". Väl inne i "Assay Wizard", klicka på "protokoll" för att ändra mixen, vänta, och mäta parametrar. Märk bakgrundsbrunnar under "Back. Correction "fliken och se till att markera" Gör bakgrundskorrigering ".
- Etikett diritions genom att först klicka på "Grupper & Labels" -fliken, följt av "Group Info" fliken. Efter dessa parametrar matas in, klicka på "End", följt av "Spara mall".
2. analyskörning
- Ladda injektionslösningar i en analysomgång patron och starta kalibreringen genom att först ange analysprogram, följt genom att ange "Standard" läge. Gå in i "Gäst" forum. Öppna mall sparas i steg 1.5 under "XF" enhet, under fliken "mall". När öppna, klicka på "Start" för att börja kalibreringen.
Obs! Kör patronen analysen måste föras in i maskinen med det avskurna hörnet till det nedre vänstra. Detta tar ca 30 minuter. Var noga med att injicera lösningar i rätt portar. Injektioner i tabell 4-5 listas för lastningen. - Försiktigt, men grundligt blanda mitochondria lager genom omrörning av lösningen med en 200 mikroliter pipettspets, följt genom att försiktigt triturering av lager med en 200 mikroliter pipettspets, som har haft sin öppning vidgas genom skärning ~ 3 mm från änden på spetsen med en sax.
- Utför en bicinkoninsyra (BCA) analys för att bestämma proteinkoncentrationen av den mitokondriella lager.
- Använda stamkoncentration förvärvats från steg 2,3, resuspendera 10 ^ g av mitokondriell protein / 200 | il av succinat / rotenon substratblandning (tabell 3). Resuspendera 14 pg av mitokondrie protein / 200 pl av de kvarvarande substratblandningar (Detta måste göras för varje substratblandning) (tabell 3). Placera alla mitokondriella protein / substrat blandar på is.
Obs: Den optimala mängden av mitokondrie-protein per brunn för varje analys bestämdes såsom tidigare beskrivits 9. Det konstaterades att pyruvat / målat, palmitoyl karnitin / målat, glutamat / malat end elektronflöde analyser utnyttjar 3,5 mikrogram av mitokondrie protein, medan succinat / rotenon analys utnyttjar 2,5 pg av mitokondrie protein per brunn. Därför måste forskaren resuspendera tillräckligt mitokondrie protein för 4 replikerar i detta steg, eftersom antingen 2,5 mikrogram eller 3,5 mikrogram per 50 pl laddas per brunn (se steg 2.6). - Blanda mitokondrierna / substratlösningarna försiktigt, men noggrant genom omrörning av lösningen med en 200 mikroliter pipettspets, följt genom att försiktigt triturering av lager med en 200 mikroliter pipettspets som har haft ~ 3 mm från dess ände skärs av.
- Placera en cellodlingsplatta på is och i tre exemplar, belastning 50 | il / brunn av var och en av mitokondrierna / substratblandningar. Utvecklarna av mikrobaserade respirometric analys rekommenderar att du lämnar minst två tomma (inga mitokondrier) brunnar, företrädesvis på ömse sidor på cellodlingsplatta.
- Snurra cellodlingsplatta vid 2000 g under 20 min vid 4 ° C. Medan plattan är spinning, värma upp substratlösningarna i ett 37 ° C vattenbad.
- Efter spin är klar, noga läsa 450 fil av varje substratlösning ovanpå sina respektive brunnar (dvs. ladda pyruvat / målat substrat till brunnarna som har mitokondrier ursprungligen återsuspenderas i denna substratlösning). Var noga med att läsa in plattan vid RT. Obs: Blanka brunnar ska laddas med 500 il substrat. Blanka brunnar avsedda för analys elektronflöde ska laddas med elektronflöde substrat (Pyruvat / malat + FCCP), medan de kopplade analys tomma brunnar kan laddas med alla kopplingsanalyssubstrat.
Obs: Om du utför de kopplade och elektronflöde analyser på samma platta, måste forskaren omfördela bakgrundsbrunnar till respektive analyser efter analyskörning är klar med "XF Reader" plattform via "Instrument" -fliken. Väl inne i inställningen "Instrument", klicka på "Administration"fliken följt av "Bakgrund Correction". Hit "End Instrumentinställningar Mode" när du är klar. Detta beror på att kombinationen av askorbat / TMPD kan konsumera O 2, således behövs en separat bakgrundskorrigering för varje analys typ. - Efter 450 pl substrat tillsätts till varje brunn, visa skiktet av mitokondrier i brunnen för att säkerställa mitokondrierna dispergeras jämnt i ett enda monoskikt (20X förstoring [Se Rogers 9, figur 4]). Brunnar som inte verkar ha en jämnt fördelad monoskikt kan avlägsnas i efterhand.
- Efter kontroll för mitokondriell följsamhet, sätter mikro i respirometric analysinstrumentet och starta analysen drivs genom att klicka på "OK".
Obs: Kalibreringen från steg 2.1 måste vara klar innan körningen påbörjas. När forskaren klickar på "OK", kommer maskinen mata verktyget plattan som användes för kalibrering.- <li> Ta bort verktyget plattan och placera cellodlingsplatta som innehåller mitokondrier på brickan. Den blå skåran på cellodlingsplatta ska placeras i det nedre vänstra hörnet i magasinet. Klicka på "fortsätt" för att starta analyskörning.
- När plattan kastas ut, ta bort och kasta cellodlingsplatta och patron och klicka på "Fortsätt" på skärmen. Körningen sparas automatiskt som en xls-fil i "Data" fil.
- Nästa förändring "Middle Point" till "Point-to-Point priser" under "Rate Data Visas som:" alternativet. Klicka på "OK" för att tillämpa dessa förändringar.
- Klicka på fliken "Well Group Mode" på nedre vänstra hörnet av skärmen för att gruppera brunnar i liknande förhållanden tillsammans. Slutligen klickar du på "Sample Medelvärde / Standard Error" -fliken mot mitten av skärmen, till vänster. Alternativt kan dessa kommandon ställas in innan analysen börjar i inställningen "Assay Wizard".
Notera: Varje tillstånd kommer att ha ett medelvärde ± standardavvikelse visas för varje takt, och varje tillstånd. Det finns hastighets mätningar per tillstånd (Tillstånd 2 [Coupling] / State3u [Electron Flow] andning följt av fyra injektioner). Använd medelvärdet av staten 2 graden av den andra mätningen, bestämma staten 4o vid minsta punkt efter oligomycinkänslig injektionen använda den maximala poäng för staten 3 och statliga 3u efter ADP och FCCP injektion, respektive, och använda minsta poäng för antimycin A respiration för kopplingen analyser. Använd den maximala poäng för pyruvat / malat inducerad State 3u andning, använda minstapoäng för rotenon respiration, använder maximal poäng för succinat inducerad statligt 3u andning, och använda minsta poäng för antimycin A respiration för Electron Flow-analysen. Alla experiment utfördes 3 gånger och de data som visas är resultatet av ett representativt spårning.
Representative Results
Figur 1 representerar syreförbrukning (OCR) för pyruvat / målat, succinat / rotenon, palmitoyl karnitin / målat och glutamat / malat analyser (Koppling Assays). Dessa analys kurvor visas som syreförbrukning, eller OCR, kontra tid, bakgrund correceted, och visas som punkt-till-punkt-priser. Varje panel representerar syreförbrukningen i olika mitokondriella tillstånd såsom beskrivits av Chance och Williams 14. Den första panelen representerar basal syreförbrukning, eller stat 2. Den andra panelen, efter injektion av ADP, representerar maximal kopplad andning, eller staten 3. Den tredje panelen, efter injektion av oligomycin A (en inhibitor av komplex V), betecknar andning på grund till proton läcka eller staten 4o. Den fjärde panelen, efter injektion av FCCP representerar maximal okopplad andning eller statliga 3u. Slutligen, den femte panelen, efter injektion av antimycin A, representerar hämning av oxidativ andning. Notably all mitokondriella stater har minimal standardavvikelse. Detta beror på noggrann blandning av den mitokondriella lager och mitokondrier / substratblandningar, och uppnåendet av ett enda monoskikt av mitokondrier efter vidhäftning spinn (steg 2,6). Å andra sidan, lastning ojämlika mitokondrier i varje brunn och inte uppnå ett enda monoskikt av mitokondrier i brunnen av mikroplattan leder till ökad standardavvikelsen i varje tillstånd som visas i figur 2.
Kurvorna i figur 1 display platåer för varje mitokondrie stat och för varje substrat. Platån uppnåddes efter två mätcykler tyder god mitokondrie kvalitet och att mitokondrierna förblir anslutit sig till väl under hela analysen. Dessutom kan uppnåendet av planade maximala satser vara mer önskvärd eftersom detta tillåter forskaren att ta medelvärdet OCR vid dessa mitokondriella tillstånd, vilket minskar partiskhet som kan uppstågenom att godtyckligt välja en punkt.
Mängden mitokondrier per brunn bestämdes genom optimeringsförsök. Den optimala mängden av mitokondrier per brunn bör resultera i tillstånd 2 grader mellan 100-200 pmol / min / brunn och tillstånd 3 priser <1500 pmol / min / brunn, eftersom dessa värden är inom det dynamiska syre avkänningsområde av flera brunnar syre konsumtion mätmaskin. Laddar för mycket mitokondrieprotein per brunn kan resultera i OCRs bortom det dynamiska området av instrumentet (fig 3A). Figur 3 visar lastning 3,5 | ig av mitokondrieprotein per brunn (blå spårning) jämfört med lastning 2,5 | ig av mitokondrieprotein per brunn (röd spårning) för succinat / rotenon analys. Laddar för mycket mitokondrieprotein per brunn kan också leda till konsumtion av syre inuti mikrokammaren av brunnen, vilket förhindrar noggrann mätning av OCR för varje successiv mätning 9 (figur 3B </ strong>). Punkt-till-punkt-OCR är den momentana ändringshastigheten för OCR. Om platt, är OCR stadig / stabil, men om minskande, så kan det finnas en biologisk eller teknisk fråga. Den kraftiga nedgången i OCR i staten 3 och statliga 3u andning (Figur 3A) orsakas av mitokondrier ansträngande syrgastillförseln före slutet av mätningen (Figur 3B).
Figur 4 representerar OCR vs. tid för analys elektronflöde. Spårning korrigeras och visas som beskrivits för figur 1. Den första panelen i denna analys representerar statligt 3u andning på pyruvat / malat via Complex I. Den andra panelen, efter injektion av rotenon representerar hämning av Complex I medierad andning. Den tredje panelen, efter injektion av succinat utgör substrat stimulerade statliga 3u med elektroner in i ETC på Complex II (Complex II medierad andning). Den fjärde panelen, efter injicering av Antimycin A representerar hämning av komplex III och sålunda totala andning. Slutligen, den femte panelen, efter injektion av askorbat / TMPD representerar Complex IV förmedlad andning. I likhet med kurvorna i fig 1, alla mitokondriella stater har minimal standardavvikelse och varje takt har eller nästan har uppnått en platå.
Figur 1. Kopplings Analyser. (A) 10 mM Pyruvat / 5 mM målat, (B) 10 mM succinat / 2 pM rotenon, (C) 40 ^ M palmitoyl karnitin / 1 mM målat, och (D) 10 mM glutamat / 10 mM malat kopplat mitokondriella andningsanalys kurvor som bestäms av flerbrunns mätning av syreförbrukning. Värden uttrycks som medelvärde ± SD. Mitochondrial protein laddades per brunn var 3,5 mikrogram för alla analyser utom succinat / rotenon, som använder 2,5 pg av mitokondrie protein per brunn. Data representerar n = 3 parade biologiska replikat. OCR = syreförbrukningen; ADP = adenosindifosfat; Oligo = Oligomycin A; FCCP = Karbonyl cyanide- 4 - (trifluormetoxi) fenylhydrazon; Anti-A = antimycin A; PYR = Pyruvat; SUCC = succinat; ROT = Rotenon; PAL-C = palmitoyl karnitin; GLUT = glutamat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Mycket Variabel Pyruvat / Malate analys. Mycket variabel 10 mM pyruvat / 5 mM malat analys som orsakas av ofullständigt blanda mitokondrier från mitokondrie lager i substratet / MAS mix, vilket leder till variabel mitokondrie protein lastning i varje brunn. Mitochondrial protein laddades per brunn var 3,5 mikrogram. Data representerar n = 3 parade biologiska replikat. OCR = syreförbrukningen; ADP = adenosindifosfat; Oligo = Oligomycin A; FCCP = Karbonyl cyanide- 4 - (trifluormetoxi) fenylhydrazon; Anti-A = antimycin A; PYR = Pyruvat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Överlagring Mitokondriell Protein för succinat / Rotenon analys. (A) syreförbrukning utanför det dynamiska omfånget av fler väl syreförbrukning mätmaskin orsakas genom att ladda 3,5 mikrogram av mitokondrie protein per brunn (blå spårning) jämfört med lastning 2,5 pg av mitokondrie protein per brunn (röd spårning). (B ) OxyGen spänning som närmar sig noll efter ADP och FCCP injektioner orsakade genom att ladda alltför mitokondrie protein (3,5 mikrogram) per brunn (blå spårning) jämfört med lastning en optimal mängd (2,5 mikrogram) av mitokondriell protein per brunn (röd spårning). Data representerar n = 3 parade biologiska replikat per mitokondriell proteinmängden. OCR = syreförbrukningen; ADP = adenosindifosfat; Oligo = Oligomycin A; FCCP = Karbonyl cyanide- 4 - (trifluormetoxi) fenylhydrazon; Anti-A = antimycin A; SUCC = succinat; ROT = Rotenon; O 2 = syre; mm Hg = millimeter kvicksilver. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Electron Flow analys. 5 mM pyruvat / 1 mM malat +4 iM FCCP, elektron flåg mitokondrie andning analys spårning som bestäms av flerbrunns mätning av syreförbrukning. Värden uttrycks som medelvärde ± SD. Mitochondrial protein laddades per brunn var 3,5 mikrogram. Data representerar n = 3 parade biologiska replikat. OCR = syreförbrukningen; Anti-A = antimycin A; Asc = Askorbat; TMPD = N, N, N ', N' -tetramethyl- p-fenylendiamin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagens | Lager Koncentration | MW | Slutlig volym | Mäss tillagd | Kommentarer / Beskrivning | ||||||
| (M) | (g / mol) | (ml) | (g eller ml) | ||||||||
| EGTA, pH 7,2 | 0,1 | 380,35 | 100 ml av 1 M Tris-bas | 3,801 g | Förvaras vid 4 ° C | ||||||
| HEPES | 1 | 238,3 | 250 ml DIH 2 O | 59. 57 g | Förvaras vid 4 ° C | ||||||
| MgCl2, hexahydrat | 1 | 203,31 | 250 ml DIH 2 O | 50,82 g | Förvaras vid 4 ° C | ||||||
| Pyruvat pH 7,4 | 0,1 | 88.06 (Kommer som 14,11 M lösning) | 40 ml DIH 2 O | 0,283 ml pyrodruvsyra | Gör 1 ml portioner och förvara vid -20 ° C, göra nya varannan vecka | ||||||
| Succinat pH 7,4 | 0,5 | 118,09 | 100 ml av DIH 2 O | 9,4 g succinic syra | Gör 1 ml alikvoter och förvara vid -20 ° C | ||||||
| Målat, pH 7,4 | 0,5 | 134,09 | 100 ml av 95% etanol | 6,7 g äppelsyra | Gör 200 ul alikvoter och förvara vid -20 ° C | ||||||
| TMPD | 0,01 | 164,25 | 10 ml | 0,0164 g | Gör 300 ul alikvoter och förvara vid -20 ° C; Blanda med en ekvimolär mängd askorbat att hålla TMPD minskas | ||||||
| Palmitoyl-L-karnitin-klorid | 0,01 | 436,07 | 1,14 ml av 95% etanol | 0,005 g | Gör 40 l alikvoter och förvara vid -20 ° C | ||||||
| Oligomycin A | 0,006 | 791,06 | 0,987 ml av 95% etanol | 0,005 g | Gör 20 pl alikvoter och förvara vid -20 ° C | FCCP | 0,01 | 254,17 | 3,9 ml av 95% etanol | 0,01 g | Gör 40 l alikvoter och förvara vid -20 ° C |
| Rotenon | 0,001 | 394,4 | 10 ml av 95% etanol | 0,0039 g | Förvara vid -20 ° C | ||||||
| Antimycin A | 0,005 | 548,63 | 9.12 ml av 95% etanol | 0,025 g | Förvara vid -20 ° C | ||||||
| K + ADP | 0,5 | 501,32 | 3,9 ml av DIH 2 O | 1,0 g | Förvara vid -20 ° C | ||||||
| Äppelsyra, pH 7,4 | 0,5 | 134,09 | 40 ml | 2,68 g | Gör 200 ul alikvoter och förvara vid -20 ° C |
| Reagens | Lager Koncentration | Mäss tillagd | Slut Molaritet / Procent |
| (M) | (g eller ml) | ||
| Sackaros | - | 11,98 g | 70 mM |
| Mannitol | - | 20,04 g | 220 mM |
| Monobasiskt kaliumfosfat | - | 0,34 g | 5 mM |
| MgCl2, hexahydrat | 1 | 2,5 ml | 5 mM |
| HEPES | 1 | 1,0 ml | 2 mM |
| EGTA | 0,1 | 5,0 ml | 1 mM |
| I huvudsak Fettsyra Gratis- BSA | - | 1,0 g | 0,20% |
. Tabell 2. MAS Mix pH 7,4, 500 ml: Alikvotera 25 ml och lagra vid -20 ° C * Notera: Uteslut BSA för MAS mix som används för analys injektioner.
| Substrat Medium | Slutlig koncentration | Mängd lager (il) | Mängd MAS * (ml) |
| Pyruvat / malat | 10 mM / 5 mM | Pyruvat: 1000 | 9 |
| Målat: 100 | |||
| Succicinate / Rotenon | 10 mm / 2 iM | Succinat: 200 | 10 |
| Rotenon 20 | |||
| * Pyruvat / malat + FCCP | 5 mM / 1 mM / 4 iM | Pyruvat: 500 | 10 |
| FCCP: 4 | |||
| Målat: 20 | |||
| Palmitoyl-L-karnitin / malat | 40 pM / 1 mM | Palmitoylkarnitin: 40 malat: 20 | 10 |
| Glutamat / malat | 10 mM / 10 mM | Glutamat: 400 | 10 |
| Målat: 200 |
Tabell 3. Substrat Solutions pH 7,4: Gör färskt dagen för experimentet. * Electron analysflöde lösning.
| Injektion Medium | Koncentration | Mängd lager (il) | <td> Mängd MAS (ml)Mängd sprutas in Cartridge | Slutlig koncentration | |
| (Efter injicerades i platta) | |||||
| ADP | 50 mM | 300 pl | 3 | 50 ^ | 5,0 mM |
| Oligomycin A | 20 ^ M | 10 pl | 3 | 55 | il | 2,0 | iM |
| FCCP | 40 ^ M | 12 | il | 3 | 60 ^ | 4,0 | iM |
| Antimycin A | 40 ^ M | 24 | il | 3 | 65 | il | 4,0 | iM |
Tkunna 4. Injektioner för Kopplade analyser pH 7,4. Gör färskt dagen för experimentet. * Kopplingsanalyser innefattar (men är inte begränsade till) pyruvat / målat, succinat / rotenon, palmitoyl karnitin / malat, och glutamat / malat.
| Injektion Medium | Koncentration | Mängd lager (g eller ul) | Mängd MAS (ml) | Mängd sprutas in Cartridge | Slutlig koncentration (Efter injiceras i platta) |
| Rotenon | 20 ^ M | 60 ^ | 3 | 50 ^ | 2,0 | iM |
| Succinat | 50 mM | 300 pl | 3 | 55 | il | 5,0 mM |
| Antimycin A | 40 ^ M | 24 μ; l | 3 | 60 ^ | 4,0 | iM |
| TMPD / Ascorabte | 1 mM, 100 mM | TMPD: 300 pl | 3 | 65 | il | 100 | iM, 10 mM |
| Askorbat: 0,059 g |
Tabell 5. Injektioner för elektronflöde analys pH 7,4. Gör färskt dagen för experimentet
| Kommando | Tid (min) | # Cykler |
| Kalibrera | ||
| Vänta | 10 min (så att plattan värmas från vidhäftning steg) | |
| Blanda | 1 min | 2 |
| MigASURE | 2 min | |
| Injicera A | ||
| Blanda | 1 min | 2 |
| Åtgärd | 2 min | |
| Injicera B | ||
| Blanda | 1 min | 2 |
| Åtgärd | 2 min | |
| Injicera C | ||
| Blanda | 1 min | 2 |
| Åtgärd | 2 min | |
| Injicera D | ||
| Blanda | 1 min | 2 |
| Åtgärd | 2 min |
Tabell 6. Instrument Run protokoll.
Discussion
De metoder som presenteras i denna artikel ger steg-för-steg-instruktioner för att utföra en samling av mikrobaserad respirometric analyser som använder mitokondrier isolerade 75-100 mg mus skelettmuskel. Dessa analyser kan utföras med hög precision, vilket framgår av den täta standardavvikelse mellan trippelbrunnar. Det är viktigt att låta dessa respirometric analyser precisera var avvikelser och / eller anpassningar kan förekomma i ETC, TCA-cykeln, β-oxidation vägen, substrat transportörer, etc. i ett vanligt förekommande djurmodell.
Det är viktigt att lyfta fram motiven för att använda olika bränslen och inhibitorer som används i detta protokoll. Pyruvatet / malat och glutamat / malat respirometric analyser gör det möjligt att bedöma Complex I medierad andning, samt bedömningen av deras respektive transportörer, och i fallet av glutamat, den deaminas 15. Alternativt kan kombinationen avsuccinat / rotenon möjligt att bedöma om mitokondriell andnings flödet genom Complex II i ETC eftersom Rotenon hämmar komplex I och succinat ger elektroner till Complex II via en minskning av flavinadenindinukleotid (FADH2) 15. Dessa analyser ger underlag specifik information om kopplingseffektiviteten och maximal andning. Analys elektronflöde är unik i att kombinationen av substrat och hämmare gör det möjligt att bedöma flera komplex under mitokondriell andnings flux 9. Den initiala substratblandning av pyruvat / malat + FCCP möjliggör utvärderingen av maximal andning driven av Complex I, medan insprutningen av rotenon följt av succinat möjliggör bedömningen maximal andning drivs av komplex II. Injektionen av antimycin A, en inhibitor av komplex III, följt av injektion av askorbat / TMPD tillåta för utvärdering av andning driven av Komplex IV eftersom Askorbat / TMPD är enelektrondonator till cytokrom C / Komplex IV. Även om ingen information om kopplingseffektiviteten erhålls, är metoden idealisk för mycket små provstorlekar som hindrar kör flera substrat oberoende. Slutligen, användning av palmitoyl karnitin / malat gör det möjligt att bedöma samordningen mellan β-oxidation och ETC eftersom den reducerande motsvarande producerad från oxidation av palmitinsyra (β-oxidation) matas in i ETC genom elektron överföra flavoprotein 15. Det bör noteras att kopplingen och elektronflöde analyser även skulle kunna användas tillsammans för att identifiera förändringar i mitokondriernas funktion på grund av någon intervention (missbruksbehandling, genmanipulation).
Den höga noggrannhet som uppnås för dessa analyser är i första hand på grund av noggrann blandning av mitokondrierna, om det är före proteinbestämning, eller med substratlösningar. Längs dessa linjer, när mitokondrierna är resuspendend i substrat Solutions, är det viktigt att blanda denna lösning noggrant före laddning av cellodlingsplatta som beskrivs i steg 2,2 med en vidgad öppning pipettspetsen. Underlåtenhet att blanda mitokondrierna noggrant kommer att leda till stor variation inom analysen. Dessutom med en smal öppning pipettspetsen skapar skjuvkrafter under blandning mitokondrierna och ökar möjligheterna att skada mitokondriemembranen och frisättning av cytokrom C. vidhäftning steget (2.7) är också ett viktigt steg i detta protokoll. Underlåtenhet att snurra laddade cellodlingsplatta lång / tillräckligt snabbt kommer att leda till bristande efterlevnad av mitokondrier till brunnen, vilket leder ökad variabilitet mellan brunnar och mätningar.
Den beskrivna protokollet har optimerats för att inkludera: laddar en optimal mängd av mitokondrie protein per brunn, med rätt koncentrationer / framställningsmetoder för att göra lager och substratlösningar, förändra analyskörning för att säkerställa mitokondrie statliga plateaus och lämplig blandning av de mitokondriella lager och mitokondrie / substratblandningar. Innan dessa optimering ansträngningar, författarna mötte fallgropar i analyskörning. Följande diskuterar felsökningsmetoder / ändringar som var till hjälp för att optimera detta protokoll. När det gäller optimal laddning, kommer lastning för lite mitokondrier inte framkalla ett robust svar, medan laddar för mycket mitokondrier kommer att uttömma syret i mikrokammaren och leda till felaktiga mätningar. Rogers et al 9 ger exempel på att bestämma optimala påfyllningsmängd av mitokondrier per brunn för mikrobaserad respirometric analyser. Oftare är för mycket mitokondrier laddades per brunn, vilket framgår av tillståndet 2 hastigheter över 100-200 pmol / min / brunn och tillstånd 3 hastigheter> 1500 pmol / min / brunn. Om över lastningen sker, utför ett experiment med varierande koncentration av mitokondrie protein (t.ex. mellan 1 -. 10 mikrogram) för att framkalla OCRs inom det dynamiska range av mätningsmaskinen syreförbrukning. Förberedelser och med rätt koncentrationer av substrat och aktier är av yttersta vikt. Använd alltid syraformen av substrat / injektioner och justera pH med kaliumhydroxid eller HCl; natrium buffertar / är lösningar rekommenderas inte. Dessutom resuspending substrat / lager i DMSO eller 100% etanol kommer att resultera i mätning fel eller fel. Var noga med att använda 95% etanol var noterat. Det är vanligt att palmitoyl karnitin för utfällning ur 95% etanol efter upptining den frusna lager, vilket orsakar stor variabilitet. Var noga med att värma upp palmitoyl karnitin lager och skaka väl före användning. Dessutom kan en i hög grad variabel pyruvat / malat analysresultatet bero på pyruvat lager varelse> 2 veckor gamla. Var noga med att återskapa frysta portioner av pyruvat var 2 veckor. Analyskörning ändrades till 2-min mätningar för att säkerställa mitokondriella statliga platåer. Om observation av konsumtion av ADP önskas forskaren fårförlänga mättiden under "protokollet" -fliken under "Assay Wizard" forum. Slutligen uppstår stora variationer när mitokondriella lager och mitokondrier plus substratlösningar inte homogeniseras fullständigt före laddning. Om variationen mellan brunnarna är hög efter analyskörning, var noga med att helt blanda substratlösningen före nästa experiment. Virvel aldrig mitokondrierna / substratlösningar, snarare rör, mäsk och försiktigt finfördela med en vidgad öppning pipettspetsen.
Det finns vissa begränsningar av denna teknik som är värt att notera. För det första är antalet brunnar på cellodlingsplatta användes för dessa analyser relativt låg (dvs., 24 brunnar och åtminstone två utsedda för tomma brunnar). Om det är önskvärt att utföra alla fem av dessa analyser på en platta, är en forskare endast kunnat undersöka svaren från en mus i taget. Emellertid bör det noteras att 96 brunnar instrument finns tillgängliga för higher genomströmning. För det andra, det finns inneboende styrkor och svagheter i bedömningen av mitokondriell dysfunktion hos isolerade mitokondrier än i intakta celler 1. Vissa brister bland annat att ha mindre fysiologisk relevans jämfört med intakta celler och inducerar artefakter från isoleringsprocessen. Slutligen är framgången för denna metod beroende av kvaliteten på den mitokondriella isoleringsprocessen.
Även om vissa av dessa analyser har antingen utvecklats i olika system eller har validerats i andra djurmodeller, de metoder som presenteras här är de första att syntetisera alla av de ovan nämnda analyser för optimal användning i en fler väl syreförbrukning mätmaskin med musen skelettmuskel. Viktigt är alla fem av dessa analyser kan utföras med den mängd mitokondrier isolerade från ~ 75 - 100 mg av mus skelettmuskel, vilket ger hög genomströmning med minimal material. Av stor betydelse, förmågan hos flera brunnarsyreförbrukning teknik för att utföra analyser med minimala kvantiteter av mitokondrier, i kombination med en optimerad isoleringsmetod, tillåter forskaren att utföra en mängd andra experiment med återstoden av skelettmuskelvävnad (t.ex.., western blöts, RT-PCR, enzymatiska analyser, etc), vilket ofta är en kamp med denna djurmodell.
Sammanfattningsvis, de metoder som presenteras här ger steg-för-steg-instruktioner för att utföra en samling av mikrobaserad respirometric analyser med användning av minimala mängder av mus skelettmuskulaturen. Det är viktigt att de presenterade metoder kräver minimala mängder av vävnad och mitokondrier. När behärskar, kommer de tekniker som beskrivs häri tillåter forskare att bestämma en potentiell mekanism av en förening eller genprodukt på mitokondriell syreförbrukningen i en vanligen använd djurmodell.
Disclosures
George W. Rogers är anställd i Seahorse Bioscience som tillverkar instrument för vilka dessa analyser har utvecklats.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | Store at RT |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | Store at RT |
| Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0% | Sigma Aldrich | P5379 | Store at RT |
| Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0% | Sigma Aldrich | M9272 | Store at RT |
| HEPES minimum 99.5% titration | Sigma Aldrich | H3375 | Store at RT |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | Store at RT |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | Store at 4 °C |
| Acid Free- BSA | |||
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4 °C |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at RT |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at RT |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at RT |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | Store at RT |
| 99%, powder [TMPD] | |||
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20 °C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2 - 8 °C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20 °C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20 °C |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at RT |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
References
- Brand, M., Nicholls, D.
- Wang, H., Hiatt, W. R., Barstow, T. J., Brass, E. P. Relationships between muscle mitochondrial DNA content, mitochondrial enzyme activity and oxidative capacity in man: alterations with disease. European Journal of Applied Physiology and Occupational Physiology. 80, 22-27 (1999).
- Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. The mitochondrial genome in aging and senescence. Ageing Research Reviews. 18C, 1-15 (2014).
- Nunnari, J., Suomalainen, A.
- Dube, J. J., et al. Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance. Endocrinology and Metabolism. 307, E1117-E1124 (2014).
- Disease Control and Prevention Services. National diabetes statistics report: estimates of diabetes and its burden in the United States. , US Department of Health and Human Services. Atlanta, GA. (2014).
- Guarino, R. D., et al. Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration. Biotechnology and Bioengineering. 86, 775-787 (2004).
- Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nature Protocols. 1, 2563-2572 (2007).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6, e21746 (2011).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, C125-C136 (2007).
- Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods (San Diego, Calif.). 26, 292-297 (2002).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Frisard, M. I., et al. Low levels of lipopolysaccharide modulate mitochondrial oxygen consumption in skeletal muscle. Metabolism. 64, 416-427 (2015).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Advances in Enzymology and Related Subjects of Biochemistry. 17, 65-134 (1956).
- Mitochondrial pathways and respiratory control. Gnaiger, E. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck. (2007).
