Introduction
कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रिया के मुख्य शारीरिक भूमिका ऑक्सीडेटिव फास्फोरिलीकरण 1 से एटीपी का उत्पादन होता है। महत्वपूर्ण बात है, कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रिया 3, अपक्षयी रोग 4 और प्रकार द्वितीय मधुमेह 5 उम्र बढ़ने, व्यायाम क्षमता 2 में एक विशेष भूमिका निभाते हैं। एक उम्र बढ़ने समाज, और प्रकार द्वितीय मधुमेह यूनाइटेड स्टेट्स 6 में मौत के 7 वें प्रमुख कारण किया जा रहा है के रूप में, माइटोकॉन्ड्रियल समारोह का आकलन है कि तरीकों के लिए जरूरत के जैव चिकित्सा अनुसंधान 7,8 में तेजी से और अधिक प्रचलित हो गया है। यह ऑक्सीडेटिव फास्फोरिलीकरण 9 के कार्यात्मक घटकों को व्यक्त करने के माइटोकॉन्ड्रियल और परमाणु जीनोम के बीच समन्वित समारोह का प्रतिनिधित्व करता है के बाद से विशेष रूप से, ऑक्सीजन की खपत की माप माइटोकॉन्ड्रियल समारोह का आकलन करने में असाधारण उपयोगिता है।
कई प्रौद्योगिकियों कि बरकरार कोशिकाओं में ऑक्सीजन की खपत की माप में सक्षम है और अलग-थलग मौजूदडी माइटोकॉन्ड्रिया 7-10। इसके अलावा, assays के अनेक प्रकार की कोशिकाओं और ऊतकों के लिए विकसित की है, और mitochondrial रास्ते और श्वसन नियंत्रण 9,11,12 की माप के लिए अनुमति देते हैं कि प्रजातियों में से एक किस्म में की गई है। हालांकि, microplate आधारित ऑक्सीजन की खपत प्रौद्योगिकियों में उपयोग के लिए माउस कंकाल की मांसपेशी से पृथक माइटोकॉन्ड्रिया का उपयोग कर इन परीक्षणों की सभी के संकलन के संबंध में साहित्य में एक शून्य वर्तमान में है। महत्वपूर्ण बात है, microplate आधारित respirometric assays के उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल जीव के बीच बढ़ रही है और अलग-थलग माइटोकॉन्ड्रिया 9 की न्यूनतम मात्रा का उपयोग करते हुए उच्च throughput मापन के लिए अनुमति देता है। इसलिए, microplate आधारित respirometric assays के एक संग्रह असामान्यताएं और / या रूपांतरों इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ईटीसी) में होने वाली हो सकती है, जहां की pinpointing की अनुमति है कि विकसित किए गए। इसके अलावा, दो अतिरिक्त microplate आधारित respirometric assays के समन्वय के आकलन betwee सक्षम है कि विकसित किए गएtricarboxylic एसिड (टीसीए) चक्र और आदि, और एस एस ऑक्सीकरण और आदि के बीच n महत्वपूर्ण बात है, प्रस्तुत तरीकों आमतौर पर इस्तेमाल किया पशु मॉडल में माइटोकॉन्ड्रियल समारोह में यंत्रवत परिवर्तनों को मापने के लिए एक स्पष्ट और संक्षिप्त तरीके से प्रदान करते हैं।
Protocol
नोट: एक लाल कंकाल की मांसपेशी से माइटोकॉन्ड्रिया अलग-थलग हो जाने के बाद इस प्रोटोकॉल शुरू होता है। लाल कंकाल की मांसपेशी 13 से 100 मिलीग्राम - पहले ~ 75 से वर्णित के रूप में माइटोकॉन्ड्रिया अलग थे। माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की 10 माइक्रोग्राम / μl माइटोकॉन्ड्रिया के लिए अलगाव बफर के ≤50 μl में अंतिम mitochondrial गोली (आईबीएम) 2 (Frisard एट अल 13 देखें) resuspending द्वारा ऊतक की इस राशि से प्राप्त किया जाएगा - 5 के बीच।
1. सेटअप
- बाद में assays के लिए स्टॉक समाधान (तालिका 1) और माइटोकॉन्ड्रियल परख समाधान (मास) घोला जा सकता है (तालिका 2) काम कर तैयार करें।
नोट: ज्यादातर शेयरों समाधान और मास संग्रहित किया जा सकता है के रूप assays के लिए तैयारी का सबसे अग्रिम में किया जा सकता है। - 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गैर-सीओ 2 इनक्यूबेटर में प्रयोग से पहले रात 1 मिलीलीटर अंशांकन समाधान में एक respirometric परख कारतूस हाइड्रेट।
- प्रयोग, टी के दिन37 डिग्री सेल्सियस स्नान या इनक्यूबेटर में जमी शेयरों (substrates और माइटोकॉन्ड्रियल माड्युलेटर्स, मास मिश्रण, मास बीएसए w / ओ, 1 टेबल) और पिघलना बाहर ake।
- सभी सब्सट्रेट समाधान (3 टेबल) और इंजेक्शन (तालिका 4-5) तैयार है और (7.4 पीएच) के रूप में वांछित पीएच को समायोजित। पीएच समायोजित करने के बाद, बर्फ पर दुकान।
- कार्यक्रम उचित मिश्रण, रुको, और उपाय मापदंडों को बहु अच्छी तरह से ऑक्सीजन की खपत माप मशीन पहले "मानक" मोड द्वारा पीछा विश्लेषण सॉफ्टवेयर, दर्ज करके और लेबल पृष्ठभूमि और समूह / स्थिति कुओं (6 तालिका देखें)।
- "अतिथि" फोरम में दर्ज करें और 'परख जादूगर "पर क्लिक करें। "एक बार परख जादूगर" में, मिश्रण बदल प्रतीक्षा करें, और मानकों को मापने के लिए "प्रोटोकॉल" पर क्लिक करें। "वापस तहत पृष्ठभूमि कुओं लेबल। सुधार "टैब और उजागर करने के लिए सुनिश्चित किया जाना" "पृष्ठभूमि सुधार करो।
- लेबल cond"समूह जानकारी" टैब के बाद "समूह और लेबल" टैब पर क्लिक करके पहला, द्वारा itions। इन मानकों प्रवेश कर रहे हैं के बाद, "टेम्पलेट सहेजें" के द्वारा पीछा किया, क्लिक करें "अंत"।
2. परख भागो
- एक परख रन कारतूस में इंजेक्शन समाधान लोड और पहले "मानक" मोड में प्रवेश के द्वारा पीछा विश्लेषण सॉफ्टवेयर, दर्ज करके अंशांकन शुरू करते हैं। "अतिथि" फोरम में दर्ज करें। "टेम्पलेट्स" टैब के तहत "एक्सएफ" अभियान के तहत 1.5 चरण में बचाया टेम्पलेट, खोलें। खुले एक बार, अंशांकन शुरू करने के लिए "शुरू" पर क्लिक करें।
नोट: परख रन कारतूस नीचे बाईं ओर नोकदार कोने के साथ मशीन में दर्ज होना चाहिए। इस बारे में 30 मिनट लगते हैं। उचित बंदरगाहों में समाधान इंजेक्षन करने के लिए ध्यान रखना। तालिका 4-5 में इंजेक्शन लोडिंग के क्रम में सूचीबद्ध हैं। - धीरे, लेकिन पूरी तरह mitochond मिश्रणधीरे कैंची से टिप के अंत बंद ~ 3 मिमी काटने से चौड़ी अपनी छिद्र किया गया है कि एक 200 μl विंदुक टिप के साथ शेयर triturating के बाद एक 200 μl विंदुक टिप के साथ समाधान, सरगर्मी से रिया शेयर।
- माइटोकॉन्ड्रियल शेयर की प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए एक bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख प्रदर्शन।
- 2.3 कदम से अर्जित शेयर एकाग्रता का उपयोग करना, / succinate / rotenone सब्सट्रेट मिश्रण के 200 μl (3 टेबल) माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की 10 माइक्रोग्राम resuspend। माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की 14 माइक्रोग्राम / शेष सब्सट्रेट घोला जा सकता है के 200 μl (3 टेबल) (यह प्रत्येक सब्सट्रेट मिश्रण के लिए किया जाना चाहिए) resuspend। सभी माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन / सब्सट्रेट बर्फ पर घोला जा सकता है रखें।
नोट: 9 पहले से वर्णित के रूप में प्रत्येक परख के लिए अच्छी तरह से प्रति माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की अधिकतम राशि निर्धारित किया गया था। यह निर्धारित किया गया था कि पाइरूवेट / Malate, palmitoyl carnitine / Malate, ग्लूटामेट / Malate एकsuccinate / rotenone परख माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन का 2.5 माइक्रोग्राम प्रति अच्छी तरह से इस्तेमाल करते हुए डी इलेक्ट्रॉन प्रवाह assays, माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन 3.5 ग्राम का इस्तेमाल करता है। इसलिए, शोधकर्ता 4 के बाद से इस चरण में replicates के लिए पर्याप्त माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन resuspend करने की जरूरत है या तो 2.5 माइक्रोग्राम या 50 μl प्रति 3.5 माइक्रोग्राम प्रति अच्छी तरह से भरी हुई है (2.6 कदम देखें)। - धीरे, लेकिन पूरी तरह धीरे अपने अंत की ~ 3 मिमी पड़ा है कि एक 200 μl विंदुक टिप के साथ शेयर triturating के बाद एक 200 μl विंदुक टिप के साथ समाधान, सरगर्मी से माइटोकॉन्ड्रिया / सब्सट्रेट समाधान के मिश्रण से काट डाला।
- लोड 50 μl / अच्छी तरह से माइटोकॉन्ड्रिया / सब्सट्रेट घोला जा सकता है में से प्रत्येक के लिए, बर्फ पर और तीन प्रतियों में एक सेल कल्चर प्लेट रखें। microplate आधारित respirometric परख के डेवलपर्स अधिमानतः सेल कल्चर प्लेट पर दोनों तरफ, दो खाली (कोई माइटोकॉन्ड्रिया) कुओं की एक न्यूनतम छोड़ने की सलाह देते।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 2,000 ग्राम पर सेल कल्चर प्लेट स्पिन। प्लेट s है जबकिलगाए, एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सब्सट्रेट समाधान गर्म।
- स्पिन के बाद पूरा हो गया है, ध्यान से अपने संबंधित कुओं के शीर्ष पर प्रत्येक सब्सट्रेट समाधान के 450 μl लोड (यानी, शुरू में इस सब्सट्रेट समाधान में resuspended माइटोकॉन्ड्रिया है कि कुओं के लिए पाइरूवेट / Malate सब्सट्रेट लोड)। आरटी पर प्लेट लोड करने के लिए सुनिश्चित करें। नोट: खाली कुओं सब्सट्रेट के 500 μl के साथ लोड किया जाना चाहिए। युग्मित परख खाली कुओं किसी भी युग्मन परख सब्सट्रेट के साथ लोड किया जा सकता है, जबकि इलेक्ट्रॉन प्रवाह परख के लिए नामित खाली कुओं, इलेक्ट्रॉन प्रवाह सब्सट्रेट (पाइरूवेट / Malate + FCCP) के साथ लोड किया जाना चाहिए।
नोट: एक ही थाली पर युग्मित और इलेक्ट्रॉन प्रवाह assays के प्रदर्शन तो परख रन "साधन" टैब के माध्यम से "एक्सएफ रीडर" मंच का उपयोग पूर्ण होने के बाद, शोधकर्ता संबंधित assays के लिए पृष्ठभूमि कुओं फिरसेआबंटितकरें चाहिए। "एक बार जब साधन" की स्थापना के भीतर, "प्रशासन" पर क्लिक करें"पृष्ठभूमि सुधार 'के बाद टैब। जब पूरा मारो "साधन सेटअप मोड के अंत"। एस्कॉर्बेट / TMPD का संयोजन इस प्रकार एक अलग पृष्ठभूमि सुधार प्रत्येक परख प्रकार के लिए आवश्यक है 2 हे, उपभोग कर सकते हैं क्योंकि यह है। - सब्सट्रेट के 450 μl प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ा जाता है के बाद, माइटोकॉन्ड्रिया एक भी monolayer में समान रूप से बिखरे हैं सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से में माइटोकॉन्ड्रिया की परत देखने (20X बढ़ाई [रोजर्स 9 देखें, चित्रा 4])। एक समान रूप से वितरित monolayer है प्रकट नहीं करते कि वेल्स पद अस्थायी हटाया जा सकता है।
- माइटोकॉन्ड्रियल पालन के लिए जाँच के बाद, respirometric परख साधन में microplate डालने और "ठीक" पर क्लिक करके चलाने परख शुरू करते हैं।
नोट: रन शुरू हो जाएगा से पहले 2.1 कदम से अंशांकन पूरा होना चाहिए। शोधकर्ता "ठीक" क्लिक करने के बाद, मशीन जांच के लिए इस्तेमाल किया गया था कि उपयोगिता प्लेट बेदखल करना होगा।- <ली> उपयोगिता थाली निकालें और ट्रे पर माइटोकॉन्ड्रिया में शामिल है कि सेल कल्चर प्लेट जगह है। सेल कल्चर प्लेट पर नीले निशान ट्रे के निचले बाएं कोने में रखा जाना चाहिए। परख रन शुरू करने के लिए "जारी रखें" पर क्लिक करें।
- प्लेट अलग हो जाता है एक बार, हटाने और सेल कल्चर प्लेट और कारतूस त्यागने और स्क्रीन पर "जारी रखें" पर क्लिक करें। रन स्वत: "डाटा" फ़ाइल में एक .xls फ़ाइल के रूप में सहेज लिया जाएगा।
- विकल्प: के तहत अगले बदलने के लिए "प्वाइंट-टू-प्वाइंट दरें" "मध्य बिंदु" "दर डेटा के रूप में प्रदर्शित"। इन परिवर्तनों को लागू करने के लिए "ठीक" पर क्लिक करें।
- एक साथ इसी तरह की स्थिति के समूह कुओं के लिए स्क्रीन के नीचे छोड़ दिया पर "खैर समूह मोड" टैब पर क्लिक करें। अंत में, बाईं ओर, स्क्रीन के बीच की ओर "नमूना मतलब / मानक त्रुटि" टैब पर क्लिक करें। परख "परख जादूगर" की स्थापना में शुरू होने से पहले वैकल्पिक रूप से, इन आदेशों सेटअप किया जा सकता है।
नोट: प्रत्येक हालत प्रत्येक दर और हर हालत के लिए प्रदर्शित मानक विचलन ± एक मतलब होगा। हालत (राज्य 2 [युग्मन] / State3u [इलेक्ट्रॉन प्रवाह] श्वसन चार इंजेक्शन के बाद) प्रति लिया दर माप कर रहे हैं। , इंजेक्शन oligomycin के बाद न्यूनतम बिंदु पर राज्य 4o का निर्धारण, दूसरा माप के राज्य 2 दर का मतलब का उपयोग क्रमश: ADP और FCCP इंजेक्शन के बाद राज्य में 3 और राज्य 3U के लिए अधिकतम बिंदु का उपयोग करें, और Antimycin एक के लिए न्यूनतम बिंदु का उपयोग युग्मन Assays के लिए प्रेरित श्वसन। न्यूनतम उपयोग, पाइरूवेट / Malate प्रेरित राज्य 3U श्वसन के लिए अधिकतम बिंदु का प्रयोग करेंrotenone प्रेरित श्वसन के लिए बिंदु, succinate प्रेरित राज्य 3U श्वसन के लिए अधिकतम बिंदु का उपयोग करें, और इलेक्ट्रॉन प्रवाह परख के लिए Antimycin एक प्रेरित श्वसन के लिए न्यूनतम बिंदु का उपयोग करें। सभी प्रयोगों में 3 बार प्रदर्शन किया गया और दिखाया गया डेटा एक प्रतिनिधि ट्रेसिंग के परिणाम हैं।
Representative Results
चित्रा 1 पाइरूवेट / Malate, succinate / rotenone, palmitoyl carnitine / Malate, और ग्लूटामेट / Malate assays (युग्मन Assays) के लिए ऑक्सीजन की खपत की दर (ओसीआर) का प्रतिनिधित्व करता है। ये परख ट्रेसिंग, ऑक्सीजन की खपत दर या ओसीआर, बनाम समय के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं पृष्ठभूमि correceted कर रहे हैं, और बात करने वाली बात दरों के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं। प्रत्येक पैनल मौका और विलियम्स 14 के रूप में वर्णित विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल राज्यों में ऑक्सीजन की खपत का प्रतिनिधित्व करता है। पहली पैनल, ADP के इंजेक्शन के बाद बेसल ऑक्सीजन की खपत, या राज्य 2. दूसरे पैनल का प्रतिनिधित्व करता है एक oligomycin के इंजेक्शन (परिसर वी के एक अवरोध) के बाद, अधिक से अधिक युग्मित श्वसन, या राज्य 3. तीसरा पैनल का प्रतिनिधित्व करता है, की वजह से श्वसन का प्रतिनिधित्व करता है प्रोटॉन रिसाव, या राज्य 4o करने के लिए। चौथे पैनल, FCCP के इंजेक्शन के बाद, अधिक से अधिक uncoupled श्वसन, या राज्य 3U प्रतिनिधित्व करता है। अंत में, पांचवें पैनल, Antimycin ए के इंजेक्शन के बाद, ऑक्सीडेटिव श्वसन के निषेध का प्रतिनिधित्व करता है। विशेष रूप से, अलएल माइटोकॉन्ड्रियल राज्यों न्यूनतम मानक विचलन है। इस माइटोकॉन्ड्रियल शेयर और माइटोकॉन्ड्रिया / सब्सट्रेट घोला जा सकता है, और पालन स्पिन (2.6 चरण) के बाद माइटोकॉन्ड्रिया की एक भी monolayer की प्राप्ति की पूरी तरह से मिश्रण की वजह से है। दूसरी ओर, एक अच्छी तरह से नहीं microplate के कुएं में माइटोकॉन्ड्रिया की एक भी monolayer को प्राप्त करने में असमान माइटोकॉन्ड्रिया लोड हो रहा है चित्रा 2 में दिखाया के रूप में प्रत्येक राज्य में मानक विचलन वृद्धि की ओर जाता है।
प्रत्येक माइटोकॉन्ड्रियल राज्य के लिए और प्रत्येक सब्सट्रेट के लिए चित्रा 1 प्रदर्शन पठारों में ट्रेसिंग। दो माप चक्र के बाद प्राप्त पठार अच्छा माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता चलता है और माइटोकॉन्ड्रिया परख की अवधि के दौरान अच्छी तरह से पालन रहते हैं कि। इस प्रकार हो सकता है कि पूर्वाग्रह को कम करने, शोधकर्ता इन माइटोकॉन्ड्रियल राज्यों में औसत ओसीआर लेने के लिए अनुमति देता है, क्योंकि इसके अलावा, plateaued अधिक से अधिक दरों की प्राप्ति अधिक वांछनीय हो सकता हैमनमाने ढंग से एक बिंदु का चयन करके।
अच्छी तरह से प्रति माइटोकॉन्ड्रिया की राशि अनुकूलन परीक्षणों द्वारा निर्धारित किया गया था। अच्छी तरह से प्रति माइटोकॉन्ड्रिया के अधिकतम राशि राज्य में परिणाम चाहिए 100-200 pmol / मिनट / अच्छी तरह से और राज्य 3 दरों <बीच 2 दरों 1,500 pmol / मिनट / खैर, इन मूल्यों बहु अच्छी तरह से ऑक्सीजन की गतिशील ऑक्सीजन संवेदन सीमा के भीतर हैं के बाद से खपत माप मशीन। अच्छी तरह से प्रति बहुत ज्यादा माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन लोड हो रहा है। साधन (चित्रा 3) के गतिशील सीमा से परे OCRs में परिणाम (3 अच्छी तरह से प्रति माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की लोडिंग 2.5 माइक्रोग्राम की तुलना में अच्छी तरह से प्रति माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन (नीला ट्रेसिंग) के 3.5 माइक्रोग्राम लोड हो रहा है दर्शाया गया है लाल आंकड़ा हो सकता है succinate / rotenone परख के लिए) ट्रेसिंग। अच्छी तरह से प्रति बहुत ज्यादा माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन लोड हो रहा है यह भी इस प्रकार एक के बाद एक माप 9 (चित्रा 3 बी <के लिए ओसीआर का सही माप रोकने, अच्छी तरह से microchamber के भीतर ऑक्सीजन की थकावट को जन्म दे सकता/ Strong>)। प्वाइंट-टू-प्वाइंट ओसीआर ओसीआर के परिवर्तन की तात्कालिक दर है। फ्लैट हैं, तो ओसीआर / स्थिर स्थिर है, लेकिन कम हो रही है, तो एक जीवविज्ञान या तकनीकी मुद्दा हो सकता है। राज्य में 3 और राज्य 3U श्वसन (चित्रा 3) में ओसीआर में भारी गिरावट माप (चित्रा 3 बी) के अंत से पहले ऑक्सीजन की आपूर्ति थकाऊ माइटोकॉन्ड्रिया के कारण होता है।
चित्रा 4 इलेक्ट्रॉन प्रवाह परख के लिए समय बनाम ओसीआर का प्रतिनिधित्व करता है। चित्रा 1 के लिए वर्णित के रूप में ट्रेसिंग सही है और प्रदर्शित किया जाता है। इस परख में पहली पैनल दूसरे पैनल, rotenone के इंजेक्शन के बाद, परिसर मैं मध्यस्थता श्वसन के निषेध का प्रतिनिधित्व परिसर आई के माध्यम से पाइरूवेट / Malate पर राज्य 3U श्वसन का प्रतिनिधित्व करता है। तीसरे पैनल, succinate के इंजेक्शन के बाद, इलेक्ट्रॉनों परिसर द्वितीय (परिसर द्वितीय मध्यस्थता श्वसन) पर आदि में प्रवेश करने के साथ सब्सट्रेट प्रेरित राज्य 3U प्रतिनिधित्व करता है। Antim के इंजेक्शन के बाद चौथे पैनल,ycin ए, परिसर तृतीय और इस प्रकार कुल श्वसन के निषेध का प्रतिनिधित्व करता है। अंत में, पांचवें पैनल, एस्कॉर्बेट / TMPD के इंजेक्शन के बाद, परिसर चतुर्थ मध्यस्थता श्वसन का प्रतिनिधित्व करता है। चित्रा 1 में ट्रेसिंग के लिए इसी प्रकार, सभी माइटोकॉन्ड्रियल राज्यों न्यूनतम मानक विचलन है, और प्रत्येक की दर एक पठार प्राप्त कर ली है लगभग है या।
चित्रा 1. युग्मन assays। (ए) 10 मिमी पाइरूवेट / 5 मिमी Malate, (बी) 10 मिमी succinate / 2 माइक्रोन rotenone, (सी) 40 माइक्रोन palmitoyl carnitine / 1 मिमी Malate, और (डी) 10 मिमी ग्लूटामेट / 10 मिमी ऑक्सीजन की खपत की बहु अच्छी तरह से माप द्वारा निर्धारित रूप में Malate माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन परख ट्रेसिंग युग्मित। मूल्यों मतलब ± एसडी के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। अच्छी तरह से प्रति लोड माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन succinate / सड़ांध को छोड़कर सभी assays के लिए 3.5 माइक्रोग्राम थामाइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन का 2.5 माइक्रोग्राम प्रति अच्छी तरह से इस्तेमाल करता है जो enone। डेटा एन = 3 बनती जैविक प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करता है। ओसीआर = ऑक्सीजन की खपत दर; ADP = Adenosine Diphosphate; Oligo = Oligomycin एक; FCCP = कार्बोनिल cyanide- 4 - (trifluoromethoxy) phenylhydrazone; विरोधी एक = Antimycin एक; PYR = पाइरूवेट; SUCC = Succinate; सड़ांध = Rotenone; पाल-सी palmitoyl carnitine =; भरमार = ग्लूटामेट। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. अत्यधिक चर पाइरूवेट / Malate परख। अधूरे इस प्रकार चर माइटोकॉन्ड्रियल समर्थक के लिए अग्रणी, सब्सट्रेट / मास मिश्रण में माइटोकॉन्ड्रियल स्टॉक से माइटोकॉन्ड्रिया मिश्रण की वजह से अत्यधिक चर 10 मिमी पाइरूवेट / 5 मिमी Malate परखप्रत्येक कुएं में Tein लोड हो रहा है। अच्छी तरह से प्रति लोड माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन 3.5 ग्राम था। डेटा एन = 3 बनती जैविक प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करता है। ओसीआर = ऑक्सीजन की खपत दर; ADP = Adenosine Diphosphate; Oligo = Oligomycin एक; FCCP = कार्बोनिल cyanide- 4 - (trifluoromethoxy) phenylhydrazone; विरोधी एक = Antimycin एक; PYR = पाइरूवेट। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Succinate / Rotenone परख के लिए चित्रा 3. ओवरलोडिंग Mitochondrial प्रोटीन। (ए) प्रति अच्छी तरह से माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन (नीला ट्रेसिंग) के 3.5 माइक्रोग्राम लोड के कारण बहु अच्छी तरह से ऑक्सीजन की खपत माप मशीन के गतिशील रेंज के बाहर ऑक्सीजन की खपत की दर अच्छी तरह से (लाल ट्रेसिंग) प्रति माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की लोडिंग 2.5 माइक्रोग्राम की तुलना में। (बी ) बैलआ रहा तनाव ygen शून्य ADP और अच्छी तरह से प्रति माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की एक अधिकतम राशि (2.5 माइक्रोग्राम) (लाल ट्रेसिंग) लोड हो रहा है की तुलना में अच्छी तरह से (नीले ट्रेसिंग) प्रति अत्यधिक माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन (3.5 माइक्रोग्राम) लोड के कारण FCCP इंजेक्शन के बाद। डेटा माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन राशि प्रति एन = 3 बनती जैविक प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करता है। ओसीआर = ऑक्सीजन की खपत दर; ADP = Adenosine Diphosphate; Oligo = Oligomycin एक; FCCP = कार्बोनिल cyanide- 4 - (trifluoromethoxy) phenylhydrazone; विरोधी एक = Antimycin एक; SUCC = Succinate; सड़ांध = Rotenone; हे 2 = ऑक्सीजन; पारा के एमएम एचजी = मिलीमीटर। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4. इलेक्ट्रॉन प्रवाह परख। 5 मिमी पाइरूवेट / 1 मिमी Malate 4 माइक्रोन FCCP, इलेक्ट्रॉन चऑक्सीजन की खपत की बहु अच्छी तरह से माप द्वारा निर्धारित रूप में कम mitochondrial श्वसन परख ट्रेसिंग। मूल्यों मतलब ± एसडी के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। अच्छी तरह से प्रति लोड माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन 3.5 ग्राम था। डेटा एन = 3 बनती जैविक प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करता है। ओसीआर = ऑक्सीजन की खपत दर; विरोधी एक = Antimycin एक; ए एस सी = एस्कोर्बेट; TMPD = एन, एन, एन ',' एन -tetramethyl- पी -phenylenediamine। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| अभिकर्मक | शेयर एकाग्रता | मेगावाट | अंतिम वॉल्यूम | मास जोड़ा गया | टिप्पणियाँ / विवरण | ||||||
| (एम) | (छ / मोल) | (एमएल) | (छ या एमएल) | ||||||||
| EGTA, पीएच 7.2 | 0.1 | 380.35 | 1 एम Tris बेस के 100 मिलीलीटर | 3.801 ग्राम | स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस पर | ||||||
| HEPES | 1 | 238.3 | DIH 2 ओ की 250 मिलीलीटर | 59. 57 ग्राम | स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस पर | ||||||
| 2 MgCl, hexahydrate | 1 | 203.31 | DIH 2 ओ की 250 मिलीलीटर | 50.82 छ | स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस पर | ||||||
| पाइरूवेट 7.4 पीएच | 0.1 | 88.06 (14.11 एम समाधान के रूप में आता है) | DIH 2 ओ के 40 मिलीलीटर | पाइरुविक अम्ल की 0.283 मिलीग्राम | , -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर aliquots और दुकान बनाने के लिए हर दो सप्ताह के नए सिरे से बनाने | ||||||
| Succinate 7.4 पीएच | 0.5 | 118.09 | DIH 2 ओ की 100 मिलीलीटर | सु का 9.4 जीccinic एसिड | -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर aliquots और दुकान | ||||||
| Malate, पीएच 7.4 | 0.5 | 134.09 | 95% इथेनॉल के 100 मिलीलीटर | मैलिक एसिड की 6.7 ग्राम | -20 डिग्री सेल्सियस पर 200 μl aliquots और दुकान बनाओ | ||||||
| TMPD | 0.01 | 164.25 | 10 मिलीलीटर | 0.0164 जी | -20 डिग्री सेल्सियस पर 300 μl aliquots और दुकान बनाने के लिए; कम हो TMPD रखने के लिए एस्कॉर्बेट की एक equimolar राशि के साथ मिक्स | ||||||
| Palmitoyl एल carnitine क्लोराइड | 0.01 | 436.07 | 95% इथेनॉल के 1.14 मिलीलीटर | 0.005 ग्राम | -20 डिग्री सेल्सियस पर 40 μl aliquots और दुकान बनाओ | ||||||
| Oligomycin एक | 0.006 | 791.06 | 95% इथेनॉल के 0.987 मिलीग्राम | 0.005 ग्राम | -20 डिग्री सेल्सियस पर 20 μl aliquots और दुकान बनाओ | FCCP | 0.01 | 254.17 | 95% इथेनॉल के 3.9 मिलीलीटर | 0.01 छ | -20 डिग्री सेल्सियस पर 40 μl aliquots और दुकान बनाओ |
| Rotenone | 0.001 | 394.4 | 95% इथेनॉल के 10 मिलीलीटर | 0.0039 जी | स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर | ||||||
| Antimycin एक | 0.005 | 548.63 | 95% इथेनॉल के 9.12 मिलीलीटर | 0.025 ग्राम | स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर | ||||||
| कश्मीर + ADP | 0.5 | 501.32 | DIH 2 ओ की 3.9 मिलीलीटर | 1.0 ग्राम | स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर | ||||||
| मैलिक एसिड, पीएच 7.4 | 0.5 | 134.09 | 40 मिलीलीटर | 2.68 छ | -20 डिग्री सेल्सियस पर 200 μl aliquots और दुकान बनाओ |
| अभिकर्मक | शेयर एकाग्रता | मास जोड़ा गया | अंतिम molarity / प्रतिशत |
| (एम) | (छ या एमएल) | ||
| सुक्रोज | - | 11.98 छ | 70 मिमी |
| Mannitol | - | 20.04 छ | 220 मिमी |
| पोटेशियम फॉस्फेट अकेले आधार | - | 0.34 छ | 5 मिमी |
| 2 MgCl, hexahydrate | 1 | 2.5 मिलीलीटर | 5 मिमी |
| HEPES | 1 | 1.0 मिलीलीटर | 2 मिमी |
| EGTA | 0.1 | 5.0 मिलीलीटर | 1 मिमी |
| मूलतः फैटी एसिड फ्री- बीएसए | - | 1.0 ग्राम | 0.20% |
। तालिका 2 मास मिक्स 7.4 पीएच, 500 मिलीलीटर: अशेष 25 मिलीलीटर और दुकान -20 डिग्री सेल्सियस * नोट पर: परख इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल मास मिश्रण के लिए बीएसए को बाहर निकालें।
| सब्सट्रेट मझौले | अंतिम एकाग्रता | शेयर की राशि (μl) | मास * की राशि (एमएल) |
| पाइरूवेट / Malate | 10 मिमी / 5 मिमी | पाइरूवेट: 1,000 | 9 |
| Malate: 100 | |||
| Succicinate / Rotenone | 10 मिमी / 2 माइक्रोन | Succinate: 200 | 10 |
| Rotenone 20 | |||
| * पाइरूवेट / Malate + FCCP | 5 मिमी / 1 मिमी / 4 माइक्रोन | पाइरूवेट: 500 | 10 |
| FCCP: 4 | |||
| Malate: 20 | |||
| Palmitoyl एल carnitine / Malate | 40 माइक्रोन / 1 मिमी | Palmitoylcarnitine: 40 Malate: 20 | 10 |
| ग्लूटामेट / Malate | 10 मिमी / 10 मिमी | ग्लूटामेट: 400 | 10 |
| Malate: 200 |
तालिका 3. सब्सट्रेट समाधान 7.4 पीएच: प्रयोग के दिन ताजा बनाओ। * इलेक्ट्रॉन प्रवाह परख समाधान।
| इंजेक्शन मझौले | एकाग्रता | शेयर की राशि (μl) | <टीडी> मास की राशि (एमएल)राशि कारतूस में इंजेक्शन | अंतिम एकाग्रता | |
| (बाद थाली में इंजेक्शन) | |||||
| ADP | 50 मिमी | 300 μl | 3 | 50 μl | 5.0 मिमी |
| Oligomycin एक | 20 माइक्रोन | 10 μl | 3 | 55 μl | 2.0 माइक्रोन |
| FCCP | 40 माइक्रोन | 12 μl | 3 | 60 μl | 4.0 माइक्रोन |
| Antimycin एक | 40 माइक्रोन | 24 μl | 3 | 65 μl | 4.0 माइक्रोन |
टीयुग्मित Assays के लिए सक्षम 4. इंजेक्शन 7.4 पीएच:। प्रयोग के दिन ताजा बनाओ। * युग्मन assays शामिल हैं (लेकिन सीमित नहीं हैं) पाइरूवेट / Malate, succinate / rotenone, palmitoyl carnitine / Malate, और ग्लूटामेट / Malate।
| इंजेक्शन मझौले | एकाग्रता | शेयर की राशि (जी या उल) | मास की राशि (एमएल) | राशि कारतूस में इंजेक्शन | (बाद थाली में इंजेक्शन) अंतिम एकाग्रता |
| Rotenone | 20 माइक्रोन | 60 μl | 3 | 50 μl | 2.0 माइक्रोन |
| Succinate | 50 मिमी | 300 μl | 3 | 55 μl | 5.0 मिमी |
| Antimycin एक | 40 माइक्रोन | 24 μ; एल | 3 | 60 μl | 4.0 माइक्रोन |
| TMPD / Ascorabte | 1 मिमी, 100 मिमी | TMPD: 300 μl | 3 | 65 μl | 100 माइक्रोन, 10mm |
| एस्कोर्बेट: 0.059 ग्राम |
इलेक्ट्रॉन प्रवाह परख के लिए तालिका 5. इंजेक्शन 7.4 पीएच:। प्रयोग के दिन ताजा बनाओ
| आदेश | समय (मिनट) | चक्र का # |
| जांचना | ||
| प्रतीक्षा | 10 मिनट (प्लेट पालन कदम से गर्म करने के लिए अनुमति देने के लिए) | |
| मिश्रण | 1 मिनट | 2 |
| मुझेAsure | 2 मिनट | |
| एक इंजेक्षन | ||
| मिश्रण | 1 मिनट | 2 |
| उपाय | 2 मिनट | |
| बी इंजेक्षन | ||
| मिश्रण | 1 मिनट | 2 |
| उपाय | 2 मिनट | |
| सी इंजेक्षन | ||
| मिश्रण | 1 मिनट | 2 |
| उपाय | 2 मिनट | |
| डी इंजेक्षन | ||
| मिश्रण | 1 मिनट | 2 |
| उपाय | 2 मिनट |
6 तालिका साधन भागो प्रोटोकॉल।
Discussion
माउस कंकाल की मांसपेशी के 100 मिलीग्राम - इस लेख में प्रस्तुत तरीकों 75 से पृथक माइटोकॉन्ड्रिया का उपयोग कर microplate आधारित respirometric assays के एक संग्रह के प्रदर्शन के लिए कदम-दर-कदम निर्देश प्रदान करते हैं। तीन प्रतियों कुओं के बीच तंग मानक विचलन के सबूत के रूप ये assays उच्च परिशुद्धता के साथ किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात, इन respirometric assays के असामान्यताएं और / या रूपांतरों आमतौर पर इस्तेमाल किया पशु मॉडल में आदि, टीसीए चक्र, β ऑक्सीकरण मार्ग, सब्सट्रेट ट्रांसपोर्टरों, आदि में होने वाली हो सकती है, जहां की pinpointing अनुमति देते हैं।
यह इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त विभिन्न ईंधन और अवरोधकों का उपयोग करने के औचित्य पर प्रकाश डाला करने के लिए महत्वपूर्ण है। पाइरूवेट / Malate और ग्लूटामेट / Malate respirometric assays के परिसर मैं मध्यस्थता श्वसन के आकलन, साथ ही उनके संबंधित ट्रांसपोर्टरों के आकलन के लिए अनुमति देते हैं, और ग्लूटामेट के मामले deaminase 15 में। वैकल्पिक रूप से, का संयोजनrotenone जटिल मैं रोकता है और succinate एडिनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड पीला रंग की कमी के माध्यम से परिसर द्वितीय इलेक्ट्रॉनों प्रदान करता है के बाद से succinate / rotenone (FADH 2) 15 आदि के परिसर द्वितीय के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन प्रवाह का आकलन अनुमति देता है। ये assays युग्मन दक्षता और अधिक से अधिक श्वसन के रूप में सब्सट्रेट विशेष जानकारी प्रदान करते हैं। इलेक्ट्रॉन प्रवाह परख substrates और अवरोधकों के संयोजन माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन प्रवाह 9 के दौरान कई परिसरों के आकलन के लिए अनुमति देता है कि आप में अनूठा है। succinate द्वारा पीछा rotenone के इंजेक्शन परिसर द्वितीय द्वारा संचालित आकलन अधिक से अधिक श्वसन के लिए अनुमति देता है, जबकि पाइरूवेट / Malate + FCCP की प्रारंभिक सब्सट्रेट मिश्रण, परिसर मैं द्वारा संचालित अधिक से अधिक श्वसन के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। एस्कॉर्बेट का इंजेक्शन द्वारा पीछा Antimycin ए का इंजेक्शन, परिसर III के एक अवरोध, / TMPD एस्कोर्बेट के बाद से परिसर चतुर्थ द्वारा संचालित श्वसन के मूल्यांकन के लिए अनुमति / TMPD एक हैसाइटोक्रोम सी / जटिल चतुर्थ करने के लिए इलेक्ट्रॉन दाता। युग्मन दक्षता पर कोई जानकारी प्राप्त की है, वहीं विधि स्वतंत्र रूप से कई substrates चल रोकता है कि बहुत छोटा सा नमूना आकार के लिए आदर्श है। अंत में, palmitoyl carnitine / Malate के उपयोग β ऑक्सीकरण और पामिटिक अम्ल (β ऑक्सीकरण) के ऑक्सीकरण से उत्पादन को कम करने के लिए बराबर के बाद से आदि के बीच समन्वय के आकलन के लिए अनुमति देता है flavoprotein 15 स्थानांतरित इलेक्ट्रॉन के माध्यम से आदि में फ़ीड। यह युग्मन और इलेक्ट्रॉन प्रवाह assays के कारण भी कुछ हस्तक्षेप (नशीली दवाओं के उपचार, आनुवंशिक हेरफेर) को mitochondrial समारोह में परिवर्तन की पहचान करने के लिए मिलकर में इस्तेमाल किया जा सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए।
इन assays के लिए प्राप्त उच्च परिशुद्धता यह प्रोटीन निर्धारण करने के लिए, या सब्सट्रेट समाधान के साथ पहले है, चाहे वह माइटोकॉन्ड्रिया की पूरी तरह से मिश्रण करने के लिए मुख्य कारण है। इन पंक्तियों के साथ, माइटोकॉन्ड्रिया एक बार सब्सट्रेट समाधान में resuspendend हैएनएस, यह एक चौड़ी छिद्र विंदुक टिप के साथ 2.2 चरण में वर्णित के रूप में सेल कल्चर प्लेट लोड करने के लिए अच्छी तरह से पहले इस समाधान का मिश्रण करने के लिए महत्वपूर्ण है। माइटोकॉन्ड्रिया मिश्रण करने में विफलता को अच्छी तरह से परख के भीतर बड़े बदलाव के लिए नेतृत्व करेंगे। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रिया मिश्रण और जब तक बाल काटना बलों पैदा करेगा एक संकीर्ण छिद्र विंदुक टिप का उपयोग पालन कदम (2.7) भी इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली और साइटोक्रोम सी की रिहाई को नुकसान करने की क्षमता बढ़ जाती है। लंबे / काफी तेजी से भरी हुई सेल कल्चर प्लेट स्पिन करने में विफलता इस प्रकार कुओं और माप के बीच वृद्धि की परिवर्तनशीलता अग्रणी है, अच्छी तरह से करने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया की अधूरी पालन में परिणाम होगा।
शेयर और सब्सट्रेट समाधान बनाने के लिए सही सांद्रता / तैयारी तरीकों का उपयोग कर, अच्छी तरह से प्रति माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की एक अधिकतम राशि लोड हो रहा है, परख रन फेरबदल माइटोकॉन्ड्रियल राज्य पीएलए सुनिश्चित करने के लिए: वर्णित प्रोटोकॉल शामिल करने के लिए अनुकूलित किया गया हैteaus, और mitochondrial शेयर और माइटोकॉन्ड्रियल / सब्सट्रेट घोला जा सकता है की उचित मिश्रण। इन अनुकूलन के प्रयासों से पहले, लेखकों परख समय में नुकसान का सामना करना पड़ा। निम्न समस्या निवारण विधियों / इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन में मददगार थे कि संशोधनों पर चर्चा। Microchamber के भीतर ऑक्सीजन निकास और गलत माप को बढ़ावा मिलेगा बहुत ज्यादा माइटोकॉन्ड्रिया लोड करने के दौरान इष्टतम लोड करने के लिए सम्मान के साथ, लोडिंग बहुत कम माइटोकॉन्ड्रिया, एक मजबूत प्रतिक्रिया नहीं देंगे। रोजर्स एट अल 9 microplate आधारित respirometric assays के लिए अच्छी तरह से प्रति माइटोकॉन्ड्रिया का इष्टतम लोड हो रहा है मात्रा का निर्धारण करने के उदाहरण प्रदान करता है। अधिक से अधिक बार बहुत ज्यादा माइटोकॉन्ड्रिया प्रति लोड और साथ ही राज्य से सबूत के 2 दरों 100-200 pmol / मिनट से अधिक / अच्छी तरह से और राज्य 3 दरों> 1500 pmol / मिनट / अच्छी तरह से किया जाता है। (। - 10 माइक्रोग्राम जैसे, 1 के बीच) गतिशील आर भीतर OCRs बटोर ओवर लोडिंग होती है, यदि माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की एकाग्रता के साथ अलग एक प्रयोगऑक्सीजन की खपत माप मशीन की Ange। तैयारी और substrates और शेयरों की सही सांद्रता का उपयोग अत्यंत महत्व का है। हमेशा substrates / इंजेक्शन के एसिड फार्म का उपयोग करें और पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड या एचसीएल के साथ पीएच को समायोजित; सोडियम बफ़र्स / समाधान की सिफारिश नहीं कर रहे हैं। इसके अलावा, resuspending substrates / DMSO या 100% इथेनॉल में शेयरों माप विफलता या त्रुटि का परिणाम देगा। का उल्लेख किया है, जहां 95% इथेनॉल का उपयोग सुनिश्चित करें। यह palmitoyl carnitine इस प्रकार बड़े परिवर्तनशीलता के कारण जमे हुए शेयर विगलन के बाद 95% इथेनॉल से बाहर वेग के लिए आम बात है। उपयोग करने के लिए अच्छी तरह से पूर्व palmitoyl carnitine शेयर और भंवर गर्म करने के लिए सुनिश्चित करें। इसके अलावा, एक उच्च चर पाइरूवेट / Malate परख परिणाम की वजह से दो सप्ताह पुराना पाइरूवेट शेयर किया जा रहा है> करने के लिए हो सकता है। पाइरूवेट के जमे हुए aliquots हर 2 सप्ताह के रीमेक के लिए सुनिश्चित करें। परख रन माइटोकॉन्ड्रियल राज्य पठारों सुनिश्चित करने के लिए 2 मिनट माप करने के लिए संशोधित किया गया था। एडीपी की थकावट के अवलोकन के वांछित है, शोधकर्ता हो सकता"परख जादूगर" मंच के तहत "प्रोटोकॉल" टैब के तहत माप समय का विस्तार। अंत में, बड़े परिवर्तनशीलता माइटोकॉन्ड्रियल शेयर और माइटोकॉन्ड्रिया प्लस सब्सट्रेट समाधान लोड करने के लिए पूरी तरह से पहले homogenized नहीं कर रहे हैं, जब होता है। कुओं के बीच परिवर्तनशीलता परख चलाने के बाद अधिक है, पूरी तरह से पहले अगले प्रयोग करने के लिए सब्सट्रेट समाधान मिश्रण करने के लिए सुनिश्चित करें। कभी माइटोकॉन्ड्रिया / सब्सट्रेट समाधान भंवर, बल्कि, मुहब्बत हलचल, और धीरे से एक चौड़ी छिद्र विंदुक टिप के साथ triturate।
ध्यान देने योग्य हैं कि इस तकनीक के कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, इन assays के लिए इस्तेमाल सेल कल्चर प्लेट पर कुओं की संख्या अपेक्षाकृत कम है (यानी।, 24 कुओं और खाली कुओं के लिए नामित कम से कम 2)। यह एक थाली पर इन assays के सभी 5 प्रदर्शन करने के लिए वांछित है, शोधकर्ता एक बार में केवल एक माउस से प्रतिक्रियाओं की जांच करने में सक्षम है। हालांकि, यह 96 के साधन highe के लिए उपलब्ध हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिएआर थ्रूपुट। दूसरे, अक्षत कोशिकाओं 1 में की तुलना में अलग-थलग पड़ माइटोकॉन्ड्रिया में mitochondrial रोग का आकलन करने में निहित शक्तियों और कमजोरियों देखते हैं। कुछ कमजोरियों बरकरार कोशिकाओं और अलगाव की प्रक्रिया से उत्प्रेरण कलाकृतियों की तुलना में कम शारीरिक प्रासंगिकता वाले शामिल हैं। अंत में, इस विधि की सफलता माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव की प्रक्रिया की गुणवत्ता पर आकस्मिक है।
इन assays के कुछ या तो विभिन्न प्रणालियों में विकसित किया गया है या अन्य पशु मॉडल में मान्य किया गया है, इस के साथ साथ प्रस्तुत तरीकों के लिए एक बहु अच्छी तरह से ऑक्सीजन की खपत माप मशीन का उपयोग माउस में इष्टतम उपयोग के लिए ऊपर उल्लिखित assays के सभी के संश्लेषण के लिए पहली बार कर रहे कंकाल की मांसपेशी। इस प्रकार कम से कम सामग्री के साथ उच्च throughput प्रदान करने, माउस कंकाल की मांसपेशी के 100 मिलीग्राम - महत्वपूर्ण बात, इन परीक्षणों की सभी 5 ~ 75 से पृथक माइटोकॉन्ड्रिया की राशि के साथ किया जा सकता है। बहुत महत्व है, बहु अच्छी तरह से की क्षमता की वजह सेऑक्सीजन की खपत प्रौद्योगिकियों एक अनुकूलित अलगाव विधि के साथ संयुक्त माइटोकॉन्ड्रिया की न्यूनतम मात्रा के साथ assays के प्रदर्शन करने के लिए, शोधकर्ता कंकाल मांसपेशियों के ऊतकों के शेष के साथ अन्य प्रयोगों (जैसे।, पश्चिमी blots की एक भीड़ प्रदर्शन करने की अनुमति देता है, आरटी पीसीआर, एंजाइमी assays, अक्सर इस पशु मॉडल के साथ एक संघर्ष है, जो आदि),।
अंत में, इस के साथ साथ प्रस्तुत तरीकों माउस कंकाल की मांसपेशी के कम से कम मात्रा में प्रयोग microplate आधारित respirometric assays के एक संग्रह के प्रदर्शन के लिए कदम-दर-कदम निर्देश प्रदान करते हैं। महत्वपूर्ण बात है, प्रस्तुत तरीकों ऊतक और माइटोकॉन्ड्रिया की न्यूनतम मात्रा में आवश्यकता होती है। में महारत हासिल करने के बाद, यहाँ बताया तकनीक शोधकर्ताओं आमतौर पर इस्तेमाल किया पशु मॉडल में माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत पर एक परिसर या जीन उत्पाद का एक संभावित तंत्र निर्धारित करने के लिए अनुमति देगा।
Disclosures
जॉर्ज डब्ल्यू रोजर्स इन assays विकसित किए गए, जिसके लिए साधन बनाती है कि कुंजी बायोसाइंस के एक कर्मचारी है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | Store at RT |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | Store at RT |
| Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0% | Sigma Aldrich | P5379 | Store at RT |
| Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0% | Sigma Aldrich | M9272 | Store at RT |
| HEPES minimum 99.5% titration | Sigma Aldrich | H3375 | Store at RT |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | Store at RT |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | Store at 4 °C |
| Acid Free- BSA | |||
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4 °C |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at RT |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at RT |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at RT |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | Store at RT |
| 99%, powder [TMPD] | |||
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20 °C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2 - 8 °C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20 °C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20 °C |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at RT |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
References
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