This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.
In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and –sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.
Herbizidresistenz in Unkraut stellt eine ernsthafte Bedrohung für die globale Produktion von Nahrungsmitteln und Faser 1,2. Derzeit Tausende von resistenten Populationen und Biotypen von über hundert Unkrautarten weltweit sind dokumentiert und untersucht 3. Ein Hauptmechanismus, Herbizid-Resistenz verleiht, in Pflanzen ist die Veränderung der Ziel Herbizid-site-Gene und Proteine, einschließlich genetischer Mutationen, herbizid Proteinbindungskinetiken oder Amplifikation der Ziel-Ort-Gen 2 beeinflussen. Metabolische Entgiftung über erhöhte Aktivitäten der Cytochrom P450 Monooxygenase (P450) oder Glutathion-S-Transferase (GST) Enzyme ist ein weiterer Mechanismus, der Herbizid-Resistenz in Unkräutern, die verschiedene in mehrfacher Hinsicht vom Ziel-Ort basierten Mechanismen 2 verleiht. Metabolic-basierten Widerstand hat erhebliche Auswirkungen auf, ob Pflanzen Fitness-Kosten (auch bekannt als Fitness-Strafen) können aus den Herbizidresistenz mechanis führenm, sowie in Bezug auf das Potential für einen einzigen Entgiftungsmechanismus zum Verleihen kreuz- oder mehreren Herbizid-Resistenz in Unkrautpopulationen 1,2,4. Allgemeiner kann Herbizid-Metabolismus in Pflanzen in drei Phasen 5 geteilt werden. Phase I beinhaltet Herbizidumwandlung oder Aktivierung wie P450 Hydroxylierung von aromatischen Ringen oder Alkylgruppen, oder N – oder O- Dealkylierungsreaktionen, was zu erhöhter Polarität und partiellen Entgiftung Herbizid 5,6. Neu eingeführten funktionellen Gruppen in Phase I können Verknüpfungsstellen für die Konjugation an reduziertem Glutathion von GSTs bereitzustellen oder durch UDP-abhängige Glycosyltransferasen in Phase II 5,7 Glucose. Beispielsweise ist die große Anfangs Metabolit Primisulfuron-methyl in Mais hydroxy-Primisulfuron-Methyl 8, die weiter metabolisiert werden können, zu Hydroxy-Primisulfuron-glucosid (Phase II) und dann in der Vakuole zur langfristigen Lagerung oder weitere metabolische transportiert Profibeitung 5,6 (Phase III).
Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) ist ein schwer zu Kontrolle, dicot Jahresunkrautarten, die die Produktion von Mais (Zea mays), Sojabohne (Glycine max) und Baumwolle (Gossypium hirsutum) in den Vereinigten Staaten behindert. Der hohe Grad der genetischen Vielfalt der waterhemp sich durch seine zweihäusig Biologie und Fernwindbestäubung ermöglicht, und eine einzelne weibliche waterhemp Pflanze kann bis zu eine Million Samen 9 zu erzeugen. Diese Samen sind klein und leicht verbreiten, was natürlich zu verleihen waterhemp mit einer effektiven Streuvorrichtung. Waterhemp zeigt kontinuierliche Keimung in der gesamten Vegetationsperiode 9, und ihre Samen sind in der Lage, nach mehreren Jahren der Ruhe keimen. Waterhemp ein C 4 Pflanze, die eine höhere Wachstumsrate als die meisten breitblättrigen Unkräutern in Ackeranbausystemen 10 besitzt. Darüber hinaus sind zahlreiche waterhemp Populationen gegen mehrere families von Herbiziden 3.
Eine Population von waterhemp (bezeichnet MCR) aus Illinois ist beständig gegen 4-Hydroxy-Dioxygenase (HPPD) inhibierende Herbizide 11, wie Mesotrion, sowie Atrazin und Acetolactatsynthase (ALS) inhibierende Herbizide, einschließlich Primisulfuron-methyl wegen Nichtziel-Website basierten Mechanismen 12,13. Eine andere Population von waterhemp bezeichnet ACR 14, die Primisulfuron-methyl-resistente (aufgrund einer Mutation in dem ALS-Gen) und Atrazin-resistente aber empfindlich gegen Mesotrion und einem waterhemp Population bezeichnet WCS 14, die Primisulfuron-methyl empfindlich ist, Mesotrion und Atrazin wurden im Vergleich zu MCR in unserer früheren Forschung 12 und aktuelle Experimente verwendet (in Tabelle 1 zusammengefasst). Erste Studien keine Veränderungen in den HPPD-Gen-Sequenz oder Expressionsniveaus oder verringert Mesotrion Aufnahme zu erfassen, in der MCR-Bevölkerung im Vergleich mit Mesotrion-empfindliche Bevölkerungsgruppen 12. Allerdings Metabolismus-Untersuchungen mit ganzen Pflanzen zeigten eine signifikant niedrigere Mutter Mesotrion Herbizid in MCR Vergleich ACR und WCS, die mit früheren phänotypische Reaktionen korreliert, um Mesotrion 11,12.
Waterhemp Bevölkerung | Abkürzung | Phänotyp zu Mesotrion | Mesotrion Resistenzmechanismus | Phänotyp Primisulfuron | Primisulfuron Resistenzmechanismus |
McLean Grafschaft-Resistant | MCR | Widerstandsfähig | Metabolism * | Widerstandsfähig | Stoffwechsel |
Adams County-Resistant | ACR | Sensitive | – | Widerstandsfähig | Ziel-Ort Mutation in ALS 14 |
Wayne County-Sensitive | WCS | Sensitive | – | Sensitive | – |
* Non-Target-Ort-Resistenzmechanismen, andere als verbessert den Stoffwechsel, können ebenfalls zu verleihen Mesotrion Widerstand in der Bevölkerung MCR 12.
Tabelle 1: Beschreibung der waterhemp Populationen aus Illinois in dieser Studie verwendet.
Neben der Bestimmung Raten von Herbizidmetabolismus in intakten waterhemp Sämlinge, wurde ein anderer experimenteller Ansatz entwickelt und in unserer früheren Forschung eingesetzt, um den Stoffwechsel, indem ein herausgeschnitten waterhemp Blatt Assay 12 sowie verschiedene P450-Inhibitoren (zB tetcyclacis und Malathion) zu untersuchen. Dieses Verfahren wurde speziell für waterhemp aus einem Previ angepaßtous Untersuchung Primisulfuron-methyl-Stoffwechsel in geschnitten Maisblätter 15, da die herausgeschnittenen Blatt Test noch nicht für die Durchführung von Herbizidstoffwechselforschung in einer dikotylen Pflanze berichtet. Die organophophosate Insektizid Malathion wurde häufig für in vivo und in vitro herbizidStoffWechselForschung, um P450 Beteiligung 16 anzugeben. Zum Beispiel, Toleranz und schnellen Metabolismus von Mesotrion bei Mais sind auf P450-katalysierte Ring Hydroxylierung, die überprüft wurde, als Malathion erhöhten Mais Empfindlichkeit auf Mesotrion 17. In ähnlicher Weise gehemmt Malathion Stoffwechsel der ALS-Hemmer Primisulfuron-methyl in geschnitten Maisblätter 15. Ein Hauptvorteil der entnommenen Blatt Technik ist, dass Daten erzeugt werden, unabhängig von Ganzpflanzen Translokation Muster, ein wichtiger Faktor in die Abwägung Metabolismus von systemischen Nachauflaufherbizide in Pflanzen. Folglich ermöglicht dieses Verfahren die quantitative undqualitative metabolischen Analysen auf einer einzigen behandelte Blatt 12 zu fokussieren.
Eine vegetative Klonierungsstrategie, in Verbindung mit dem ausgeschnittenen Blatt Protokoll wurde vorher in waterhemp verwendet, um Stoffwechselstudien 12 durchzuführen. Aufgrund der Natur der Auskreuzung waterhemp (getrennte männliche und weibliche Pflanzen) und hohes Maß an genetischer Vielfalt innerhalb zweihäusig Amaranthus Arten 9, dieses Protokoll gewährleistet, dass genetisch identische waterhemp Sämlinge wurden in den Zeitverlaufsexperimenten untersucht. Dieser Artikel beschreibt den Nutzen der herausgeschnittenen Blatt Verfahren zur Messung der Raten der Herbizidmetabolismus in einer dikotylen Unkraut (waterhemp). Die Menge der Mutter Herbizid verblieben war, zu jedem Zeitpunkt (1) durch nichtlineare Kleinste-Quadrate-Regressionsanalyse Sitz mit einer einfachen ersten Ordnung Kurve, um die Zeit für die 50% der absorbierten Herbizids zu erniedrigen Schätzung (bestimmt und wurde DT 50). RepräsentativChromatogramme von Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (RP-HPLC) für ALS-resistente und -sensitive waterhemp Populationen, die das Verschwinden der Mutter Herbizid und gleichzeitiger Bildung von polaren Metaboliten (s) während einer Zeitverlaufsstudie anzuzeigen (Abbildung angezeigten 2). Der Schwerpunkt unseres Artikels ist zu beschreiben und zeigen die Nützlichkeit des herausgeschnittenen Blatt Assay in Kombination mit einem vegetativen Klonen Methode zur Bestimmung präzise und reproduzierbare Raten von Herbizidmetabolismus in dicot Pflanzen, mit gleichmäßig Ring-markierten (URL- 14 C) Herbizide in drei waterhemp Populationen, die in ihrer Ganzpflanzenantworten zu unterscheiden HPPD- und ALS-inhibierenden Herbiziden (Tabelle 1).
Die hier beschriebene geschnitten Blatt-Verfahren wurde bereits in der Erforschung Primisulfuron Stoffwechsel in Maisblätter 15 verwendet worden, aber unsere Ergebnisse zeigen, dass dieses Protokoll ist auch wirkungsvoll, präzise und reproduzierbar zu messen Herbizidmetabolismus in einer dikotylen Unkrautarten 12. Ein Hauptvorteil der entnommenen Blatt Technik gegenüber Ganzpflanzen Studien ist, dass ein ausgeschnittener Blatt ist unabhängig von Ganzpflanzen Translokation Muster Nachauflauf, sy…
The authors have nothing to disclose.
We thank Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, and Brittany Janney for assistance with plant growth and extractions, Dr. Anatoli Lygin for assistance with chromatographic analyses, and Syngenta Crop Protection for funding.
Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | for pre-germinating seeds |
Potting medium | Sun Gro Horticulture | 49040233 | for plant growth |
Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | slow-release fertilizer |
Growth chamber E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plant culturing |
Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer for excised leaves |
HCl (concentrated) | Fisher Scientific | A144500 | adjust pH of buffer |
Murashige and Skoog (MS) salts | Sigma-Aldrich | M0404 | incubation of excised leaves |
Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | leaf washes after incubation |
Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | plant extractions |
Acetonitrile (HPLC grade) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobile phase |
Formic acid | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | acidify mobile phase pH |
Micro-centrifuge | Eppendorf | 5417R | 1.5 or 2.0 mL tubes |
Centrifuge (temperature controlled) | Eppendorf | 5810R | 15 or 50 mL tubes |
Polypropylene centrifuge tube | Corning Inc. | 430790 | 15 mL, sterile |
Rotary evaporator | BÜCHI | R200 | concentrate plant samples |
Liquid scintillation spectrometry (LSS) | Packard Instruments | 104470 | quantify 14C |
High-performance liquid chromatography | Perkin Elmer | N2910401 | resolve herbicide metabolites |
Flow scintillation analyzer | LabLogic System | 1103303 | for HPLC analysis of 14C |
Hypersil Gold C18 column | Thermo-Scientific | 03-050-522 | reversed phase |
Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | for Flow-scintillation analyzer |
Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | for LSS; biodegradable |
Laboratory homogenizer | Kinematica | CH-6010 | homogenize leaf samples |