Introduction
感染症の治療の選択肢は、抗生物質1の広い範囲に影響されない多剤耐性菌の急速な増加によって複雑にされています。耐性細菌媒介性感染症からの高い罹患率および死亡率と、薬物開発プロセスをエスカレートおよび/または治療選択肢を改善するための優れた抗菌選択肢を探索する必要があります。最近では、抗病原性のアプローチは、したがって耐性機構2のリスクを軽減する、非殺菌方法を介して病原性を防止する上で、その潜在的な特定の関心を集めています。
クオラムセンシングは、このシグナリング現象の細菌の病原性と混乱の「マスタースイッチが「病因3に対する有望な抗病原性の方法です。重要な細菌の人口密度に達した後毒性の発症は細胞外環境における定足数の分子の蓄積が必要です。現状として、ラム酒の分子は、その同族受容体との結合は病原性因子だけでなく、抗生物質耐性およびバイオフィルム形成を4に関連する遺伝子の活性化につながる、細胞内マトリックスに戻って拡散します。一般的には、クオラムセンシング破壊が主要代謝経路に影響を与えることなく、定足数分子と受容体の相互作用を阻害することを含みます。したがって、細胞の成長に直接的な意味合いを持っていません。適応度が損なわれないので、進化し、そのような治療5に対する耐性を得るために、細菌のための最小限の選択圧があります。また、クオラムセンシングの破壊は、抗細菌剤からの保護を提供し、免疫応答をホストしてバイオフィルム形成の場合のように、固有の細菌の防御機構を妨害することができます。
それは、地球上の微生物の99％は目の中に生きた微生物に重要な生存の利点を付与する、複雑なバイオフィルムのようなマトリックス中に存在することが推定されていますESEの構造6。さらに重要なことは、これらの固着ドメインの形成は、最も永続的なおよび慢性院内感染7の原因である。 アシネトバクターバウマニは、グローバルな院内感染に関連付けられており、その毒性が大きくクオラムセンシングに起因する主要なヒト病原体の一つであります媒介バイオフィルム形成8。クォーラム消光酵素は、グラム陰性菌9によって生成されたN -アシルホモセリンラクトン（AHLs）として知られている化合物群をターゲットにして、クォーラムが介在するシグナル伝達を妨害するで正常に使用されています。いくつかの研究はまた、バイオフィルム10,11における毒性因子の発現および細胞数の削減による細菌の病原性を遮断するために、これらの酵素の使用に拡大しています。残念ながら、細菌性病原体によるバイオフィルム形成に対する定足数消光酵素の有効利用の触知可能なデモの欠如が残っています。ザ・再A.を破壊し 、定足数阻害剤（AHL類似体）、代わりの定足数消光酵素を使用する試みてきましたバウマニバイオフィルム形成12。小分子阻害剤を使用して、この方法が有効なアプローチであるが、翻訳の用途におけるその生物学的利用能を維持することが課題であることができます。酵素は治療効果のための生物医学装置の表面上に固定化に対してより敏感に反応するように逆に、触媒定足数消光酵素の使用は、生物学的利用能の問題を回避することができます。
ここでは、クリスタルバイオレット染色および共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）を用いて、細菌のバイオフィルム形成に13（GKL） ゲオバチルスのkaustophilusから操作さクオラムクエンチングラクトナーゼの効果の評価を説明します。この研究は、臨床的に関連するAのバイオフィルム破壊の最初に成功した実証であります定足数消光酵素を用いバウマニ S1株。方法が記載さこの研究において、病原性グラム陰性菌に対する後続の治療の開発努力の他のクオラムクエンチング酵素の有効性を評価するために有用です。
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Protocol
Aのバイオフィルム形成の1クリスタルバイオレット定量バウマニ S1
- A. 5mlの文化を育て振盪インキュベーター（220 rpm）し、30℃でのLB培地（LB）（トリプトンを10g / L、酵母エキス5グラム/ L）でバウマニ S1 16時間。
- A.の文化を調整バウマニ S1 0.8の所望のOD 600まで。 96ウェルプレートを使用して、細菌培養物接種：精製GKL酵素（40 mg / mlで）の10μLを含有する新鮮なLBに（1 100希釈）。新しい文化の最終容量は100μlです。
- 同様に対照培養物を準備し;これは、任意の酵素が含まれません。複製の所望の数を得るために同様の条件を繰り返します。
- 蓋付きプレートを覆い、密封された10リットルのプラスチック容器に入れてください。優しくメディアを削除する前に、3時間、30℃でプレートをインキュベートします。
- 新鮮なLB培地の別の100μlをウェルに加え、30℃で21時間静置します。 インキュベーションの第二の期間の後、静かにすべてのメディアを削除します。 200μlの滅菌水でプランクトン細菌細胞を洗浄します。洗浄中の細胞にのみ最小限の乱れがあることを確認します。
- 各ウェルに1％クリスタルバイオレット溶液100μlを加え、室温で15分間インキュベートします。 200μlの滅菌水でよく洗浄することにより、クリスタルバイオレット溶液を除去します。さらに2回の洗浄を繰り返します。
- 各ウェルに33％酢酸を100μl加え、穏やかに振盪しながら15分間インキュベートします。これは、色素を溶解します。
- 600nmにおけるクリスタルバイオレットの吸光度を測定することによって形成されたバイオフィルムの量を定量します。クリスタルバイオレットの量は、形成されたバイオフィルムの量に比例します。
A. 2.共焦点レーザー走査顕微鏡バウマニ S1バイオフィルム
- A. 5mlの文化を育て16時間振とう培養（220 rpm）し、30℃でのLBでバウマニ S1。
- 広告A.だけの文化バウマニ S1 0.8の所望のOD 600まで。 35mmのガラス底のμ-皿を使用して、細菌培養の接種：精製されたGKL酵素（40 mg / mlの）の30μLを含む新鮮なLBに（1 100希釈）;新しい文化の最終容量を1 mlです。
- 蓋付きのμ-皿を覆い、密封された10リットルのプラスチック容器に入れてください。優しくメディアを削除する前に、3時間30℃でμ-皿をインキュベートします。 1ミリリットルの全容量にそれをもたらし、精製GKL酵素と新鮮な培地30μlのを追加します。 30℃でさらに21時間インキュベートします。
- 繰り返しステップ2.3および30℃でさらに24時間μ-皿をインキュベートします。そして、そっとメディアを削除します。
- μ-皿にハンクス平衡塩溶液（HBSS）中に溶解し5μg/ mlのアレックスのFluo 488結合小麦胚芽凝集素（WGA）の500μLを加え、37℃で30分間インキュベートし;これは、形成されたバイオフィルムを染色します。 T染色溶液を除去し、洗浄彼はHBSS 2mlで皿をμ。洗浄ステップをもう一度繰り返します。
- HBSSに溶解した3.7％ホルムアルデヒド500μlのを追加し、37℃で30分間インキュベートし;これは、μ-皿にバイオフィルムを修正します。 HBSS 2mlで一度μ-皿を洗い、その後、完全に溶液を除去。 μ皿バイオフィルムで固定前CLSM画像に4℃で暗所に保存することができます。
- CLSMイメージングおよび分析のために、スタックあたり0.21ミクロンの間隔で画像あたり97スタックを生成するために、63倍の倍率を使用しています。
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Representative Results
クリスタルバイオレット定量実験では、2つの定足数消光酵素がバイオフィルム形成を破壊で実行可能性を実証するために使用した：野生型GKLおよび改善GKL二重変異（E101G / R230C）。両酵素は、3-ヒドロキシデカノイル- L -ホモセリンラクトン（3-OH-C 10 -HSL）、A.で使用される主要な定足数分子に対するラクトナーゼ活性を示すことが示されていますバウマニ S1 14。バイオフィルム破壊の有効な評価のために、（以前AHLリガンドを封鎖しないように示す）には、それぞれの触媒的に不活性な酵素も即時コントロール（GKLのD266N変異体とGKL E101G / R230C / D266N変異体）として含めました。野生型A.を使用するだけでなくバウマニ S1、変異体Δ アバイ株 （AHL合成酵素欠損）のバイオフィルム形成能も試験しました。定足数消光酵素、野生型GKLとGKL E101G / R230C変異体の両方が大幅に前にバイオフィルム形成を削減することができました治療A.バウマニ S1培養（N = 10; 0.0001≤p値）（ 図1）。それにもかかわらず、両方の酵素のためのバイオフィルム破壊の程度は、3-OH-C 10 -HSLに対するその有効性に比例しません。 GKL E101G / R230C変異体の代謝回転速度 （k catは ）3-OH-C 10 -HSL 14に対して野生型GKL 6倍高速です。しかし、酵素間のバイオフィルム破壊の程度の差は2つだけの倍です。
図1. A.バウマニ バイオフィルム破壊アッセイバイオフィルム形成は、クリスタルバイオレット染色によって測定しました。赤色の列は、野生型A.により形成されたバイオフィルムの量を表します定足数消光ラクトナーゼを添加しないバウマニとΔ アバイ変異体、。ブルーの列は、AMOを表します野生型A.によって形成されたバイオフィルムのUNT四つの異なるGKL酵素の存在下でバウマニ ：非アクティブGKLのD266N変異体、野生型GKL、非アクティブGKL E101G / R230C / D266N変異体とGKL E101G / R230C変異体。 ****、P≤0.0001の値。 抗菌剤と化学療法 58、1802年から1805年（2014年）からの許可を得て転載。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Aの共焦点イメージングバウマニ S1のバイオフィルム形成は、これらの無茎性ドメインの構造形態に対するクオラムクエンチング効果の定性的および定量的測定を提供するために使用されました。改善されたGKL E101G / R230C変異体とその触媒的に不活性酵素は比較のために使用しました。差分画像のコントラスト（DIC）画像は、改良GKL E101G / R230C変異体を用いた治療は、バイオフィルムのサイズ（FIGURが減少したことを示しましたE 2）。蛍光画像の分析は、表面積の減少、バイオマスおよび改善GKL E101G / R230C変異体（ 表1）で処理したバイオフィルムの平均厚さがあったことを明らかにしました。
図 A. 2.代表的な共焦点レーザー走査顕微鏡像 バウマニ バイオフィルム 。A.バウマニバイオフィルムは、非アクティブGKL E101G / R230C / D266N変異体（A）と GKL E101G / R230C変異体（B）で処理し、アレクサで染色しました フルーア488結合WGA。バイオフィルムのDIC画像（左）とバイオフィルムの蛍光画像（右）は、代表XY（中央）、YZ（右）、およびXZ（下）のセクションのために示されています。 抗菌薬および化学療法からの許可を得て複製し<強い> 58、1802年から1805年（2014年）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| SDのA値± | |||
| 特徴 | 処置なし | 不活性変異体を用いた治療 | E101G / R230C変異体を用いた治療 |
| バイオマス（μmの3個/μm2） | 2.57±1.65 | 3.39±1.33 | 1.37 **±0.20 |
| 平均厚さ（μm） | 3.68±2.51 | 3.41±1.31 | 1.21 **±0.21 |
| 表面積（μm）と | 235,920.59±79,456.46 | 209,872.6±115,094.7 | 115,354.9 *±7,630.3 |
| N = 10画像スタック。 **、P≤0.001; *、P≤0.05、非アクティブE101G / R230C / D266N変異体を用いた治療と比較しました。 | |||
表1. A.バウマニ バイオフィルム構造の定量。
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Discussion
実験の両方のセットは、A.バウマンニ S1は、高い塩濃度とのNaClなしLB培地で培養したバクテリア15によって形成されたバイオフィルムの量を減少させることができます。このようなアーティファクトの存在は、バイオフィルム形成量、ならびに異なる処理条件全体の定足数消光酵素の影響を過小評価する可能性があります。触媒的に不活性な酵素の使用は、酵素隔離の影響の可能性を排除するために、陰性対照として重要である。非アクティブな酵素が定足数分子を隔離する場合でも、 図1に示す図 、バイオフィルム形成が中断されていません。
A.バウマンニ S1は、96ウェルプレートのウェルに空気と液体の界面との間の微妙なリング状のバイオフィルム構造を形成します。したがって、それは、細菌バイオフィルムの偶発的除去を防止するために、メディアの取り外しおよび洗浄工程の間に過剰な撹拌を避けるために重要です。 LB培地は、各インキュベーション後に削除されました浮遊細胞を除去します。加えて、96ウェルプレートを、空気流中の摂動を最小にし、バイオフィルムの形成を促進する微小嫌気環境を作成するために、10 Lのプラスチック容器に入れました。 96ウェルプレートでのバイオフィルムの定量もまた各ウェルに添加し、クリスタルバイオレットの量に依存します。過剰のクリスタルバイオレットをウェルに添加した場合では、洗浄工程の数を増加させることができます。クリスタルバイオレット染色実験は、バイオフィルムの混乱で定足数消光効率の相対的な比較を提供します。クリスタルバイオレット染色はバイオフィルム形成を測定するための定量的であるが、唯一のクオラムクエンチング酵素の触媒効率の点で半定量的です。正確な統計的比較のために、十分なサンプルサイズは、異なる治療群のために重要です。外れ値はまた、結果の不実表示を防ぐために削除する必要があります。
細菌性バイオフィルムの共焦点イメージングと分析がUSEFです定足数消光酵素の定性的な効果を評価するためのULツール。ユーザは、（アクティブまたは非アクティブ）を投与クオラムクエンチング酵素の種類を認識している場合は、分析のためにバイオフィルムを選択するプロセスは、バイアスのための潜在的なチャネルとすることができます。偏りの可能性を回避するために、実験は、ユーザからの酵素の情報を除外したり、選択のためにランダムな方法を使用するように設計することができます。公平な選択戦略もCLSMによりバイオフィルムの形態のよりよい定量的な比較を可能にします。それにもかかわらず、これは、細菌のバイオフィルムに定足数消光酵素の結果を評価するための方法を記載した最初の研究です。クリスタルバイオレット染色は、バイオフィルム破壊におけるクオラムクエンチングの酵素の有用性を実証した酵素「 改良剤のoperandorumは細胞数と毒性因子の発現を低下させるに限定されるものではないことを明らかにしました。一方、CLSM分析によって決定し、形態学的変化も可能moleculへの洞察を提供することができこれらの酵素のARターゲット。現在の実験は、細菌のバイオフィルムに対する酵素前処理の効果を調査するために設計されたが、このプロトコルは、細菌の成長後に酵素を添加することにより、予め形成されたバイオフィルムに対する酵素の効果を評価するために、または血清を使用することによって、生理的条件下でその能力を調べるために修飾することができます培養のための条件様。 GKL酵素を研究するために使用されるプロトコルは、バイオフィルムの混乱でそれらの関係を調査するために、他の定足数急冷酵素および病原体に拡張することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast Extract | BD | 212750 | |
| 96-well plate | Costar | 3596 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| Acetic Acid | Lab-Scan | PLA00654X | Caution: Flammable |
| μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Alex Fluo 488-conjugated WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 141475095 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Caution: Corrosive |
| Synergy HT Microplate Reader | BioTek | ||
| 1X-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus |
References
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