Summary

Anti-virulent Brudd Patogene Biofilm hjelp Engineered Quorum lukk Lactonases

Published: January 01, 2016
doi:

Summary

Quorum-quenching enzymes are anti-virulent and anti-bacterial options that can mitigate pathogenesis without risk of incurring resistance, by preventing the expression of virulence factors and genes associated with antibiotic resistance and biofilm formation. In this study, we report a method that demonstrates the efficacy of quorum-quenching enzymes in bacterial biofilm disruption.

Abstract

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The persistence of bacterial infection is often associated with quorum-sensing-mediated biofilm formation. Thus, the disruption of this signaling circuit presents an attractive anti-virulence strategy. Quorum-quenching lactonases have been reported to be effective disrupters of quorum-sensing circuits. However, there have been very few reports of the effective use of these enzymes in disrupting bacterial biofilm formation. This protocol describes a method to disrupt biofilm formation in a clinically relevant A. baumannii S1 strain through the use of an engineered quorum-quenching lactonase. Acinetobacter baumannii is a major human pathogen implicated in serious hospital-acquired infections globally and its virulence is attributed predominantly to its biofilm’s tenacity. The engineered lactonase treatment achieved significant A. baumannii S1 biofilm reduction. This study also showed the possibility of using engineered quorum-quenching enzymes in future treatment of biofilm-mediated bacterial diseases. Lastly, the method may be used to evaluate the competency of promising quorum-quenching enzymes.

Introduction

Behandling for smittsomme sykdommer har vært komplisert av den raske økningen i multiresistente bakterier som er immune mot et bredt utvalg av antibiotika 1. Med høy sykelighet og dødelighet fra resistente bakterier-mediert infeksjoner, er det behov for å trappe opp stoffet utviklingsprosesser og / eller utforske bedre anti-bakterielle alternativer for å bedre behandlingsalternativer. I det siste, er det anti-virulens tilnærming økende interesse gitt sitt potensial i å forebygge virulens via non bakteriedrepende metoder, derav dempe risikoen for resistensmekanismer 2.

Quorum-sensing er en "hovedbryter" i bakteriell virulens og forstyrrelse av dette signale fenomenet er en lovende anti-virulens metode mot patogenesen tre. Utbruddet av virulens krever opphopning av beslutningsdyktighet molekyler i den ekstracellulære miljøet etter en kritisk bakteriell befolkningstetthet er nådd. Som quorum molekylene diffunderer inn i intracellulær matriks, binding med deres beslektede reseptorer fører til aktivering av virulensfaktorer, så vel som gener som er assosiert med resistens og biofilmdannelse 4. Generelt quorum-sensing avbrudd innebærer hemme quorum molekyl og reseptorinteraksjon uten å påvirke primær stoffskifte. Derfor betyr det ikke har noen direkte implikasjon på cellevekst. Siden fitness ikke blir redusert, det er minimal seleksjonspress for bakterier å utvikle seg og få motstand mot slike behandlinger 5. I tillegg kan quorum-sensing avbrudd forstyrre iboende bakterielle beskyttende mekanismer, som i tilfelle av biofilmdannelse, som gir beskyttelse mot antibakterielle midler og vertsimmunresponser.

Det er anslått at 99% av mikrober på jorden eksisterer i komplekse biofilm-lignende matriser, overdragelse avgjørende overlevelses fordeler til de mikroorganismer som lever innenfor thESE strukturer 6. Enda viktigere, er dannelsen av disse fastsittende domener årsaken mest vedvarende og kroniske sykehusinfeksjoner 7. Acinetobacter baumannii er en av de store menneskelige patogener som er knyttet til globale sykehusinfeksjoner og dens virulens er i stor grad tilskrives quorum-sensing -mediert biofilmdannelse 8. Quorum lukk enzymer har blitt brukt med hell i forstyrre quorum-mediert signaloverføring ved å målrette en gruppe forbindelser som kalles N-acyl homoserin laktonene (Ahls) som er produsert av Gram-negative bakterier 9. Flere studier har også utvidet ved anvendelse av disse enzymer for å blokkere bakteriell patogenesen gjennom reduksjon av virulens faktor ekspresjon og celletall i biofilmer 10,11. Dessverre, er det fortsatt en mangel på følbar demonstrasjon av en effektiv bruk av quorumsprinsipper lukkende enzymer mot biofilmdannelse av bakterielle patogener. Dere har vært forsøk på å bruke beslutningsdyktighet hemmere (AHL analoger), i stedet for beslutningsdyktighet lukk enzymer, for å forstyrre A. baumannii biofilmdannelse 12. Selv om denne fremgangsmåte for anvendelse av små molekyler inhibitorer er en gyldig tilnærming, kan opprettholde dens biotilgjengelighet i translasjonelle anvendelser være en utfordring. Tvert imot, kan bruken av katalytiske quorumsprinsipper lukkende enzymer omgå problemet biotilgjengelighet som enzymer er mer mottagelig mot immobilisering på overflatene av biomedisinske innretninger for terapeutiske effekter.

Her beskriver vi en vurdering av effektene av konstruerte beslutningsdyktighet lukk lactonases fra Geobacillus kaustophilus (GKL) 13 på bakteriell biofilmdannelse, ved hjelp av krystallfiolett farging og konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM). Denne studien er den første vellykkede demonstrasjon av biofilm avbrudd i en klinisk relevant A. baumannii S1 belastning ved hjelp beslutningsdyktighet lukk enzymer. Metodene som beskrivesi denne studien er nyttige for å vurdere effekten av andre beslutningsdyktighet lukk enzymer i senere terapeutiske utviklingsarbeid mot patogene Gram-negative bakterier.

Protocol

1. Crystal Violet Kvantifisering av biofilmdannelse i A. baumannii S1 Dyrk en 5 ml kultur av A. baumannii S1 i lysogeni buljong (LB) (trypton 10 g / l, gjærekstrakt 5 g / l) ved 30 ° C i en rysteinkubator (220 opm) i 16 timer. Juster kultur A. baumannii S1 til en ønsket OD 600 på 0,8. Ved hjelp av en 96-brønns plate, inokulere bakteriekultur (1: 100 fortynning) i friskt LB inneholdende 10 ul renset GKL enzym (40 mg / ml); den nye kulturen endelige volum er …

Representative Results

I krystallfiolett kvantifisering eksperiment ble to beslutningsdyktighet lukk enzymer som brukes til å demonstrere gjennomførbarheten i forstyrre biofilmdannelse: villtype GKL og en forbedret GKL dobbel mutant (E101G / R230C). Begge enzymer er blitt vist å demonstrere lactonase aktivitet mot tre-hydroksy-dekanoyl-L-homoserin-lakton (3-OH-C 10 -HSL), som utgjør hovedbeslutningsdyktig molekylet brukt av A. baumannii S1 14. For gyldig vurdering av biofilm …

Discussion

I begge sett av forsøk, A. baumannii S1 ble dyrket i LB-medium uten NaCl som en høykonsentrert salt kan redusere mengden av biofilm som dannes av bakterier 15. Tilstedeværelsen av en slik gjenstand kan under mengden av biofilm er dannet, så vel som effektene av quorumsprinsipper lukkende enzymer på tvers av forskjellige behandlingsforhold. Anvendelsen av et katalytisk inaktivt enzym som er viktig som en negativ kontroll for å eliminere mulige effekter av enzymbinding. Figur 1 v…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by grants from the Academic Research Fund of the Ministry of Education, and the National Medical Research Council and the National Research Foundation, Singapore.

Materials

Tryptone  BD 211705
Yeast Extract BD 212750
96-well plate Costar 3596
Crystal Violet Sigma-Aldrich C6158
Acetic Acid Lab-Scan PLA00654X Caution: Flammable
μ-Dish Ibidi 80136
Alex Fluo 488-conjugated WGA Invitrogen W11261
Hank’s balanced salt solution  Invitrogen 141475095
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Caution: Corrosive 
Synergy HT Microplate Reader BioTek
1X-81 Inverted Fluorescence Microscope Olympus

References

  1. Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era?. Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).
  2. Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. The biology and future prospects of antivirulence therapies. Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).
  3. LaSarre, B., Federle, M. J. Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).
  4. Waters, C. M., Bassler, B. L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
  5. Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature reviews. Drug discovery. 9, 117-128 (2010).
  6. Lazar, V. Quorum sensing in biofilms–how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power?. Anaerobe. 17, 280-285 (2011).
  7. Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  8. Perez, F., et al. Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3471-3484 (2007).
  9. Tay, S. B., Yew, W. S. Development of quorum-based anti-virulence therapeutics targeting Gram-negative bacterial pathogens. International journal of molecular sciences. 14, 16570-16599 (2013).
  10. Igarashi, J., Suga, H., Rumbaugh, K. P. Ch. 19. Quorum Sensing. 692, 265-274 (2011).
  11. Ng, F. S., Wright, D. M., Seah, S. Y. Characterization of a phosphotriesterase-like lactonase from Sulfolobus solfataricus and its immobilization for disruption of quorum sensing. Applied and environmental microbiology. 77, 1181-1186 (2011).
  12. Stacy, D. M., Welsh, M. A., Rather, P. N., Blackwell, H. E. Attenuation of quorum sensing in the pathogen Acinetobacter baumannii using non-native N-Acyl homoserine lactones. ACS chemical biology. 7, 1719-1728 (2012).
  13. Chow, J. Y., et al. Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily. The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).
  14. Chow, J. Y., Yang, Y., Tay, S. B., Chua, K. L., Yew, W. S. Disruption of biofilm formation by the human pathogen Acinetobacter baumannii using engineered quorum-quenching lactonases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 1802-1805 (2014).
  15. Pour, N. K., et al. Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters. FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).

Play Video

Cite This Article
Tay, S. B., Chow, J. Y., Go, M. K., Yew, W. S. Anti-virulent Disruption of Pathogenic Biofilms using Engineered Quorum-quenching Lactonases. J. Vis. Exp. (107), e53243, doi:10.3791/53243 (2016).

View Video