Introduction
Bulaşıcı hastalıklar için tedavi seçenekleri, antibiyotik ilaçlar 1 bir geniş bağışıklık çok ilaca dayanıklı bakterilerin hızlı artışın daha karmaşık bir. Dirençli bakteri kaynaklı enfeksiyonlardan yüksek morbidite ve mortalite oranları ile, ilaç geliştirme süreçlerini yükselmek ve / veya tedavi seçenekleri geliştirmek için daha iyi anti-bakteriyel alternatifleri keşfetmek için bir ihtiyaç vardır. Son zamanlarda, anti-virülans yaklaşımı dolayısıyla direnç mekanizmaları 2 risklerini azaltmaya olmayan bakteri yöntemlerle virülansını önlemede potansiyeli verilen faiz kazanıyor.
Nisabı algılamalı bakteriyel virülans ve bu sinyal olgusunun bozulması bir 'ana şalteri' patogenezinde 3 karşı vadeden bir anti-virülans yöntemdir olduğunu. Kritik bakteriyel nüfus yoğunluğu ulaşıldıktan sonra virülansına başlangıcı dışı ortamda nisabı moleküllerin birikimini gerektirir. As quoROM molekülleri, komşu reseptörlerine bağlanma hastalık oluşturma faktörlerinin aktivasyonu gibi antibiyotik direnci ve biyofilm 4 ile ilişkili genlerin yol açar, hücre içi matris geri yayılır. Genel, nisap algılama bozulması Birincil metabolik etkilemeden nisabı molekülü ve reseptör etkileşimi inhibe içerir. Bu nedenle, hücre büyümesi üzerinde doğrudan bir ima yoktur. Fitness tehlikeye olmadığından, gelişmeye ve bu tür tedaviler 5 karşı direnç kazanmak için bakteriler için en az seçim baskı var. Buna ek olarak, çekirdek-algılama bozulması, anti-bakteriyel maddeler karşı koruma sağlar ve immün yanıtları ana biyofilm, olduğu gibi, doğal bakteri koruyucu mekanizmaların engelleyebilir.
Bu Dünya'da mikropların% 99 th içinde yaşayan mikroorganizmalar için çok önemli hayatta kalma avantajı kazandıran, karmaşık biyofilm gibi matrisler var olduğu tahmin edilmektedirese yapılar 6. Daha da önemlisi, bu sesil etki oluşumu en kalıcı ve kronik hastane kökenli enfeksiyonların 7 nedenidir. Acinetobacter baumannii küresel hastane kökenli enfeksiyonlarla ilişkilidir ve virülans büyük ölçüde yeterli çoğunluk algılama atfedilir Belli başlı insan patojenleri biridir aracılı biyofilm oluşumu 8. Çekirdek giderici enzimler, Gram-negatif bakterilerin 9 tarafından üretilen N -asil homoserin laktonlar (AHL'ler) olarak bilinen bir bileşikler grubu hedef, çekirdek-kaynaklı sinyal transdüksiyonunun bozulması başarıyla kullanılmıştır. Çeşitli çalışmalar da biyofilm 10,11 virülans faktörü ekspresyonu ve hücre sayılarının azaltılması yoluyla bakteriyel hastalık oluşumunun engellemek için bu enzimlerin kullanımına bağlı genişletmiştir. Ne yazık ki, bakteriyel patojenler tarafından biyofilm oluşumuna karşı nisabı-söndürme enzimlerin etkin kullanımı palpabl gösteri eksikliği kalır.Yeniden A. bozmaya, nisap inhibitörleri (AHL analogları), yerine nisabı giderici enzimler kullanmayı girişimleri olmuştur baumannii biyofilm oluşumu 12. Küçük moleküller inhibitörleri kullanılarak bu yöntem, geçerli bir yaklaşım olsa da, translasyon kullanımlarda, bio-mevcudiyetini sürdürülmesi zor olabilir. Enzimler terapötik etkileri için biyomedikal cihazların yüzeylerine immobilizasyon doğru daha uygundurlar Aksine, katalitik çekirdek giderici enzimlerin kullanılması biyolojik sorunu aşmak olabilir.
Burada, kristal viyole boyama ve konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanarak, Geobacillus kaustophilus (GKL) bakteriyel biyofilm oluşumu üzerinde 13'ten mühendislik nisap-söndürme lactonases etkilerinin bir değerlendirmesini açıklar. Bu çalışma klinik olarak anlamlı A. biyofilm bozulması ilk başarılı gösteri nisap giderici enzimler kullanılarak baumannii S1 süzün. Yöntem tarifBu çalışmada, patojenik Gram-negatif bakterilere karşı sonraki terapötik geliştirme çabaları diğer çekirdek giderici enzimlerin etkinliğini değerlendirmek için yararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
A. Biyofilm Oluşumunun 1. Kristal Violet Kantifikasyonu baumannii S1
- A. 5 ml'lik bir kültür büyütün lizojeni suyu içinde baumannii S1 (LB) 16 saat süre ile bir çalkalama inkübatöründe (220 rpm) 30 ° C'de (tripton 10 g / L, bira mayası özütü 5 g / L).
- A. kültürünü ayarlayın istenen OD 0.8 600 baumannii S1. Bir 96-yuvalı plaka kullanarak, bakteri kültürünün aşılanması: saflaştırılmıştır GKL enzim (40 mg / ml) 10 ul ihtiva eden taze LB (1 100 seyreltme); Yeni kültürün nihai hacim 100 ul olduğunu.
- Hem de bir kontrol kültürü hazırlayın; Bu herhangi bir enzim içermez. Çoğaltır istenen sayıda elde etmek için benzer koşullar tekrarlayın.
- Bir kapak ile plaka örtün ve sızdırmaz şekilde kapalı bir 10 litrelik plastik bir kap içine koyun. Ortamı yavaşça çıkarmadan önce 3 saat süre ile 30 ° C 'de plaka inkübe edin.
- Oyuk taze LB ortamı bir 100 ul ilave edin ve 30 ° C'de 21 saat boyunca inkübe plaka. Inkübasyon ikinci döneminden sonra, yavaşça tüm ortamı çıkarın. 200 ul steril su ile planktonik bakteri hücresini yıkayın. Yıkama sırasında hücrelere sadece minimal rahatsızlık olduğundan emin olun.
- Her çukuruna% 1 kristal viyole çözeltisi 100 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. 200 ul steril su ile kuyusunu yıkayarak kristal viyole çözüm çıkarın. Iki kez yıkama tekrarlayın.
- Her çukuruna% 33 asetik asit, 100 ul eklenir ve yavaşça çalkalanarak 15 dakika boyunca inkübe edilir; Bu boya eriyecektir.
- 600 nm 'de kristal viyole absorbansı ölçülerek oluşan biyofilm miktarının belirlenmesi. Kristal viyole miktarı oluşturulmuş, biyofilm miktarı ile orantılıdır.
A. 2. konfokal lazer tarama mikroskobu baumannii S1 Biyofilm
- A. 5 ml'lik bir kültür büyütün 16 saat süre ile bir çalkalama inkübatöründe (220 rpm) 30 ° C'de LB baumannii S1.
- ReklamA. sadece kültür istenen OD 0.8 600 baumannii S1. 35 mm bir cam tabanlı μ-çanağı kullanılarak, bakteri kültürünün aşılanması: saflaştırılmıştır GKL enzim (40 mg / ml) 30 ul ihtiva eden taze LB (1 100 seyreltme); Yeni kültürün nihai hacmi 1 ml olmuştur.
- Kapaklı μ-Dish Kapak ve mühürlü 10 litrelik plastik kaba koyun. Ortamı yavaşça çıkarmadan önce 3 saat süre ile 30 ° C 'de μ-Bulaşık inkübe edin. 1 ml 'lik bir toplam hacme getiren saflaştırılmıştır GKL enzim ve taze ortam 30 ul ekle. 30 ° C'de bir 21 saat daha inkübe edilir.
- Adımı yineleyin 2.3 ve 30 ° C sıcaklıkta bir 24 saat μ-Dish kuluçkaya yatmaktadır. Sonra, yavaşça ortamı çıkarın.
- Μ-çanağı Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde eritildi 5 ug / ml Alex Fluo 488-konjuge Buğday tohumu aglutinini (WGA) 500 ul ilave edin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin; Bu oluşan biyofilm leke olacaktır. T boyama çözüm çıkarın ve yıkayınO u-Dish HBSS 2 ml. Yıkama adımı bir kez daha tekrarlayın.
- % 3.7 formaldehit HBSS içinde çözüldü ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe 500 ul ilave et; Bu μ-Dish üzerine biyofilm çözecektir. HBSS 2 ml ile bir kez μ-bulaşık yıkama ve daha sonra tamamen uzaklaştırın. Μ-Bulaşık biyofilm sabit önceden CLSM görüntüleme 4 ° C de karanlıkta tutulmuşlardır edilebilir.
- CLSM görüntüleme ve analiz için yığının başına 0.21 mikron arayla görüntü başına 97 yığınlarının oluşturmak için 63 kat büyütme kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Doğal tipte GKL ve geliştirilmiş GKL çift mutant (E101G / R230C) kristal viyole niceleme deneyde, iki çekirdek giderici enzimler biyofilm oluşumunu kesintiye uygulanabilirliğini göstermek için kullanılmıştır. Her iki enzim karşı lactonase etkinliğini göstermek için gösterilmiştir 3-hidroksi-dekanoyil-L-homoserin lakton (3-OH-Cı 10 -HSL), A. kullandığı başlıca çekirdek molekülün baumannii S1 14. Biyofilm bozulma geçerli bir değerlendirme için, (daha önce AHL ligandları tecrit olmayan gösterilmiştir) kendi katalitik aktif enzimler aynı zamanda anında kontroller (GKL D266N mutant ve GKL E101G / R230C / D266N mutant) olarak alındı. Yabani tip A kullanılmasının yanı sıra baumannii S1, bir mutan Δ Abai suşu (AHL sentaz eksikliği) biyofilm oluşturma yeteneği de test edilmiştir. Çekirdek giderici enzimler, doğal tipte GKL ve GKL E101G / R230C mutant Hem anlamlı öncesi biyofilm oluşumunu azaltmak mümküntedavi A. baumannii S1 kültürleri (n = 10; 0.0001 ≤ p-değeri) (Şekil 1). Bununla birlikte, her iki enzim için biyofilm bozulma derecesi 3-OH-Cı 10 -HSL karşı etkinlikleri orantılı değildir. GKL E101G / R230C mutant devir hızı (k kedi) 3-OH-C 10 -HSL 14 karşı yabani tip GKL altı kat daha hızlıdır. Ancak, enzimler arasındaki biyofilm bozulması ölçüde farklılık sadece iki yönlüdür.
Şekil 1. A. baumannii biyofilm bozulması deneyi. biyofilm oluşturma kristal mor boyama ile ölçülmüştür. Kırmızı sütunlar vahşi tip A. tarafından oluşturulan biyofilm miktarını temsil çekirdek giderici lactonases ilavesi olmadan baumannii ve Δ Abai mutantı. Mavi sütunlar amo temsilvahşi tip A. tarafından oluşturulan biyofilm unt inaktif GKL D266N mutantın doğal tip GKL inaktif GKL E101G / R230C / D266N mutantı ve GKL E101G / R230C mutant: Dört farklı GKL enzimlerin varlığında baumannii. **** P- ≤ 0.0001 değeri. Antimikrobiyal Ajanlar ve Kemoterapi 58 izni ile çoğaltılmıştır, 1802-1805 (2014). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
A. Konfokal görüntüleme baumannii S1 biyofilm oluşumu bu sesil alanların yapısal morfolojisi, çekirdek-söndürme etkileri nitel ve nicel ölçü sağlamak için kullanıldı. Geliştirilmiş GKL E101G / R230C mutant ve zeolitler katalitik açıdan inaktif enzim karşılaştırma için kullanıldı. Diferansiyel görüntü kontrastı (DIC) görüntüsü (geliştirilmiş GKL E101G / R230C mutant ile tedavi, biyofilm boyutunda bir azalmaya neden olduğunu gösterdi Figüre 2). Floresans görüntüleri analiz da geliştirilmiş GKL E101G / R230C mutant (Tablo 1) ile tedavi edildiğinde yüzey alanı, biyokütle ve biyofilm ortalama kalınlıkta azalma olduğunu göstermiştir.
A. Şekil 2. Temsilcisi konfokal lazer tarama mikroskobu görüntüleri baumannii biyofilm. A. baumannii biyofilm etkin GKL E101G / R230C / D266N mutant (A) ve GKL E101G / R230C mutant (B) ile muamele edilmiş ve Alexa ile boyandı Fluor WGA 488-konjüge. Biyofilm (solda) ve biyofilm (sağda) floresan görüntüleri DIC görüntüleri temsilcisi xy (merkez), yz (sağda) ve xz (alt) bölümler için gösterilmiştir. Antimikrobiyal Ajanlar ve Kemoterapi <izniyle yayınlanmıştırstrong> 58, 1802-1805 (2014). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| SD a ± Değeri | |||
| Karakteristik | Hiçbir tedavi | Inaktif mutant ile tedavi | E101G / R230C mutant ile tedavi |
| Biyokütle (um 3 / mikron 2) | 2.57 ± 1.65 | 3.39 ± 1.33 | 1.37 ** 0.20 ± |
| Ort kalınlığı (um) | 3.68 ± 2.51 | 3.41 ± 1.31 | 1.21 ** 0.21 ± |
| Yüzey alanı (um) | 235,920.59 ± 79,456.46 | 209,872.6 ± 115,094.7 | 115,354.9 * ± 7,630.3 |
| Bir n = 10 resim yığınları. ** P ≤ 0,001; *, P ≤ 0,05 inaktif E101G / R230C / D266N mutant ile muamele ile karşılaştırıldığında. | |||
Tablo 1. A. baumannii biyofilm yapısal kantitasyon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deney iki seti olarak, A. baumannii S1 bakteriler 15 tarafından oluşturulan biyofilm miktarını azaltabilir yüksek tuz konsantrasyonu olarak NaCl'siz LB ortamında kültive edilmiştir. Bu tür eserin varlığı oluşturduğu biyofilm miktarını, hem de farklı tedavi koşulları arasında nisabı-söndürme enzimlerin etkisini hafife olabilir. Katalitik inaktif enzim kullanımı enzim sekestrasyonun olası etkilerini ortadan kaldırmak için bir negatif kontrol olarak önemlidir. Inaktif enzimler, çekirdek molekülleri ayırmak bile Şekil 1'de görüldüğü gibi, biyofilm oluşumu kesintiye değildir.
A. baumannii S1 96 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu içinde hava ve sıvı arayüzü arasında hassas bir halka benzeri biyofilm yapısı oluşturur. Dolayısıyla, bakteri biyofilmlerin tesadüfi kaldırılmasını önlemek için medya çıkarma ve yıkama adımları sırasında aşırı ajitasyon önlemek için çok önemlidir. LB ortamı, her bir inkübasyondan sonra çıkarıldıplanktonik hücreler ortadan kaldırır. Buna ek olarak, 96 kuyucuklu plak hava akımı meydana gelen pertübasyonları en aza indirmek ve biyofilm oluşumunu destekleyen bir mikro anaerobik ortam oluşturmak için bir 10 litrelik plastik kap içine yerleştirilmiştir. Bir 96-yuvalı plaka içinde Biyofilm kantitatif da her oyuğa ilave kristal viyole miktarına bağlıdır. Aşırı kristal viyole kuyuya ilave edilmesi halinde, yıkama adımları sayısı arttırılabilir. Kristal viyole boyama deneme biyofilm bozulmasına nisabı-söndürme verimliliği göreceli bir karşılaştırma sağlar. Kristal viyolet biyofilm oluşumunu ölçmek için niceliksel olmasına rağmen, sadece çekirdek giderici enzimlerin katalitik etkinlik açısından yarı kantitatif. Doğru istatistiksel karşılaştırma için yeterli örneklem büyüklükleri farklı tedavi grupları için önemlidir. Uç da sonuçların hatalı biçimde önlemek için kaldırılmalıdır.
Konfokal görüntüleme ve bakteriyel biyofilm analizi usef olannisap-söndürme enzimlerin nitel etkilerinin değerlendirilmesi için ul aracı. Kullanıcı (aktif veya inaktif) uygulanan nisap-söndürme enziminin Çeşidi farkında Ancak, analiz için biyofilmi seçme süreci önyargı için potansiyel bir kanal olabilir. Önyargı olasılığını önlemek için, deney kullanıcıdan enzim bilgileri hariç veya seçim için rasgele bir yaklaşım kullanmak üzere tasarlanmış olabilir. Tarafsız bir seçim stratejisi de CLSM tarafından biyofilm morfolojileri iyi niceliksel karşılaştırılmasına olanak sağlamaktadır. Bununla birlikte, bu bakteriyel biyofilmlerin ilgili çekirdek giderici enzimlerin sonucunu değerlendirmek için bir yöntem tarif ilk çalışmadır. Kristal viyole boyama biyofilm bozulmasına nisabı-söndürme enzimlerin programı gösterdi ve enzimin modi operandorum hücre sayıları ve virulans faktörü ekspresyonunu azaltarak sınırlı olmadığını ortaya çıkarmıştır. Bu arada, CLSM analizi ile belirlenen morfolojik değişiklikler de mümkündür Moleküller içgörüler sağlayabilirBu enzimlerin ar hedefler. Geçerli deney bakteriyel biyofilm üzerindeki enzimler ön etkilerini araştırmak amacıyla tasarlanmış olmasına rağmen, protokol bakteriyel büyüme sonrasında enzimi ekleyerek önceden oluşturulmuş biyofilm üzerinde enzimin etkisini değerlendirmek için veya serum kullanımı yoluyla fizyolojik koşullar altında yetkinliğini incelemek için modifiye edilebilir kültürü için benzeri koşullar. GKL enzimleri incelemek için kullanılan protokol biyofilm bozulması onların ilişkiyi araştırmak için başka nisap giderici enzimler ve patojenlere uzatılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast Extract | BD | 212750 | |
| 96-well plate | Costar | 3596 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| Acetic Acid | Lab-Scan | PLA00654X | Caution: Flammable |
| μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Alex Fluo 488-conjugated WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 141475095 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Caution: Corrosive |
| Synergy HT Microplate Reader | BioTek | ||
| 1X-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus |
References
- Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era? Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).
- Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. The biology and future prospects of antivirulence therapies. Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).
- LaSarre, B., Federle, M. J. Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).
- Waters, C. M., Bassler, B. L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature reviews. Drug discovery. 9, 117-128 (2010).
- Lazar, V. Quorum sensing in biofilms--how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power? Anaerobe. 17, 280-285 (2011).
- Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Perez, F., et al. Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3471-3484 (2007).
- Tay, S. B., Yew, W. S. Development of quorum-based anti-virulence therapeutics targeting Gram-negative bacterial pathogens. International journal of molecular sciences. 14, 16570-16599 (2013).
- Igarashi, J., Suga, H. Ch. 19. Quorum Sensing. Rumbaugh, K. P. 692, Methods in Molecular Biology. Humana Press. 265-274 (2011).
- Ng, F. S., Wright, D. M., Seah, S. Y. Characterization of a phosphotriesterase-like lactonase from Sulfolobus solfataricus and its immobilization for disruption of quorum sensing. Applied and environmental microbiology. 77, 1181-1186 (2011).
- Stacy, D. M., Welsh, M. A., Rather, P. N., Blackwell, H. E. Attenuation of quorum sensing in the pathogen Acinetobacter baumannii using non-native N-Acyl homoserine lactones. ACS chemical biology. 7, 1719-1728 (2012).
- Chow, J. Y., et al. Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily. The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).
- Chow, J. Y., Yang, Y., Tay, S. B., Chua, K. L., Yew, W. S. Disruption of biofilm formation by the human pathogen Acinetobacter baumannii using engineered quorum-quenching lactonases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 1802-1805 (2014).
- Pour, N. K., et al. Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters. FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).
